Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالدعم المقدم من الدكتور لافازييه راموس-اسبسيتو في مركز روكفلر للموارد العالية الانتاجيه والطيفية.

يتم جمع السائل المنوي من الفئران الذكور CD-1 البالغة من العمر 8-16 في الأسبوع. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لطب وآيل كورنيل (IACUC).
1. يوم قبل الفحص
<ol><li>
اعداد خرطوشه الاستشعار ومحلل تدفق خارج الخلية معايره
	<ol>
<li>لت?...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

وقد كشف فقدان القدرة المنوية للمني في غياب بعض الركائز الايضيه أو الانزيمات الايضيه الحرجة عن استقلاب الطاقة كعامل رئيسي يدعم الإخصاب الناجح. التبديل الأيضي اثناء تنشيط الخلية هو مفهوم راسخ في أنواع الخلايا الأخرى ، ومع ذلك ، نحن مجرد بداية لفهم كيف السائل المنوي تكييف الأيض لزيادة الطلب...

وقد أحدث تطبيق الطيف الكتلي ثوره في دراسة الأيض. التنميط الأيضي المستهدف وتتبع الأيض يسمح برصد دقيق للتغيرات في استقلاب الطاقة. ومع ذلك ، يتطلب أداء الأيض بنجاح التدريب المكثف ، والموظفين ذوي الخبرة ، وباهظه الثمن ، والأطياف الشاملة عاليه الحساسية ليست متاحه بسهوله لكل مختبر. في السنوات الاخيره ، باستخدام محلل تدفق خارج الخلية ، مثل فرس الحصان XFe96 نمت شعبيه كوسيلة بديله لقياس التغيرات في استقلاب الطاقة في مختلف أنواع الخلايا1،2،3،4،5.
السائل المنوي هي خلايا متحرك المتخصصة للغاية. مهمتها هي تسليم الجينوم الأبوي إلى البويضة. العنبر ترك الجهاز التناسلي الذكور بعد القذف لا تزال غير ناضجه وظيفيا ولا يمكن تخصيب البويضة لأنهم غير قادرين علي اختراق الخلايا الدهنية ' الأثواب. المني اكتساب كفاءه الإخصاب لأنها العبور من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه النضج المعروفة باسم السعه6,7. يمكن ان يكون السائل المنوي القذف الطازج أو السائل المنوي الذي يتم تشريحه من البربخ في المختبر عن طريق الحضانة في وسائل الاعلام المحددة التي تحتوي علي Ca2 +، بيكربونات (hco3-) أو التناظرية الخلية-المخيم نفاذيه (علي سبيل المثال ، dibutyryl-مخيم) ، متقبل الكولسترول (مثل الزلال مصل البقر ، جيش صرب البوسنيين) ، ومصدر للطاقة (علي سبيل المثال ، الجلوكوز). اثناء التاهيل ، وتعديل السائل المنوي نمط الحركة في فوز الصواري غير المتناظرة ، والتي تمثل وضع السباحة يسمي فرط التنشيط8،9، وانها تصبح المختصة للخضوع لرد فعل اكروبعض7، حيث يتم الإفراج عن الانزيمات البروتينية التي هضم البويضات ' vestments. هذه العمليات تتطلب الطاقة ، ومماثله للخلايا الجسدية ، والسائل المنوي توليد ATP وغيرها من مركبات الطاقة العالية عن طريق تحلل الخلايا ، فضلا عن دوره المركبات الفوسفاتية المتقدريه والاكسده فوسفولات (oxphos)10. في حين تبين دراسات متعددة ان تحلل الجلوكوز ضروري وكافي لدعم السائل المنوي السعه11,12,13,14, مساهمه oxphos اقل وضوحا. وخلافا لأنواع الخلايا الأخرى حيث يتم اقتران تحلل الجلوكوز جسديا بدوره الهيئة ، فان السائل المنوي مجزا إلى حد كبير ويعتقد انه يحافظ علي هذه العمليات في مقصورات الصواري المنفصلة: ويركز الجزء الأوسط علي آلاتالميتوكوندريا ، فيحين ان الانزيمات الرئيسية لتحلل الجلوكوز تبدومقيده. نتائج هذا التقسيم في نقاش مستمر حول ما إذا كان بيروفات المنتجة في القطعة الرئيسية من غليكولسيس يمكن ان تدعم oxphos الميتوكوندريا في midpiece ، وما إذا كان ATP التي تنتجها oxphos في midpiece تكون قادره علي نشر بسرعة كافيه علي طول السارية لدعم متطلبات الطاقة في الأجزاء البعيدة من القطعة الرئيسية17،18 وهناك أيضا دعم لدور اوكسنفوس في السائل المنوي. ليس فقط هو oxphos أكثر نشاطا مواتيه من تحلل, توليد 16 مرات أكثر ATP من تحلل, ولكن حجم midpiece ومحتوي الميتوكوندريا ترتبط مباشره مع اللياقة الانجابيه في الأنواع الثدييات التي تظهر درجات أكبر من المنافسة بين الذكور لأصحاب20. معالجه هذه الاسئله يتطلب أساليب لدراسة المساهمات النسبية لتحلل الجلوكوز والاكسده اثناء السائل المنوي.
تورمنت وآخرون تطبيق محلل تدفق خارج الخلية 24 جيدا لمقارنه الأيض الطاقة من الأنواع الماوس ذات الصلة بشكل وثيق مع مختلفه بشكل ملحوظ معلمات أداء العنبر21. بدلا من الإبلاغ عن قيم ECAR و OCR القاعدية للنطفة غير القادرة ، هنا ، فاننا نكيف طريقتهم باستخدام محلل تدفق خارج الخلية 96 لمراقبه التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي في الوقت الحقيقي. قمنا بتطوير طريقه تسمح في الوقت نفسه رصد تحلل الجلوكوز و oxphos في الزمن الحقيقي في السائل المنوي مع الضرب الصواري في ما يصل إلى اثني عشر ظروف التجريبية المختلفة عن طريق قياس تدفق الأكسجين (O2) والبروتونات (H +) (الشكل 1a). نظرا لانهيار بيروفات إلى اللاكتات اثناء تحلل الجلوكوز وإنتاج CO 2 عن طريق الدورةالثانية والعشرين ، وعدم السعه والسعه المنوية البثقh + في وسائل الفحص التي يتم الكشف عنها من قبل محلل تدفق خارج الخلية عن طريقh +-الحساسة فلوبوريس إلى طرف التحقيق من خرطوشه الاستشعار. وفي موازاة ذلك ، يتم الكشف عن الاستهلاك O2 بواسطة فوسفولات الاكسده عن طريق o2-الحساسة الفلوروهورس التي تم تعبئتها لنفس التحقيق غيض (الشكل 1b). الكشف الفعال عنH + والمستهلكة س2 يتطلب المخزن المؤقت السائل المنوي المعدل مع انخفاض القدرة التخزين المؤقت دون بيكربونات أو الفينول الأحمر. التالي ، للحث علي السعه في غياب بيكربونات ، اعتمدنا استخدام التناظرية الخلية-نفاذيه مخيم حقن مع المثبط PDE واسعه النطاق IBMX22. ثلاثه منافذ حقن مستقله اضافيه تسمح بحقن المنشطات الدوائية و/أو مثبطات, مما يسهل الكشف في الوقت الحقيقي من التغيرات في التنفس الخلوي ومعدل تحلل الجلوكوز بسبب التلاعب التجريبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

وتكتسب النطاف في الثدييات قدره علي الإخصاب في الجهاز التناسلي الأنثوي في عمليه تعرف بالسعة الاستيعابية. تتطلب العمليات المرتبطة بالسعة الطاقة. لا يزال هناك نقاش مستمر حول المصادر التي تولد ATP التي تغذي النطاف الحركية التقدمية ، والسعه ، وفرط النشاط ، والتفاعل الزائد. هنا ، ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية كاداه لتحليل التغيرات في استقلاب الطاقة خلال الماوس السائل المنوي. باستخدام الفلور الحساسةH +و O2، يسمح هذا الأسلوب بمراقبه تحلل الجلوكوز والاكسده المؤكسدة في الوقت الحقيقي في غير السعه مقابل السائل المنوي. استخدام هذا الفحص في وجود ركائز الطاقة المختلفة و/أو المنشطات الدوائية و/أو مثبطات يمكن ان توفر رؤى هامه في مساهمه المسارات الايضيه المختلفة والتقاطع بين الإشارات التعاقبية والأيض اثناء السائل المنوي.

يستخدم هذا الأسلوب محلل تدفق خارج الخلية لمراقبه التغيرات في الوقت الحقيقي في معدل تحلل الجلوكوز و oxphos اثناء الماوس المنوية. ويبين الشكل 4 تجربه مثاليه حيث تم تمكين السائل المنوي في وجود الجلوكوز كركيزة الطاقة الوحيدة و 2-DG و انتيمايسين و والروتينون كما ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

ونحن وصف تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لرصد التغيرات في الوقت الحقيقي في تحلل الجلوكوز والمؤكسدة اثناء الماوس السائل المنوي.

باستخدام محلل الجريان خارج الخلية لقياس التغيرات في تحلل الجلوكوز والاكسده اثناء الماوس العنبر التقوية

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطبيق محلل تدفق خارج الخلية لمراقبة التغيرات في استقلاب الطاقة أثناء سعة الحيوانات المنوية. لقد قمنا بتطوير هذا البروتوكول لمقارنة التغيرات في تحلل الجلوكوز والفوسفور التأسد في الوقت الحقيقي بين الحيوانات المنوية الماوس غير القدرات والقدرات. في اليوم السابق للمقايسة، قم بإزالة خرطوشة المستشعر من مجموعة فحص خارج الخلية ووضع الكارتريدج رأسًا على عقب بجوار لوحة الأدوات المساعدة.ملء خزان حل مع 25 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة وإضافة 200 ميكرولترات من الماء إلى كل بئر من لوحة فائدة، ثم وضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى في لوحة فائدة. ضع الطبق في حاضنة لثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، aliquot 25 ملليلتر من محللات تدفق خارج الخلية calibrant في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ووضع الأنبوب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية.لإعداد لوحات دقيقة مغلفة ConA ، حل 2.5 ملليغرام من كونا في خمسة ملليلتر من الماء المقطر المزدوج واستخدام ماصة متعددة القنوات لملء كل بئر من محلل تدفق خارج الخلية 96-well plate مع 50 ميكرولترات من حل ConA ، ثم اترك الغطاء مفتوحًا للسماح للصفيح بالجفاف بين عشية وضحاها. لإعداد العازلة الحيوانات المنوية، سخني 250 ملليلتر من محلل تدفق خارج الخلية TYH العازلة إلى 37 درجة مئوية وضبط درجة الحرارة إلى 7.4. في يوم الفحص، استبدل الماء في كل بئر من ألواح المرافق بـ 200 ميكرولتر من xF calibrant لكل بئر ووضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة على الأقل.لإنشاء قالب موجة، قم بتشغيل محلل تدفق خارج الخلية. في حين أن درجة الحرارة تستقر إلى 37 درجة مئوية ، افتح برنامج الموجة وافتح قالبًا فارغًا. تحت علامة التبويب تعريفات المجموعة، تعريف الوسيطة المقايسة مثل TYH ونوع الخلية كالحيوانات المنوية الماوس، وترك استراتيجيات الحقن و ما قبل المعالجة فارغة.إنشاء مجموعات مختلفة لكل شرط فحص وفتح خريطة لوحة لتعيين كل مجموعة لآبار محددة. تحت علامة التبويب بروتوكول، unhighlight الإزدلال، إضافة كل من أربع دورات قياس مختلفة، حدد المنفذ المعني، وتحرير تفاصيل القياس بحيث يتم تمييز قياس بعد الحقن، ثم حفظ قالب الفحص، وملء ملخص المشروع وحفظ النتائج. قبل حصاد الحيوانات المنوية، قبل 50 ملليلتر من عازلة TYH في 37 درجة مئوية.بعد حصاد الاكواس من الفئران الذكور البالغين، ضع كل كودا في 500 ميكرولترات من عازل TYH الدافئ مسبقًا في آبار فردية من طبق 24 بئرًا. استخدام ملقط لشل كل كودا بشكل فردي في الجزء السفلي من كل بئر وجعل بسرعة خمسة إلى سبعة شقوق صغيرة في كل نسيج باستخدام مقص الريش. عندما تم قطع جميع الكوداس ، ضع على الفور اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير للسماح للحيوانات المنوية بالتفرق لمدة 15 دقيقة.لتحميل خرطوشة المستشعر، قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر ومحاذاة حرف دليل تحميل المنفذ مع الزاوية اليسرى العليا من الكارتريدج. عقد دليل تحميل الميناء في مكان، إدراج نصائح ماصة عموديا في الثقوب دليل تحميل الميناء من ميناء A وحقن 20 ميكرولترات من العازلة TYH في كل عمود. بالنسبة للميناء B، حقن 22 ميكرولترتر من العازل TYH في أعمدة واحد من خلال أربعة، 22 ميكرولترات من 500 ملليمولار 2-deoxyglucose في أعمدة من خمسة إلى ثمانية، و 25 ميكرولترات من خمسة مضادات ميكرومولار A rotenone في أعمدة من تسعة إلى 12.لميناء C، حقن 25 ميكرولترات من العازلة TYH في كل عمود مع أرقام فردية و 25 ميكرولترات من 10 ملليمولار من ثنائي بوتيل دوري AMP 500 IBMX ميكرومولور في كل عمود مع أرقام حتى، ثم ضع خرطوشة الاستشعار مع لوحة المعايرة في محلل تدفق خارج الخلية والبدء في الفحص. ستستغرق المعايرة من 10 إلى 15 دقيقة. لإعداد لوحات الحيوانات المنوية، إضافة ثلاثة ملليلتر من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر البوم الدم البقري في TYH العازلة إلى كل من ثلاثة خمسة أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر.بعد ذلك، تجمع بئرين من الحيوانات المنوية في كل من ثلاثة أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد العد، وتمييع الحيوانات المنوية إلى مرتين 10 إلى سبعة الحيوانات المنوية في المليلتر تركيز لكل عينة في TYH الطازجة تستكمل مع الألبومين مصل البقر. رواسب الحيوانات المنوية عن طريق الطرد المركزي و resuspend الكريات الحيوانات المنوية في ملليلتر واحد من العازلة TYH.الطرد المركزي الحيوانات المنوية مرة أخرى وإزالة superants مع الحرص على عدم إزعاج الكريات. نقل كل تعليق الحيوانات المنوية في واحدة من خمسة أجهزة الطرد المركزي المليتر أعدت أنابيب وإضافة 180 ميكرولترات من العازلة TYH في كل ركن من البئر من لوحة مغلفة ConA. إضافة 180 ميكرولترات من الحيوانات المنوية في كل بئر فارغة من لوحة المغلفة كونا والطرد المركزي لوحة مرتين تناوب لوحة 180 درجة بين الطرد المركزي، ثم وضع لوحة المعايرة مع لوحة الحيوانات المنوية ومواصلة الفحص.في هذه التجربة التمثيلية، تم تهيّم الحيوانات المنوية في وجود الجلوكوز باعتباره الركيزة الوحيدة للطاقة و2-ديوكسيغلوكوز والأتنيميين والروتينون كمعودات دوائية. يشير السهم إلى الحث على السعة. في وجود الجلوكوز ، ورافق القدرات من قبل زيادة سبعة أضعاف في معدل التحمض خارج الخلية التي يتم تثبيطها عن طريق منع تحلل الجلسان مع 2-deoxyglucose.أظهرت الحيوانات المنوية ذات القدرات زيادة 20 ضعفًا في معدل استهلاك الأكسجين مقارنة بالحيوانات المنوية غير ذات القدرات مما يدل على أن الحيوانات المنوية الماوس تعزز كل من تحلل الجلوكوز والفوسفور التأكسي لدعم الطلب المتزايد على الطاقة أثناء القدرة. لا يتأثر ارتفاع معدل التحمض خارج الخلية أثناء سعة الحيوانات المنوية بمثبطات الفسفور المؤسدة أنتيميسين A والروتينون مما يشير إلى أن التغيير في هذا المعدل مدفوع بشكل رئيسي بإطلاق الهيدروجين من تحلل الجلوكوز. ومع ذلك، يتم حظر الزيادة في معدل استهلاك الأكسجين بواسطة أنتيوميسين A و rotenone وكذلك من قبل 2-deoxyglucose تكشف عن أن الزيادة في OXPHOS أثناء قدرة الحيوانات المنوية تعتمد على النشاط الجليكية.يمكن أن يختلف مصدر الطاقة و المنشطات الصيدلانية والمثبطات اعتمادا على هدف التجربة ويمكن قياس ما يصل إلى 12 حالة مختلفة بالتوازي. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع الأنواع الأخرى مثل الإنسان أو البقر حيث تكون التغيرات في استقلاب الطاقة أثناء السعة غامضة على قدم المساواة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

دراسة ديناميات التصاق الخلوي وانتشار الخلايا الظهاريه علي الفيبرونكتين اثناء الاكسده

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: طريقة فلورسنت سريعة وغير متحيزة للكشف عن التغيرات في كثافة المشبك

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...