Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
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Die Autoren möchten die Unterstützung von Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu am Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center würdigen.

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.
1. Tag vor dem Assay
<ol><li>
Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
	<ol>
<li>Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Verso...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbare...

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5populär geworden.
Spermien sind hochspezialisierte motile Zellen; deren Aufgabe es ist, das väterliche Genom an die Oozyte zu liefern. Sperma verlassen den männlichen Fortpflanzungstrakt nach der Ejakulation sind noch funktionell unreif und können die Eizelle nicht befruchten, weil sie nicht in der Lage sind, die Gewänder der Eizellen zu durchdringen. Spermien erwerben Befruchtungskompetenz, wenn sie durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Reifungsprozess, bekannt als Capacitation6,7,transportiert werden. Frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, können in vitro durch Inkubation in definierten Kapazitationsmedien, die Ca2+, Bicarbonat (HCO3-) oder einen zelldurchlässigen cAMP analog (z. B. Dibutyryl-cAMP), ein Cholesterin-Akzeptor (z. B. Rinderserumalbumin, BSA) und eine Energiequelle (z. B. Glukose). Während der Kapitulation modifizieren Spermien ihr Motilitätsmuster in einen asymmetrischen Flagellar-Beat, der einen Schwimmmodus namens Hyperaktivierung8,9darstellt, und sie werden kompetent, um die Akrosomenreaktion7zu durchlaufen, wo proteolytische Enzyme freigesetzt werden, die die Gewänder der Eizellen verdauen. Diese Prozesse erfordern Energie, und ähnlich wie somatische Zellen, Spermien erzeugen ATP und andere hochenergetische Verbindungen über Glykolyse sowie mitochondrialen TCA-Zyklus und oxidative Phosphorylierung (Oxphos)10. Während mehrere Studien zeigen, dass Glykolyse notwendig und ausreichend ist, um die Spermien-Kapazität11,12,13,14zu unterstützen, ist der Beitrag von Oxphos weniger klar. Im Gegensatz zu anderen Zelltypen, bei denen die Glykolyse physikalisch an den TCA-Zyklus gekoppelt ist, sind Spermien stark kompartimisiert und sollen diese Prozesse in separaten Flagellarkomden aufrechterhalten: Das Mittelstück konzentriert die mitochondriale Maschinerie, während die Schlüsselenzyme der Glykolyse auf das Hauptstück15,16beschränkt zu sein scheinen. Diese Abschottung führt zu einer anhaltenden Debatte darüber, ob Pyruvat, das im Hauptstück durch Glykolyse produziert wird, mitochondriale Oxphos im Mittelstück unterstützen kann und ob ATP, die von Oxophs im Mittelstück produziert wird, in der Lage wäre, ausreichend schnell entlang der Länge des Flagellums zu diffundieren, um den Energiebedarf in distalen Teilen des Hauptteils17,18,19zu unterstützen. Es gibt auch Unterstützung einer Rolle für Oxphos in Spermien-Capacitation. Oxphos ist nicht nur energetisch günstiger als Glykolyse, erzeugt 16-mal mehr ATP als Glykolyse, sondern Mittelstückvolumen und mitochondrialer Gehalt sind direkt mit der Reproduktivfitness bei Säugetierarten korreliert, die einen größeren Grad des Wettbewerbs zwischen Männchen fürKumpels zeigen 20. Um diese Fragen zu beantworten, sind Methoden zur Untersuchung der relativen Beiträge von Glykolyse und Oxphos während der Spermien-Kapazität erforderlich.
Tourmente et al. wandten einen 24-Well extrazellulären Flussanalysator an, um den Energiestoffwechsel eng verwandter Mausarten mit signifikant unterschiedlichen Spermienleistungsparametern zu vergleichen21. Anstatt die basalen ECAR- und OCR-Werte von nicht kapazitierten Spermien zu melden, passen wir hier ihre Methode mit einem 96-Well extrazellulären Flussanalysator an, um Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Flüchtigkeit der Maus in Echtzeit zu überwachen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Glykolyse und Oxphos in Echtzeit in Spermien mit schlagenden Flagella in bis zu zwölf verschiedenen Versuchsbedingungen zu überwachen, indem der Fluss von Sauerstoff(O2) und Protonen (H+) gemessen wird (Abbildung 1A). Durch den Abbau von Pyruvat zu Laktat während der Glykolyse und die Produktion vonCO2 über den TCA-Zyklus extrudieren nicht-kapazitierte und kapazitierte Spermien H+ in die Assaymedien, die vom extrazellulären Flussanalysator über H+-empfindliche Fluorophore zur Sondenspitze einer Sensorpatrone immobilisiert werden. Parallel dazu wird derO2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung überO2-empfindlicheFluorophore immobilisiert, die zur gleichen Sondenspitze immobilisiert sind (Abbildung 1B). Der effektive Nachweis des freigesetzten H+ und verbrauchten O2 erfordert einen modifizierten Spermienpuffer mit geringer Pufferkapazität ohne Bicarbonat oder Phenolrot. Um also in Abwesenheit von Bicarbonat eine Kapacitation zu induzieren, haben wir die Verwendung eines zelldurchlässigen cAMP-Analogos übernommen, das zusammen mit dem Breitbereichs-PDE-Hemmer IBMX22injiziert wurde. Drei zusätzliche unabhängige Injektionsöffnungen ermöglichen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren, was die Echtzeitdetektion von Veränderungen der zellulären Atmung und Glykolyserate aufgrund experimenteller Manipulation enciert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H+- undO2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pha...

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Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um einen extrazellulären Flussanalysator anzuwenden, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Spermienkapitulation zu überwachen. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit zwischen nicht-kapazitierten und kapazitierten Maussperma zu vergleichen. Entfernen Sie am Tag vor dem Test die Sensorpatrone aus einem extrazellulären Flussmittel-Assay-Kit und stellen Sie die Patrone auf den Kopf neben die Gebrauchsplatte.Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und fügen Sie 200 Mikroliter Wasser in jeden Brunnen der Versorgungsplatte ein, und legen Sie die Sensorpatrone dann wieder in die Versorgungsplatte. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Als nächstes werden 25 Milliliter extrazellulärer Flussanalysator in ein 50-Milliliter-Konusrohr eingegliedert und in den 37 Grad Celsius-Nicht-Kohlendioxid-Inkubator 37 Grad Celsius eingelassen.Um ConA-beschichtete Mikroplatten vorzubereiten, lösen Sie 2,5 Milligramm ConA in fünf Milliliter doppeldestilliertem Wasser auf und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jeden Brunnen eines extrazellulären Flussanalysators 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern der ConA-Lösung zu füllen, und lassen Sie dann den Deckel offen, um die Platte über Nacht trocknen zu lassen. Um den Spermienpuffer vorzubereiten, erhitzen Sie 250 Milliliter extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer auf 37 Grad Celsius und stellen Sie den pH auf 7,4. Ersetzen Sie am Tag des Assays das Wasser in jedem Brunnen der Nutzplatte durch 200 Mikroliter XF-Kalibrant pro Brunnen und legen Sie die Platte für mindestens eine Stunde wieder in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator.Um eine Wellenvorlage zu generieren, aktivieren Sie den extrazellulären Flussanalysator. Während sich die Temperatur auf 37 Grad Celsius stabilisiert, öffnen Sie die Wellensoftware und öffnen Sie eine leere Vorlage. Definieren Sie unter der Registerkarte Gruppendefinitionen das Assaymedium als TYH und den Zelltyp als Maussperma, sodass die Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer bleiben.Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung, und öffnen Sie die Plattenkarte, um jede Gruppe bestimmten Brunnen zuzuweisen. Fügen Sie unter der Registerkarte Protokoll das Aussetzen von Hervorhebungsergebnissen auf, fügen Sie jeden der vier verschiedenen Messzyklen hinzu, wählen Sie den entsprechenden Port aus, und bearbeiten Sie die Messdetails, sodass die Messgröße nach der Injektion hervorgehoben wird, speichern Sie dann die Assay-Vorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus und speichern Sie die Ergebnisse. Vor der Ernte des Spermas, vorwärmen 50 Milliliter TYH Puffer bei 37 Grad Celsius.Nach der Ernte von Caudas von erwachsenen männlichen Mäusen, legen Sie jede Cauda in 500 Mikroliter des vorgewärmten TYH-Puffers in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Verwenden Sie Zangen, um jede Cauda einzeln an der Unterseite jedes Brunnens zu immobilisieren und schnell fünf bis sieben kleine Schnitte in jedem Gewebe mit einer Federschere zu machen. Wenn alle Caudas eingeschnitten sind, legen Sie die Platte sofort in den Nicht-Kohlendioxid-Inkubator, damit sich das Sperma 15 Minuten lang dispergieren kann.Um die Sensorpatrone zu laden, entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Halten Sie die Anschlussladeführung an Ort und Stelle, legen Sie die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher von Port A und injizieren Sie 20 Mikroliter TYH-Puffer in jede Säule. Für Port B 22 Mikroliter TYH-Puffer in die Spalten eins bis vier, 22 Mikroliter 500 Millimolar 2-Deoxyglucose in die Spalten fünf bis acht und 25 Mikroliter von fünf Mikromolar-Antimycin A-Roton in die Spalten neun bis zwölf.Für Port C 25 Mikroliter TYH-Puffer in jede Kolonne mit ungeraden Zahlen und 25 Mikroliter von 10 Millimolaren Dibutyryl-zyklischen AMP 500 Mikromolar IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen injizieren, dann legen Sie die Sensorpatrone mit einer Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 bis 15 Minuten. Um die Spermien zuzubereiten, fügen Sie drei Milliliter von drei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin im TYH-Puffer zu jedem von drei Fünf-Milliliter-Zentifugenröhren hinzu.Als nächstes bündeln Sie zwei Samenbrunnen in jeweils drei 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren. Nach dem Zählen, verdünnen Sie das Sperma auf ein zwei mal 10 zu den sieben Spermien pro Milliliter Konzentration pro Probe in frischem TYH mit RinderserumAlbumin ergänzt. Sedimentieren Sie das Sperma durch Zentrifugation und setzen Sie die Spermienpellets in einem Milliliter TYH-Puffer wieder auf.Zentrifugieren Sie das Sperma wieder und entfernen Sie die Überstande, die darauf achten, die Pellets nicht zu stören. Übertragen Sie jede Spermiensuspension in eine der vorbereiteten Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 180 Mikroliter TYH-Puffer in jede Eckbohrung einer ConA-beschichteten Platte ein. Fügen Sie 180 Mikroliter Sperma in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte und zentrifugieren Sie die Platte zweimal drehen die Platte 180 Grad zwischen zentrifugationen, dann legen Sie die Kalibrierplatte mit der Spermienplatte und den Test fortsetzen.In diesem repräsentativen Experiment wurden Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-Deoxyglucose und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert. Der Pfeil zeigt die Induktion der Kapitulation an. In Gegenwart von Glukose wurde die Kapitulation von einer siebenfachen Erhöhung der extrazellulären Versauerungsrate begleitet, die durch die Blockierung der Glykolyse mit 2-Deoxyglucose gehemmt wird.Kapazitierte Spermien zeigten eine 20-fache Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien, die zeigten, dass Maussperma sowohl die Glykolyse als auch die oxidative Phosphorylierung verbessern, um den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation zu unterstützen. Der Anstieg der extrazellulären Versauerungsrate während der Spermienkapitrezitation wird nicht durch die oxidativen Phosphorylierungsinhibitoren Antimycin A und Rotone beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Veränderung dieser Rate hauptsächlich durch die Wasserstofffreisetzung aus der Glykolyse angetrieben wird. Die Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate wird jedoch durch Antimycin A und Roton sowie durch 2-Deoxyglucose blockiert, was zeigt, dass die Zunahme von OXPHOS während der Spermien-Kapazität von der glykolytischen Aktivität abhängt.Die Energiequelle und die pharmakologischen Aktivatoren und Inhibitoren können je nach Ziel des Experiments variiert und bis zu 12 verschiedene Bedingungen parallel gemessen werden. Das Protokoll kann leicht an andere Arten wie Mensch oder Rind angepasst werden, wo die Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Kapatitierung ebenso rätselhaft sind.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Forschung

Biochemie

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

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Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

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Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...