Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
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著者らは、ロックフェラーハイスループットと分光リソースセンターのラヴォワジエ・ラモス・エスピリトゥ博士の支援を認めたい。

精子は8-16週齢のCD-1雄マウスから採取される。動物実験は、ワイル・コーネル医学の制度的動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認された。
1. アッセイの前日
<ol><li>
センサカートリッジおよび細胞外フラックスアナライザキャリブラントの調製
	<ol>
<li>センサーカートリッジを水和するには、XFe96細胞外フラックスアッセイキットからセンサーカートリッ?...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

特定の代謝基質または重要な代謝酵素がない場合の精子容量の喪失は、受精の成功を支える重要な要因としてエネルギー代謝を明らかにした。細胞活性化中の代謝スイッチは、他の細胞型では確立された概念ですが、精子が容量の増加するエネルギー需要にどのように代謝を適応させるかがわかり始めています。細胞外フラックス分析装置を用いて、精子の容量化中に糖質および酸化リン酸?...

質量分析法の応用は代謝の研究に革命をもたらした。標的代謝プロファイリングとメタボロミクストレースにより、エネルギー代謝の変化を正確にモニタリングできます。しかし、メタボロミクスを成功させるには、広範なトレーニング、経験豊富なスタッフ、および高価で機密性の高い質量分析計が必要です。近年、シーホースXFe96などの細胞外フラックス分析装置を用いて、種々の細胞型1、2、3、4、5のエネルギー代謝の変化を測定する代理法として普及している。
精子は高度に専門化された運動細胞です。その仕事は、卵母細胞に父性ゲノムを提供することです。射精後に男性の生殖管を離れる精子はまだ機能的に未熟であり、卵母細胞のベストを貫通できないため、卵母細胞を受精させることができない。精子は、容量6、7として知られている成熟プロセスで女性の生殖管を通過する時に受精能力を獲得する。カウダ精巣上体から解剖された新鮮に射精した精子または精子は、Ca2+、重炭酸塩(HCO3−)または細胞透過性cAMPアナログ(例えば、ジブチリルcAMP)、コレステロールアクセプター(例えば、ウシ血清アルブミン、BSA)、およびグルコース(例えば、ウシ血清アルブミン)を含む定義された容量媒体中のインキュベーションによってインビトロで容量化することができる。容量化の間、精子は運動パターンを非対称フラジェラ拍動に変え、過活性化8、9と呼ばれる水泳モードを表し、卵母細胞のベストを消化するタンパク質分解酵素が放出されるアクロソーム反応7を受ける能力を持つようになる。これらのプロセスは、エネルギーを必要とし、および体細胞と同様に、精子は、糖和を介してATPおよび他の高エネルギー化合物を生成するだけでなく、ミトコンドリアTCAサイクルおよび酸化リン酸化(oxphos)10を生成する。複数の研究は、糖質上昇が必要であり、精子の容量化を支するのに十分であることを示しているが、オックスフォスの寄与はあまり明らかではない。糖分解がTCAサイクルに物理的に結合されている他の細胞タイプとは対照的に、精子は非常に区画化され、これらのプロセスを別々の旗手コンパートメントに維持すると考えられている:ミッドピースはミトコンドリア機械を濃縮し、一方、糖分解の主要な酵素は主片15、16に制限されているように見える。この区画化は、グリコリシスによって主な部分で産生されるピルビン酸がミトコンドリアオックスホスを中間部分で支えることができるかどうか、そしてミッドピース中のオックスホスによって産生されるATPが、主片17、18、19の遠位部分のエネルギー要件をサポートするためにフラグラムの長さに沿って十分に迅速に拡散することができるかどうかについての議論を続ける。精子の容量におけるオックスホスの役割のサポートもあります。オックスホスは、糖酸化物よりも精力的に有利であるだけでなく、糖和よりも16倍多くのATPを生成するが、ミッドピース体積およびミトコンドリア含有量は、仲間20のための男性間のより大きな競争度を示す哺乳動物種における生殖適性と直接相関している。これらの質問に対処するには、精子の容量化中に糖質およびオックスホスの相対的な寄与を調べるための方法が必要です。
Tourmenteららは、24ウェル細胞外フラックス分析装置を適用し、有意に異なる精子性能パラメータ21と密接に関連するマウス種のエネルギー代謝を比較した。ここでは、非容量性精子の基底ECAR値とOCR値を報告する代わりに、96ウェルの細胞外フラックスアナライザを用いて、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化をリアルタイムでモニタリングする方法を適応させます。酸素のフラックス(O2)とプロトン(H+)を測定することにより、最大12の異なる実験条件でフラゲラを打つ精子で糖質およびオックスホスをリアルタイムでリアルタイムにモニタリングできる方法を開発しました(図1A)。糖分解中の乳酸へのピルビン酸の分解とTCAサイクルを介したCO2の産生により、非容量および容量化された精子は、H+-感受性フルオロフォアを介して細胞外フラックスアナライザによって検出されるアッセイ媒体にH+を押し出し、センサカートリッジのプローブ先端に固定化します。並行して、酸化リン酸化によるO2消費は、同じプローブ先端に固定化されたO2感受性フルオロフォアを介して検出される(図1B)。放出されたH+および消費されたO2の効果的な検出は、重炭酸塩またはフェノール赤色なしで低い緩衝能を有する修飾精子緩衝液を必要とする。従って、重炭酸塩の非存在下で容量を誘導するために、広範囲PDE阻害剤IBMX22と共に注入された細胞透過性cAMPアナログの使用を採用した。3つの追加の独立した注入ポートは、薬理活性剤および/または阻害剤の注入を可能にし、実験的操作による細胞呼吸および糖上昇率の変化のリアルタイム検出を容易にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

哺乳類の精子は、容量として知られているプロセスで女性の生殖管で受精能力を獲得します。容量関連プロセスにはエネルギーが必要です。精子の進行性運動性、容量、過活性化、およびアクロソーム反応を燃料とするATPを生成するソースに関する議論が続いています。ここでは、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化を解析するツールとしての細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。H+- および O2- 感受性蛍光体を使用して、この方法は、非容量化対容量性精子でリアルタイムでの糖和および酸化リン酸化を監視することを可能にします。異なるエネルギー基質および/または薬理活性剤および/または阻害剤の存在下でこのアッセイを使用すると、異なる代謝経路の寄与および精子の容量化中のシグナル伝達カスケードと代謝の交点に関する重要な洞察を提供することができる。

この方法では、細胞外フラックスアナライザを使用して、マウス精子の容量中の糖質およびオックスフォスの速度のリアルタイム変化を監視します。図4は、精子が唯一のエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量化し、薬理学的モジュレーターとして2-DGとアンチマイシンとロテノンを有する例示的な実験を示す。細胞外フラックス分析?...

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Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化のリアルタイム変化を監視する細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

このプロトコルは、精子の能力の中でエネルギー代謝の変化を監視するために細胞外フラックス分析装置を適用するために使用することができます。このプロトコルは、非容量化マウス精子とキャパシタントマウス精子の間で、解糖と酸化リン酸化の変化をリアルタイムで比較するプロトコルを開発しました。アッセイの前日に、センサーカートリッジを細胞外フラックスアッセイキットから取り出し、ユーティリティプレートの横にカートリッジを逆さまにします。25ミリリットルの二重蒸留水で溶液貯留槽を満たし、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルの水を加え、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。プレートを37°Cの非二酸化炭素インキュベーターに入れる。次に、アリコート25ミリリットルの細胞外フラックス分析装置キャリブラントを50ミリリットルの円錐管に入れ、37°Cの非二酸化炭素インキュベーターにチューブを入れる。ConAコーティングされたマイクロプレートを調製するには、2.5ミリグラムのConAを5ミリリットルの二重蒸留水に溶解し、マルチチャネルピペットを使用して、細胞外フラックスアナライザー96ウェルプレートの各ウェルをConA溶液の50マイクロリットルで満たし、蓋を開けてプレートを一晩乾燥させます。精子バッファーを準備するには、細胞外フラックス分析計TYHバッファーの 250 ミリリットルを摂氏 37 度に加熱し、pH を 7.4 に調整します。アッセイの日に、ユーティリティプレートの各ウェルの水をウェルあたり200マイクロリットルのXFキャリブラントに交換し、プレートを少なくとも1時間非二酸化炭素インキュベーターに戻します。ウェーブテンプレートを生成するには、細胞外フラックスアナライザをオンにします。温度が摂氏37度に安定している間、波のソフトウェアを開き、空白のテンプレートを開きます。グループ定義タブで、アッセイ媒体をTYHと定義し、細胞タイプをマウス精子として定義し、注射戦略と前処理は空白のままにします。アッセイ条件ごとに異なるグループを作成し、プレートマップを開いて各グループを特定のウェルに割り当てます。プロトコルタブで、平衡化を解除し、4つの異なる測定サイクルをそれぞれ追加し、それぞれのポートを選択して測定の詳細を編集して、射出後の測定が強調表示されるようにし、アッセイテンプレートを保存し、プロジェクトの概要を記入して結果を保存します。精子を収穫する前に、摂氏37度でTYHバッファーの50ミリリットルを前温くする。成体雄マウスからカウダを収穫した後、各カウダを24ウェルプレートの個々のウェルに事前に温めたTYHバッファーの500マイクロリットルに入れます。鉗子を使用して各コーダを各ウェルの底に個別に固定化し、羽のはさみを使用して各組織に5〜7回の小さな切開を素早く作ります。すべてのカウダが切開されたら、すぐにプレートを非二酸化炭素インキュベーターに入れ、精子が15分間分散できるようにします。センサーカートリッジをロードするには、センサーカートリッジから蓋を取り外し、それぞれのポートローディングガイドの文字をカートリッジの左上隅に合わせます。ポートローディングガイドを所定の位置に保持し、ピペットチップをポートAのポートローディングガイドホールに垂直に挿入し、20マイクロリットルのTYHバッファを各カラムに注入します。ポートBの場合、22マイクロリットルのTYHバッファーを列1から4に、22マイクロリットルの5〜8列に22マイクロリットルの5ミリモル2-デオキシグルコースを注入し、5マイクロモルアンチマイシンAロテノンの25マイクロリットルを9〜12の列に注入します。ポートCの場合、奇数と25マイクロリットルのジブトリリリ環式AMP 500マイクロモルIBMXを偶数数ですべてのカラムに25マイクロリットルの異数のタイフバッファを各カラムに注入し、キャリブレーションプレートを備えたセンサーカートリッジを細胞外フラックス分析装置に入れて測定を開始します。キャリブレーションには10~15分かかります。精子プレートを準備するには、TYHバッファーに1ミリリットルのウシ血清アルブミンあたり3ミリグラムの3ミリリットルを3つの5ミリリットル遠心分離管のそれぞれに加えます。次に、3つの1.5ミリリットル遠心分離管のそれぞれに精子の2つの井戸をプールします。カウント後、ウシ血清アルブミンを補充した新鮮なTYHで、サンプル当たりの1ミリリットル濃度当たりの精子を2倍10倍に希釈する。遠心分離によって精子を沈下し、TYHバッファーの1ミリリットルで精子ペレットを再中断する。再び精子を遠心分離し、ペレットを乱さないので注意して上清を取り除きます。各精子懸濁液を調製した5つのミリリットル遠心分離管の1つに移し、180マイクロリットルのTYHバッファーをConAコーティングされたプレートの各コーナーウェルに加えます。ConAコーティングされたプレートの各空き井戸に180マイクロリットルの精子を加え、遠心分離の間にプレートを180度回転させるプレートを遠心分離し、精子プレートでキャリブレーションプレートを配置し、アッセイを継続します。本代表的な実験では、精子を、薬理学的モジュレーターとして、エネルギー基質と2-デオキシグルコースと抗マイシンおよびロテノーンのみのエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量を調整した。矢印は、カパシフィテーションの誘導を示します。グルコースの存在下で、2-デオキシグルコースによる解糖を遮断することによって阻害される細胞外酸性化率の7倍の増加を伴う能力増強を伴った。容量化精子は、マウス精子が解糖と酸化リン酸化の両方を増強し、能力増強中のエネルギー需要の増加を支えることを実証する非キャパシタ化精子と比較して、酸素消費率の20倍の増加を実証した。精子の能力増強中の細胞外酸性化率の上昇は、この速度の変化が主に解糖からの水素放出によって駆動されることを示す酸化リン酸化阻害剤であるアンチマイシンAおよびロテノーネの影響を受けない。しかし、酸素消費率の増加は、抗マイシンAとロテノン、ならびに2-デオキシグルコースによってブロックされ、精子の能力増強中のOXPHOSの増加は解糖活性に依存することを明らかにする。エネルギー源および薬理活性剤および阻害剤は、実験の目的に応じて変化させることができ、最大12の異なる条件を並行して測定することができる。プロトコルは、カパチリエーション中のエネルギー代謝の変化が同様に謎めいた人間やウシのような他の種に簡単に適応することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...