Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller High gennemløb og spectroscopy Resource Center.

Sperm er indsamlet fra 8-16-ugers gamle CD-1 mandlige mus. Dyreforsøg blev godkendt af Weill Cornell Medicine Institutionsudvalg for dyrepasning og-brug (IACUC).
1. dagen før assay
<ol><li>
Klargøring af sensor patron og ekstracellulær flux analysator kalibrant
	<ol>
<li>For at Hydrere sensor patronen skal du fjerne sensor patronen fra XFe96 ekstracellulær flux-Analysesættet og anbringe sensor patronen på hovedet ved siden af brugs pladen.</li>
		<li>Fyld et opløsnin...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Tabet af sædcapacitation i fravær af visse metaboliske substrater eller kritiske metaboliske enzymer afslørede energimetabolisme som en nøglefaktor, der støtter vellykket befrugtning. En metabolisk switch under celle aktivering er et veletableret koncept i andre celletyper, men vi er lige begyndt at forstå, hvordan sædceller tilpasser deres metabolisme til den stigende energiefterspørgsel under capacitation. Ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, vi udviklet et let anvendeligt værktøj til at overvåg...

Anvendelsen af massespektrometri har revolutioneret studiet af metabolisme. Målrettet metabolisk profilering og metabolomic Tracing muliggør præcis overvågning af ændringer i energimetabolisme. Men at udføre metabolomics med succes kræver omfattende uddannelse, erfarne medarbejdere, og dyre, meget følsomme massespektrometre ikke let tilgængelige for alle laboratorier. I de seneste år, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, såsom Seahorse XFe96 er vokset populære som en surrogat metode til måling af ændringer i energimetabolisme i forskellige celletyper1,2,3,4,5.
Sperm er højt specialiserede motile sædceller celler; hvis opgave er at levere det faderlige genom til oocyte. Sperm forlader den mandlige reproduktive tarmkanalen efter ejakulation er stadig funktionelt umodne og kan ikke befrugte oocyt fordi de ikke er i stand til at trænge ind oocytterne ' vestments. Sperm erhverve befrugtning kompetence, som de passerer gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en modningsproces kendt som kursuskapacitering6,7. Nyejakuleret sperm eller sperm, der dissekeres fra cauda epididymis, kan kondenseret in vitro ved inkubation i definerede kursuskapacitering-medier indeholdende ca2 +, bicarbonat (HCO3-) eller en celle gennemtrængelig lejr analog (f. eks. dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (f. eks. bovin serumalbumin, BSA) og en energikilde (f. eks. glucose). Under capacitation, sædceller ændre deres motilitet mønster i en asymmetrisk flagellar beat, der repræsenterer en svømning tilstand kaldet resulterende8,9, og de bliver kompetente til at gennemgå den acrosome reaktion7, hvor Proteolytiske enzymer frigives, at fordøje oocytter ' vestments. Disse processer kræver energi, og ligner somatiske celler, sperm generere ATP og andre høje energiforbindelser via glycolyse samt mitokondrie TCA cyklus og oxidativ fosforylering (oxphos)10. Mens flere undersøgelser viser, at glycolyse er nødvendig og tilstrækkelig til at understøtte sperm kursuskapacitering11,12,13,14, er bidraget fra oxphos mindre klart. I modsætning til andre celletyper, hvor glycolyse er fysisk koblet til TCA-cyklussen, er sperm stærkt opdelte og menes at vedligeholde disse processer i separate flagellar rum: Mellemstykket koncentrerer mitokondrie maskiner, mens de vigtigste enzymer af glykolyse synes at være begrænset til det vigtigste stykke15,16. Denne opdeling resulterer i en løbende debat om, hvorvidt pyruvat fremstillet i hovedstykket af glycolyse kan understøtte mitokondrie oxphos i midterstykket, og om ATP produceret af oxphos i midterstykket ville være i stand til at diffus tilstrækkeligt hurtigt langs længden af flagel til at understøtte energibehovet i distale dele af hovedstykket17,18,19. Der er også støtte til en rolle for oxphos i sperm capacitation. Ikke alene er oxphos mere energetisk gunstig end glycolyse, genererer 16 gange mere ATP end glycolyse, men mellemstykke volumen og mitokondriel indhold er direkte korreleret med reproduktiv egnethed i pattedyrarter, som udviser større grader af konkurrence mellem mænd for hjælpere20. Behandling af disse spørgsmål kræver metoder til at undersøge de relative bidrag af glycolyse og oxphos under sædcapacitation.
Tourmente et al. anvendte en 24-brønd ekstracellulær flux analysator til at sammenligne energimetabolisme af nært beslægtede mus arter med signifikant forskellige sædkvalitet parametre21. I stedet for at rapportere basal ECAR og OCR værdier af ikke-kondenseret sperm, her, vi tilpasser deres metode ved hjælp af en 96-godt ekstracellulær flux analysator til at overvåge ændringer i energimetabolisme under musen sperm kursuskapacitering i realtid. Vi udviklede en metode, der muliggør samtidig overvågning af glycolyse og oxphos i realtid i sædceller med slå flageller i op til tolv forskellige eksperimentelle betingelser ved at måle flux af ilt (O2) og protoner (H+) (figur 1a). På grund af nedbrydningen af pyruvat til laktat under glykolyse og produktion af CO2 via TCA-cyklus, ikke-kondenseret og kondenseret sperm Extrude h+ ind i analyse mediet, som detekteres af den ekstracellulære flux analysator via H+-følsomme fluorophorer immobiliseret til probespidsen af en sensor patron. Parallelt hermed detekteres O2 forbrug ved oxidativ fosforylering via o2-følsomme fluorophorer immobiliseret til samme sonde spids (figur 1b). Effektiv påvisning af den frigivne H+ og forbrugt O2 kræver en modificeret sperm buffer med lav bufferkapacitet uden bicarbonat eller phenol rød. Således, at inducere kursuskapacitering i fravær af bicarbonat, vi vedtog brugen af en celle gennemtrængelig lejr analog injiceres sammen med bredspektret PDE inhibitor ibmx22. Tre yderligere uafhængige Indsprøjtnings porte tillader injektion af farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere, hvilket letter realtids påvisning af ændringer i cellulær respiration og glykolyse hastighed på grund af eksperimentel manipulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Mammalian sperm erhverve befrugtning kapacitet i den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en proces, kendt som capacitation. Capacitation-relaterede processer kræver energi. Der er fortsat en løbende debat om de kilder, der genererer ATP, som brændstoffer sperm progressiv motilitet, capacitation, hyperaktivering, og acrosome reaktion. Her beskriver vi anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator som et værktøj til at analysere ændringer i energimetabolisme under mus sperm capacitation. Ved hjælp af H+-og O2-følsomme fluorophorer, denne metode gør det muligt at overvåge glycolyse og oxidativ fosforylering i realtid i ikke-kondenseret versus kapaciterende sædceller. Ved hjælp af denne analyse i tilstedeværelse af forskellige energi substrater og/eller farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere kan give vigtig indsigt i bidraget fra forskellige metaboliske veje og skæringspunktet mellem signalering kaskader og metabolisme under sperm capacitation.

Denne metode bruger en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i satsen for glycolyse og oxphos under mus sperm capacitation. Figur 4 viser et eksemplarisk eksperiment, hvor sperm blev kondenseret i tilstedeværelse af glucose som det eneste energi substrat og 2-DG og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Energi substratet i den ekstracellulære flux analysator TYH buffer og de farmakologiske modulatorer kan frit v...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Vi beskriver anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering under mus sperm capacitation.

Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Denne protokol kan bruges til at anvende en ekstracellulær flux analysator til at overvåge ændringer i energimetabolisme under sperm kapacitans. Vi udviklede denne protokol for at sammenligne ændringer i glykolyse og oxidativ fosforylering i realtid mellem ikke-kapaciteret og kapaciteret museceller. Dagen før analysen skal du fjerne sensorpatronen fra et ekstracellulært fluxanalysesæt og placere patronen på hovedet ved siden af bryggerpladen.Fyld en opløsning reservoir med 25 milliliter dobbelt destilleret vand og tilsæt 200 mikroliter vand til hver brønd af utility plade, derefter placere sensoren patron tilbage i utility plade. Placer pladen i en 37 grader Celsius ikke-kuldioxid inkubator. Dernæst aliquot 25 milliliter ekstracellulære flux analysator kalibrant i en 50 milliliter konisk rør og placere røret i 37 grader Celsius ikke-kuldioxid inkubator.For at forberede ConA belagte mikroplader opløses 2,5 milligram ConA i fem milliliter dobbeltdestilleret vand og brug en multikanalpipette til at fylde hver brønd af en ekstracellulær fluxanalysator 96-brøndplade med 50 mikroliter af ConA-opløsningen, og lad derefter låget stå åbent for at lade pladen tørre natten over. For at forberede sædbufferen opvarmes 250 milliliter ekstracellulær fluxanalysator TYH buffer til 37 grader Celsius og justere pH-zonen til 7,4. På analysedagen skal du udskifte vandet i hver brønd på brugspladen med 200 mikroliter XF calibrant pr. brønd og placere pladen tilbage i den ikke-kuldioxidinkubøse i mindst en time.Hvis du vil generere en bølgeskabelon, skal du aktivere den ekstracellulære fluxanalysator. Mens temperaturen er ved at stabilisere sig til 37 grader Celsius, åbne bølge software og åbne en tom skabelon. Under fanen gruppedefinitioner skal analysemediet defineres som TYH og celletypen som musesæd, så injektionsstrategierne og forbehandlingerne efterlades tomme.Opret forskellige grupper for hver analysetilstand, og åbn pladekortet for at tildele hver gruppe til bestemte brønde. Under protokolfanen skal du fremhæve jævnpunktsudligning af lys, tilføje hver af fire forskellige målecyklusser, vælge den respektive port og redigere måledetaljerne, så målingen efter injektion er fremhævet, derefter gemme analyseskabelonen, udfylde projektoversigten og gemme resultaterne. Før høst af sædceller, prewarm 50 milliliter TYH buffer ved 37 grader Celsius.Efter høst caudas fra voksne mandlige mus, placere hver cauda i 500 mikroliter af den forvarmte TYH buffer i individuelle brønde af en 24-brønd plade. Brug snævler til at immobilisere hver cauda individuelt i bunden af hver brønd og hurtigt gøre fem til syv små snit i hvert væv ved hjælp af fjer saks. Når alle caudaerne er blevet skåret ind, skal pladen straks anbringes i den ikke-kuldioxidinkubator, så sæden kan spredes i 15 minutter.Hvis du vil ilægge sensorpatronen, skal du fjerne låget fra sensorpatronen og justere bogstavet i den pågældende portindlæsningsvejledning med patronens øverste venstre hjørne. Hold portbelastningsvejledningen på plads, sæt pipettenslyfferne lodret ind i portbelastningsstyrehullerne i port A, og indsprøjt 20 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne. For port B injiceres 22 mikroliter TYH-buffer i kolonnerne en til fire, 22 mikroliter på 500 millimolar 2-deoxyglucose i kolonner fem til otte og 25 mikroliter af fem mikromolarantimycin En rotenon i søjle ni til 12.I port C skal der injiceres 25 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne med ulige tal og 25 mikroliter på 10 millimolar dibutyrylcyklisk AMP 500 mikromolar IBMX i hver kolonne med lige tal, og anbring derefter sensorpatronen med en kalibreringsplade i den ekstracellulære fluxanalysator og start analysen. Kalibreringen tager 10 til 15 minutter. For at forberede sædpladerne tilsættes tre milliliter på tre milligram pr. milliliter kvægserumalbumin i TYH-buffer til hver af de fem fem millilitercentrifugerør.Dernæst pool to brønde af sæd i hver af tre 1,5 milliliter centrifuge rør. Efter optælling fortyndes sæden til to gange 10 til koncentrationen af syv sædceller pr. milliliter pr. prøve i frisk TYH suppleret med kvægserumalbumin. Sediment sædcellerne ved centrifugering og resuspenderede sædpiller i en milliliter TYH buffer.Centrifuge sæden igen og fjerne supernatanter passe på ikke at forstyrre pellets. Hver sædsuspension overføres til et af de forberedte fem millilitercentrifugerør, og der tilsættes 180 mikroliter TYH-buffer i hver hjørnebly af en ConA-belagt plade. Der tilsættes 180 mikroliter sæd i hver tom brønd på ConA-belagt plade, og pladen centrifugeres to gange og roterer pladen 180 grader mellem centrifugeringer, og anbring derefter kalibreringspladen med sædpladen, og fortsæt analysen.I dette repræsentative eksperiment blev sædceller kapaciteret ved tilstedeværelse af glukose som det eneste energiunderlag og 2-deoxyglucose og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Pilen angiver induktion af kapacitans. Ved tilstedeværelse af glukose blev kapacitans ledsaget af en syvdobling af den ekstracellulære forsuringshastighed, som hæmmes ved at blokere glykolyse med 2-deoxyglucose.Kapaciteret sædceller viste en 20-dobling af iltforbruget sammenlignet med ikke-kapaciteret sædceller, der viser, at musecellerne øger både glykolyse og oxidativ fosforylering for at understøtte den stigende energiefterspørgsel under kapacitansation. Stigningen i den ekstracellulære forsuringshastighed under sperm kapacitansation påvirkes ikke af de oxidative fosforyleringshæmmere antimycin A og rotenone, hvilket indikerer, at ændringen i denne hastighed hovedsagelig er drevet af hydrogenudsætning fra glykolyse. Stigningen i iltforbruget er imidlertid blokeret af antimycin A og rotenon samt af 2-deoxyglucose, der afslører, at stigningen i OXPHOS under sperm kapacitans er afhængig af glykolytisk aktivitet.Energikilden og de farmakologiske aktivatorer og inhibitorer kan varieres afhængigt af forsøgets mål, og op til 12 forskellige betingelser kan måles parallelt. Protokollen kan let tilpasses andre arter som mennesker eller kvæg, hvor ændringerne i energimetabolismen under kapacitans er lige så gådefulde.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Meget følsomme og Rapid Fluorescens Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En hurtig, upartisk fluorescerende metode til at detektere ændringer i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Et optimeret enkeltmolekyle pull-down assay til kvantificering af proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseudtømning som et indirekte mål for glukoseoptagelse i celler og væv Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...