Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

De auteurs willen de steun van Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu op het Rockefeller High throughput en spectroscopy Resource Center bevestigen.

Sperma worden verzameld van 8-16-week-oude CD-1 mannelijke muizen. Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Weill Cornell Medicine (IACUC).
1. dag voorafgaand aan de test
<ol><li>
Voorbereiding van de sensor cartridge en de extracellulaire flux Analyzer kalibrant
	<ol>
<li>Om de sensor cartridge te hydrateren, verwijdert u de sensor cartridge uit de XFe96 extracellulaire flux assay kit en plaatst u de sensor cartridge onderste...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Het verlies van sperma capaciteit in de afwezigheid van bepaalde metabole substraten of kritische metabole enzymen onthulde energiemetabolisme als een belangrijke factor die succesvolle bevruchting ondersteunt. Een metabole schakelaar tijdens de activering van de cel is een gevestigde concept in andere celtypen, echter, we zijn net beginnen te begrijpen hoe sperma hun metabolisme aan te passen aan de toenemende energievraag tijdens de capacitatie. Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer ontwikkelden we een eenvo...

De toepassing van massaspectrometrie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van het metabolisme. Gerichte metabole profilering en metabolomic tracing zorgen voor nauwkeurige monitoring van veranderingen in het energiemetabolisme. Echter, het uitvoeren van metabolomica met succes vereist uitgebreide training, ervaren personeel, en dure, zeer gevoelige massaspectrometers niet gemakkelijk beschikbaar voor elk laboratorium. In de afgelopen jaren is het gebruik van een extracellulaire flux analysator, zoals de Seahorse XFe96, populair geworden als een surrogaat methode voor het meten van veranderingen in het energiemetabolisme in verschillende celtypen1,2,3,4,5.
Sperma zijn zeer gespecialiseerde beweeglijke cellen; waarvan de taak is om het vaderlijke genoom aan de eicel te leveren. Sperma dat het mannelijke voortplantingsstelsel na de ejaculatie verlaat, is nog steeds functioneel onrijp en kan de eicel niet bevruchten omdat ze niet in staat zijn om de vestments van de eicellen te penetreren. Sperma verwerven bemesting competentie als ze doorgeven door het vrouwelijke voortplantingskanaal in een rijpingsproces bekend als capacitatie6,7. Vers ejaculeerd sperma of sperma uit de Cauda epididymis kan in vitro worden bekwaam door incubatie in gedefinieerde capacitatiemedia met CA2 +, bicarbonaat (HCO3-) of een cel-permeabel kamp analoog (bijv. dibutyryl-Camp), een cholesterol acceptor (bv. Runderalbumine, BSA) en een energiebron (bijv. glucose). Tijdens de capaciteits wijziging wijzigt het sperma hun motiliteits patroon in een asymmetrische flagellar-beat, die een zwemmodus met de naam Hyper activatie8,9vertegenwoordigt, en ze worden bekwaam om de acrosome-reactie7te ondergaan, waar Proteolytische enzymen vrijkomen die de vesteringen van de eicellen verteren. Deze processen vereisen energie, en vergelijkbaar met somatische cellen, sperma genereren ATP en andere hoge energieverbindingen via glycolyse, alsmede mitochondriale TCA-cyclus en oxidatieve fosforylering (oxphos)10. Terwijl meerdere studies aantonen dat glycolyse noodzakelijk en voldoende is voor de ondersteuning van sperma capaciteit11,12,13,14, is de bijdrage van oxphos minder duidelijk. In tegenstelling tot andere celtypen waar glycolyse fysiek gekoppeld is aan de TCA-cyclus, worden sperma sterk gecompartialiseerd en wordt gedacht dat het deze processen in aparte flagellar-compartimenten handhaaft: het middenstuk concentreert de mitochondriale machines, terwijl de belangrijkste enzymen van glycolyse lijken te worden beperkt tot het hoofdstuk15,16. Deze compartimenging leidt tot een voortdurende discussie over de vraag of pyruvaat geproduceerd in het hoofdstuk door glycolyse mitochondriale oxphos in het middenstuk kan ondersteunen, en of ATP geproduceerd door oxphos in het middenstuk zou kunnen diffuus voldoende snel over de lengte van het flagellum ter ondersteuning van de energie-eisen in distale delen van het hoofdstuk17,18,19. Er is ook ondersteuning van een rol voor oxphos in sperma-capacitatie. Niet alleen is oxphos meer energetisch gunstiger dan glycolyse, het genereren van 16 keer meer ATP dan glycolyse, maar het middenstuk volume en de mitochondriale inhoud zijn direct gecorreleerd met reproductieve fitness in zoogdieren soorten die grotere mate van competitie tussen mannen voor mates20vertonen. Het aanpakken van deze vragen vereist methoden voor het onderzoeken van de relatieve bijdragen van glycolyse en oxphos tijdens de capaciteitstoewijzing van sperma.
Tourmente et al. paste een 24-Well extracellulaire flux Analyzer aan om het energiemetabolisme van nauw verwante muis soorten te vergelijken met significant verschillende sperma prestatieparameters21. In plaats van het rapporteren van de basale ECAR en OCR waarden van niet-bekwame sperma, hier, we passen hun methode met behulp van een 96-well extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de muis sperma capaciteit in real-time te bewaken. We ontwikkelden een methode die gelijktijdige controle van glycolyse en oxphos in real-time in sperma mogelijk maakt met het verslaan van flagella in maximaal twaalf verschillende experimentele omstandigheden door het meten van de flux van zuurstof (O2) en protonen (H+) (Figuur 1a). Als gevolg van de afbraak van pyruvaat tot lactaat tijdens de glycolyse en de productie van co2 via de TCA-cyclus, niet-bekwaam en bekwaam sperma extruderen H+ in de assay media die worden gedetecteerd door de extracellulaire flux Analyzer via H+-gevoelige fluor Foren geïmmobiliseerd tot de sondepunt van een sensor cartridge. Parallel, O2 verbruik door oxidatieve fosforylering wordt gedetecteerd via O2-gevoelige fluoroforen geïmmobiliseerd tot dezelfde sonde tip (Figuur 1b). Effectieve detectie van de vrijgegeven H+ en verbruikt O2 vereist een gemodificeerde sperma buffer met lage buffercapaciteit zonder bicarbonaat of fenolrood. Dus, om te induceren van de capaciteit in de afwezigheid van bicarbonaat, we adopteren het gebruik van een cel-permeabel kamp analoog geïnjecteerd samen met de breed-Range PDE inhibitor IBMX22. Drie extra onafhankelijke injectie poorten maken de injectie mogelijk van farmacologische activatoren en/of remmers, die real-time detectie van veranderingen in cellulaire ademhaling en glycolyse snelheid vergemakkelijkt als gevolg van experimentele manipulatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Sperma van zoogdieren verkrijgt bevruchting in het vrouwelijke voortplantingsstelsel in een proces dat bekend staat als capaciteitsopbouw. Capacitatie-geassocieerde processen vereisen energie. Er blijft een voortdurende discussie over de bronnen genereren van de ATP die brandstoffen sperma progressieve beweeglijkheid, capacitatie, hyperactivation, en acrosome reactie. Hier beschrijven we de toepassing van een extracellulaire flux-analysator als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme te analyseren tijdens het gebruik van muis sperma capaciteit. Met behulp van H+-en O2-gevoelige fluoroforen, maakt deze methode het mogelijk om de glycolyse en oxidatieve fosforylering in real-time te monitoren in niet-bekwame versus capaciteit van sperma. Het gebruik van deze test in de aanwezigheid van verschillende energie substraten en/of farmacologische activatoren en/of remmers kan belangrijke inzichten geven in de bijdrage van verschillende metabole trajecten en het snijpunt tussen signalering van Cascades en metabolisme tijdens het gebruik van sperma.

Deze methode maakt gebruik van een extracellulaire flux Analyzer om real-time veranderingen in de snelheid van glycolyse en oxphos te monitoren tijdens het gebruik van muizen sperma. Figuur 4 toont een voorbeeldig experiment waarbij sperma was bekwaam in de aanwezigheid van glucose als het enige energie substraat en 2-DG en antimycine en rotenon als farmacologische modulatoren. Het energie substraat in de extracellulaire flux Analyzer TYH buffer en de farmaco...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

We beschrijven de toepassing van een extracellulaire flux-Analyzer om real-time veranderingen in de glycolyse en oxidatieve fosforylering tijdens het gebruik van muis sperma te bewaken.

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Dit protocol kan worden gebruikt om een extracellulaire flux analyzer toe te passen om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens spermacapacitatie te controleren. We ontwikkelden dit protocol om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylatie in real time te vergelijken tussen niet-capacitated en capacitated muissperma. Verwijder op de dag voor de test de sensorcartridge uit een extracellulaire fluxtestkit en plaats de cartridge ondersteboven naast de hulpplaat.Vul een oplossingsreservoir met 25 milliliter dubbel gedestilleerd water en voeg 200 microliter water toe aan elke put van de nutsplaat en plaats de sensorcartridge terug in de nutsplaat. Plaats de plaat in een 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator. Vervolgens aliquot 25 milliliter extracellulaire flux analyzer calibrant in een 50 milliliter conische buis en plaats de buis in de 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator.Om ConA gecoate microplaten voor te bereiden, los 2,5 milligram ConA op in vijf milliliter dubbel gedestilleerd water en gebruik een multichannel pipet om elke put van een extracellulaire flux analyzer 96-well plaat met 50 microliters van de ConA-oplossing te vullen en laat vervolgens het open deksel om de plaat 's nachts te laten drogen. Om de spermabuffer voor te bereiden, verwarmt u 250 milliliter extracellulaire fluxanalyler TYH-buffer tot 37 graden Celsius en past u de pH aan op 7,4. Vervang op de dag van de test het water in elke put van de hulpplaat door 200 microliter XF-calibrant per put en plaats de plaat minstens een uur terug in de couveuse zonder kooldioxide.Als u een golfsjabloon wilt genereren, schakelt u de extracellulaire fluxanalyzer in. Terwijl de temperatuur stabiliseert tot 37 graden Celsius, open de golf software en open een lege sjabloon. Definieer onder het tabblad groepsdefinities het testmedium als TYH en het celtype als muissperma, waardoor de injectiestrategieën en voorbehandelingen leeg zijn.Maak verschillende groepen voor elke testvoorwaarde en open de plaatkaart om elke groep toe te wijzen aan specifieke putten. Voeg onder het protocoltabblad het niveau niet in evenwicht, voeg elk van de vier verschillende meetcycli toe, selecteer de desbetreffende poort en bewerk de meetdetails zodat de meting wordt gemarkeerd, sla vervolgens de testsjabloon op, vul de projectsamenvatting in en sla de resultaten op. Voor het oogsten van het sperma, prewarme 50 milliliter TYH buffer op 37 graden Celsius.Na het oogsten van cauda's van volwassen mannelijke muizen, plaats elke cauda in 500 microliters van de voorverwarmde TYH buffer in individuele putten van een 24-put plaat. Gebruik tangen om elke cauda individueel immobiliseren aan de onderkant van elke put en snel vijf tot zeven kleine insnijdingen in elk weefsel met behulp van verenschaar. Wanneer alle cauda's zijn ingesneden, plaats de plaat onmiddellijk in de niet-koolstofdioxide incubator om het sperma te verspreiden gedurende 15 minuten.Als u de sensorcartridge wilt laden, verwijdert u het deksel van de sensorcartridge en lijnt u de letter van de desbetreffende poortbeladingshulplijn uit met de linkerbovenhoek van de cartridge. Houd de poortbeladingsgeleider op zijn plaats, plaats de pipettetips verticaal in de poortbelastinggeleidergaten van poort A en injecteer 20 microliters TYH-buffer in elke kolom. Voor poort B, injecteer 22 microliters van TYH buffer in kolommen een tot en met vier, 22 microliters van 500 millimolar 2-deoxyglucose in kolommen vijf tot en met acht, en 25 microliters van vijf micromolar antimycine A rotenone in kolommen negen tot en met 12.Voor poort C, injecteer 25 microliters van TYH buffer in elke kolom met oneven getallen en 25 microliter van 10 millimolar van dibutyryl-cyclische AMP 500 micromolar IBMX in elke kolom met even nummers, plaats dan de sensor cartridge met een kalibratie plaat in de extracellulaire fluxer en start de test. De kalibratie duurt 10 tot 15 minuten. Om de spermaplaten te bereiden, voeg drie milliliter van drie milligram per milliliter runderserum albumine in TYH buffer aan elk van drie vijf milliliter centrifuge buizen.Vervolgens, zwembad twee putten van sperma in elk van drie 1,5 milliliter centrifuge buizen. Verdun het sperma na het tellen twee keer tot een twee maal 10 tot de zeven zaadcellen per milliliterconcentratie per monster in verse TYH, aangevuld met runderserumalbumine. Sediment het sperma door centrifugatie en resuspend de spermakorrels in een milliliter TYH buffer.Centrifuge het sperma weer en verwijder de supernatants die ervoor zorgen niet om de pellets te verstoren. Breng elke spermasuspensie over in een van de bereide vijf milliliter centrifugebuizen en voeg 180 microliter TYH-buffer toe in elke hoekput van een ConA gecoate plaat. Voeg 180 microliter sperma toe in elke lege put van de ConA gecoate plaat en centrifugeer de plaat twee keer draaiend de plaat 180 graden tussen centrifugations, plaats dan de kalibratieplaat met de spermaplaat en zet de test voort.In dit representatieve experiment werd sperma in aanwezigheid van glucose als enige energiesubstraat en 2-deoxyglucose en antimycine en rotenone als farmacologische modulatoren gecapituleerd. De pijl geeft inductie van condensatie aan. In aanwezigheid van glucose ging de capaciteit gepaard met een zevenvoudige toename van de extracellulaire verzuring, die wordt geremd door het blokkeren van glycolyse met 2-deoxyglucose.Capacitated sperma toonde een 20-voudige toename van het zuurstofverbruik in vergelijking met niet-capacitated sperma waaruit blijkt dat de muis sperma verbeteren zowel glycolyse en oxidatieve fosforylatie ter ondersteuning van de toenemende vraag naar energie tijdens de capaciteit tijdens de capaciteit. De stijging van de extracellulaire verzuring tijdens de capacitatie van het sperma wordt niet beïnvloed door de oxidatieve fosforylatieremmers antimycine A en rotenone die aangeeft dat de verandering in dit tarief voornamelijk wordt veroorzaakt door waterstofafgifte van glycolyse. De toename van het zuurstofverbruik wordt echter geblokkeerd door antimycine A en rotenone en door 2-deoxyglucose waaruit blijkt dat de toename van OXPHOS tijdens spermacapacitatie afhankelijk is van glycolytische activiteit.De energiebron en farmacologische activators en remmers kunnen worden gevarieerd afhankelijk van het doel van het experiment en tot 12 verschillende omstandigheden kunnen parallel worden gemeten. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten zoals mens of rund, waar de veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de capaciteit even raadselachtig zijn.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...