Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
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저자는 록펠러 높은 처리량 및 분광학 자원 센터에서 박사 라보이시에 라모스 -Espiritu의 지원을 인정하고자합니다.

정자는 8-16주령의 CD-1 수컷 마우스로부터 수집된다. 동물 실험은 웨일 코넬 의학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 분석 전날
<ol><li>
센서 카트리지 및 세포외 플럭스 분석기 교정기 준비
	<ol>
<li>센서 카트리지에 수분을 공급하려면 XFe96 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

특정 신진 대사 기질 또는 중요한 신진 대사 효소의 부재에 있는 정액 capacitation의 손실은 성공적인 풍부하게 함을 지원하는 중요한 요인으로 에너지 물질 대사를 밝혔습니다. 세포 활성화 도중 신진 대사 스위치는 그밖 세포 모형에 있는 잘 확립된 개념입니다, 그러나, 우리는 정액이 capacitation 도중 증가하는 에너지 수요에 그들의 물질 대사를 적응하는 방법을 이해하기 시작했습니다. 세포외 플?...

질량 분석법의 적용은 신진 대사의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 표적 대사 프로파일링 및 대사체 추적을 통해 에너지 대사 의 변화를 정밀하게 모니터링할 수 있습니다. 그러나 대사체학을 성공적으로 수행하려면 광범위한 교육, 숙련된 직원, 고가의 고감도 질량 분석기가 모든 실험실에서 쉽게 구할 수 없습니다. 최근에는 해마 XFe96과 같은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 다양한 세포 유형1,2,3,4,5에서에너지 대사의 변화를 측정하는 대리 방법으로 인기를 끌고 있다.
정자는 고도로 전문화된 운동성 세포입니다; 그의 임무는 난모세포에 친자 게놈을 전달하는 것입니다. 사정 후 남성 생식 기관을 떠나는 정자는 여전히 기능적으로 미숙하며 난모세포의 조끼를 관통할 수 없기 때문에 난모세포를 비옥하게 할 수 없습니다. 정자는충혈6,7로알려진 성숙 과정에서 여성 생식기관을 통과하면서 수정 능력을 습득한다. 갓 사정된 정자 또는 고다 부고환에서 해부된 정자는Ca2+및 중탄산염(HCO3-)또는 세포 투과성 cAMP 아날로그(예를 들어, dibutyryl-cAMP), 콜레스테롤 수용자 (예를 들어, 소 혈청 알부민, BSA), 및 에너지 원 (예를 들어, 포도당). capacitation 도중, 정액은 과활성화8,9에게불린 수영 모드를 나타내는 비대칭 편모 박동으로 그들의 운동성 패턴을 수정하고, 그(것)들은 곡예 반응7을겪을 수 있는 유능한 되고, 여기서 proteolytic 효소는 oocytes의 조끼를 소화하는 풀어 놓입니다. 이러한 과정은 에너지를 필요로 하고, 체세포와 유사하게, 정자는 당해용해뿐만 아니라 미토콘드리아 TCA 주기 및 산화 인산화(oxphoylation)10을통해 ATP 및 기타 고에너지 화합물을 생성한다. 여러 연구는 당해가 정자 capacitation11,12,13,14를지원하기에 필요하고 충분하다는 것을 입증하는 동안, 옥스포스의 기여는 덜 분명하다. 글리콜리시스가 TCA 주기에 물리적으로 결합되는 다른 세포 유형과는 달리, 정자는 고도로 구획화되고 별도의 편모 구획에서 이러한 과정을 유지하는 것으로 생각됩니다: 미드피스는 미토콘드리아 기계를 농축하는 반면, 글리콜리시스의 주요 효소는 주요 조각15,16으로제한되는 것으로 보입니다. 이러한 구획화는 글리코분해에 의해 주체에서 생산된 피루브산이 미드피스에서 미토콘드리아 옥스포스를 지원할 수 있는지, 그리고 미드피스에서 옥스포스에 의해 생성된 ATP가 주체17,18, 19의원단 부분에서 에너지 요구 사항을 지원하기 위해 깃넬럼의 길이를 따라 충분히 빠르게 확산될 수 있는지에 대한 지속적인 논쟁을 낳는다. 또한 정자 capacitation에 oxphos에 대 한 역할의 지원이 있다. 옥스포스는 글리콜리시스보다 16배 더 많은 ATP를 생성할 뿐만 아니라, 중간 체량과 미토콘드리아 함량은 포유류 종의 생식 적합성과 직접적으로 상관관계가 있으며, 이는짝20의경우 남성간의 경쟁이 더 치열합니다. 이 질문을 해결하는 것은 정액 capacitation 도중 glycolysis와 oxphos의 상대적인 기여를 검토하기 위한 방법을 요구합니다.
Tourmente 등은 24웰 세포외 플럭스 분석기를 적용하여 현저히 다른 정자 성능파라미터(21)와밀접하게 관련된 마우스 종의 에너지 대사를 비교한다. 비 정전 용량 정자의 기저 ECAR 및 OCR 값을보고하는 대신, 여기에서, 우리는 실시간으로 마우스 정자 capacitation 동안 에너지 대사의 변화를 모니터링하기 위해 96 잘 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 자신의 방법을 적응. 산소(O2)와 양성자(H+)의 유속을 측정하여 최대 12개의 다른 실험 조건에서 기모를 이겨내며정자에서 글리코용해와 옥스포스를 실시간으로 모니터링할 수 있는 방법을 개발하였다(그림1A). Glycolysis 동안 젖산질화에 대한 피루브산염의 고장으로 인해 TCA 사이클을 통해CO2의 생산, 비-커패시테이트 및 정전 용량 정자 돌출 H+는 H+민감한 형광을 통해 세포 외 플럭스 분석기에 의해 검출되는 분석 매체내로 센서 카트리지의 프로브 팁에 고정된다. 병행하여, 산화인산화에 의한O2 소비는 동일한 프로브 팁에 고정화된O2-민감성형광체를 통해 검출된다(도1B). 방출된H+와 소비된O2의 효과적인 검출은 중탄산염 또는 페놀 적색 없이 낮은 완충 용량을 가진 수정된 정자 완충을 필요로 한다. 따라서, 중탄산염의 부재에서 의 한축을 유도하기 위해, 우리는 광범위 PDE 억제제 IBMX22와함께 주입된 세포 투과성 cAMP 아날로그의 사용을 채택했다. 3개의 추가 독립적인 주입 포트는 약리활성제 및/또는 억제제를 주입할 수 있게 해주며, 이를 통해 실험 조작으로 인한 세포 호흡 및 당해 비율의 변화를 실시간으로 감지할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

포유류 정자는 capacitation로 알려져 있는 프로세스에 있는 여성 생식 기관에 있는 풍부하게 함 용량을 취득합니다. 정전 관련 공정에는 에너지가 필요합니다. 정자 진보적 인 운동성 연료 ATP를 생성하는 소스에 대한 지속적인 논쟁이 남아있다, 용량, 과소 활성화, 및 곡예 반응. 여기에서, 우리는 마우스 정액 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 분석하는 공구로 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다. H+및O2- 민감한 형광을 사용하여, 이 방법은 비 커패시타이드 대 정전 용량 정자에서 실시간으로 글리코용및 산화 인산화를 모니터링할 수 있게 합니다. 다른 에너지 기판 및 /또는 약리 활성제 및 / 또는 억제제의 존재에서이 분석법을 사용하여 다른 대사 경로의 기여와 정자 capacitation 동안 신호 캐스케이드와 신진 대사 사이의 교차점에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

이 방법은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 당해 및 옥스포스 의 비율의 실시간 변화를 모니터링합니다. 도 4는 정자가 유일한 에너지 기판으로서 포도당의 존재에서 정전되었고 2-DG 및 항마이신 및 로테인을 약리학적 변조기로서 가꾸어낸 예시적인 실험을 나타낸다. 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 및 약리학적 변조기 내의 에?...

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Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

우리는 마우스 정자 capacitation 도중 당해 및 산화 인산화에 있는 실시간 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기의 응용을 기술합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

이 프로토콜은 정자 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 것을 이용될 수 있습니다. 우리는 비 커패시케이트와 커패시케이트 마우스 정자 사이 실시간으로 글리코리시스와 산화 인산화의 변화를 비교하기 위하여 이 프로토콜을 개발했습니다. 분석 전날, 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.25밀리리터의 이중 증류수로 용액 저장소를 채우고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 물을 추가한 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 다음으로, 외세포 플럭스 분석기의 25 밀리리터를 50밀리리터 원추형 튜브로 보정하고 튜브를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.ConA 코팅 마이크로 플레이트를 준비하려면 2.5 밀리그램의 ConA를 이중 증류수 5밀리리터에 녹이고 멀티채널 파이펫을 사용하여 ConA 용액의 50마이크로리터가 있는 세포외 플럭스 분석기 96웰 플레이트의 각 우물을 채운 다음 뚜껑을 열어 밤새 접시가 건조하게 합니다. 정자 버퍼를 준비하려면 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 250 밀리리터를 섭씨 37도로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다. 분석 당일, 유틸리티 플레이트의 각 우물의 물을 우물당 200 마이크로리터XF 교정기로 교체하고 플레이트를 비이산화탄소 인큐베이터에 1시간 이상 다시 배치한다.웨이브 템플릿을 생성하려면 세포외 플럭스 분석기를 켭니다. 온도가 섭씨 37도로 안정화되는 동안 웨이브 소프트웨어를 열고 빈 템플릿을 엽니다. 그룹 정의 탭에서, 분석 매체를 TYH및 세포 유형을 마우스 정자로 정의하여 주사 전략과 전처리를 비워 둡시킵니다.각 분석 조건에 대해 서로 다른 그룹을 만들고 플레이트 맵을 열어 각 그룹을 특정 우물에 할당합니다. 프로토콜 탭에서, 강조 표시 해제 평형, 네 가지 측정 주기의 각각을 추가, 각 포트를 선택하고 주사 후 측정이 강조되도록 측정 세부 사항을 편집, 다음 분석 템플릿을 저장, 프로젝트 요약을 작성하고 결과를 저장합니다. 정자를 수확하기 전에, 37 섭씨에서 TYH 버퍼의 50 밀리리터를 예동.성인 수컷 마우스로부터 코다를 수확한 후, 각 카우다를 24웰 플레이트의 개별 우물에 미리 데운 TYH 버퍼500 마이크로리터에 놓습니다. 각 우물의 바닥에 개별적으로 각 카우다를 고정하고 신속하게 깃털 가위를 사용하여 각 조직에 5 ~ 7 개의 작은 절개를 만들기 위해 집게를 사용합니다. 모든 소다절이 되면 즉시 플레이트를 비 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 정자가 15 분 동안 분산되도록하십시오.센서 카트리지를 로드하려면 센서 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 각 포트 로딩 가이드의 문자를 카트리지의 왼쪽 상단 모서리에 정렬합니다. 포트 로딩 가이드를 제자리에 놓고 파이펫 팁을 포트 A의 포트 로딩 가이드 구멍에 수직으로 삽입하고 모든 열에 20 마이크로리터의 TYH 버퍼를 삽입합니다. 포트 B의 경우, 1~4개의 탄열에 TYH 버퍼 22개, 500밀리머 2-데옥시글루의 22마이크로리터를 5~8개의 컬럼에 주입하고, 5개의 마이크로몰라 항마이신 A 로테네톤 25마이크로리터를 9내지 12개의 열로 삽입한다.포트 C의 경우, 홀수 번호로 모든 열에 25 마이크로리터를 주입하고 디부티릴-사이클 AMP 500 마이크로몰라 IBMX의 10 밀리리터를 모든 열에 삽입한 다음 교정 플레이트가 있는 센서 카트리지를 여분의 세포 형플럭스 분석기에 넣고 분석을 시작합니다. 교정에는 10~15분이 소요됩니다. 정자 플레이트를 준비하려면, 3 개의 5 밀리 리터 원심 분리 튜브의 각각에 TYH 버퍼에 밀리리터 소 혈청 알부민 당 3 밀리리터를 추가합니다.다음으로, 3개의 1.5 밀리리터 원심분리기 관의 각으로 정액의 2개의 우물을 풀. 계산 후, 소 혈청 알부민으로 보충 신선한 TYH에서 샘플 당 밀리리터 농도 당 7 개의 정자에 2 번 10으로 정자를 희석. 원심분리에 의한 정자를 퇴적시키고 TYH 완충제의 1밀리리터에서 정자 펠릿을 재중단한다.정자를 다시 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않도록주의하는 슈퍼 나티츠를 제거하십시오. 각 정자 현탁액을 준비된 5밀리리터 원심분리기 튜브 중 하나로 옮기고 ConA 코팅 플레이트의 각 구석 우물에 180 마이크로리터의 TYH 버퍼를 추가합니다. 180 마이크로리터의 정자를 ConA 코팅 플레이트의 각 빈 우물에 넣고 원심 분리 사이에 플레이트를 180도 회전하는 플레이트를 두 번 원심 분리한 다음 정자 판으로 교정 플레이트를 놓고 분석작업을 계속합니다.이 대표적인 실험에서, 정자는 약리학적 변조기로서 유일한 에너지 기판및 2-deoxyglucose 및 항마이신 및 로테네온으로서 포도당의 존재에서 커패시핑되었다. 화살표는 capacitation의 유도를 나타냅니다. 포도당의 존재에서, capacitation는 2-deoxyglucose와 글리코리시스를 차단하여 억제되는 세포외 산성화 비율에 있는 7 배 증가를 동반했습니다.정전 식 정자는 마우스 정자가 캐포라송 중 증가하는 에너지 수요를 지원하기 위해 글리코리시스와 산화 인산화를 모두 향상시킨다는 것을 보여주는 비 커패시티드 정자에 비해 산소 소비율이 20배 증가하는 것을 입증했습니다. 정자 캐포터절 중 세포외 산성화율의 상승은 산화 인산화 억제제 인미신 A 및 로테네네에 의해 영향을 받지 않으며, 이 비율의 변화는 주로 글리코리시스로부터의 수소 방출에 의해 구동된다는 것을 나타낸다. 산소 소비율의 증가는, 그러나, 항마이신 A와 로테논뿐만 아니라 2-deoxyglucose에 의해 차단되는 것은 정자 capacitation 도중 OXPHOS의 증가가 글리코리스틱 활동에 달려 있다는 것을 드러내는.에너지원 및 약리학적 활성제 및 억제제는 실험의 목표에 따라 다양할 수 있으며 최대 12개의 상이한 조건을 병렬로 측정할 수 있다. 프로토콜은 쉽게 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경이 동등하게 수수께끼인 인간 또는 소 같이 그밖 종에 적응할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

연구

생화학

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

세포 외 포도당 고갈은 세포 및 조직 Ex vivo 에서 포도당 흡수의 간접적 인 척도로서

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...