Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller høy gjennomstrømning og spektroskopi Resource Center.

Sperm er samlet fra 8-16-uke gamle CD-1 mannlige mus. Animal eksperimenter ble godkjent av Weill Cornell Medicine ' s institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. dag før analysen
<ol><li>
Utarbeidelse av sensor patron og ekstracellulære Flux analysator calibrant
	<ol>
<li>Hvis du vil hydrere sensor patronen, fjerner du sensor patronen fra XFe96 ekstracellulære Flux analysen Kit og plasserer sensor patronen opp-ned ved siden av verktøy platen.</li>
		<li>Fyll...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Tapet av sperm capacitation i fravær av visse metabolske underlag eller kritiske metabolske enzymer avslørte energi metabolisme som en nøkkelfaktor som støtter vellykket befruktning. En metabolsk bryter under celle aktivering er et veletablert begrep i andre celletyper, men vi er bare begynnelsen for å forstå hvordan sperm tilpasse metabolismen til den økende energietterspørselen under capacitation. Bruke en ekstracellulære Flux analysator, vi utviklet et lett anvendelig verktøy for å overvåke endringer i Gly...

Anvendelsen av masse massespektrometri har revolusjonert studiet av metabolisme. Målrettet metabolsk profilering og metabolomic tracing tillate presis overvåking av endringer i energi metabolisme. Men utfører Plantemetabolomikk vellykket krever omfattende opplæring, erfarne ansatte, og dyre, svært følsom masse spektrometre ikke lett tilgjengelig for hvert laboratorium. I de senere årene, ved hjelp av en ekstracellulære Flux Analyzer, slik som Seahorse XFe96 har vokst populær som en surrogat metode for å måle endringer i energi metabolisme i ulike celletyper1,2,3,4,5.
Sperm er svært spesialiserte aktive celler; Hvis oppgave er å levere fars Genova til oocyte. Sperm forlate den mannlige reproduktive tarmkanalen etter utløsning er fortsatt funksjonelt umodne og kan ikke gjødsle oocyte fordi de ikke er i stand til å trenge inn i oocytter ' gevantene. Sperm erverve befruktning kompetanse som de transitt gjennom kvinnelige reproduktive tarmkanalen i en modningsprosess kjent som capacitation6,7. Fersk utbrøt sperm eller sperm dissekert fra cauda bitestikkel kan være capacitated in vitro av inkubasjons i definerte capacitation medier som inneholder ca2 +, bikarbonat (HCO3-) eller en celle-gjennomtrengelig leir analog (f. eks dibutyryl-cAMP), en kolesterol Acceptor (f. eks, storfe serum albumin, BSA), og en energikilde (f. eks, glukose). Under capacitation, sperm endre sin motilitet mønster i en asymmetrisk flagellar beat, som representerer en svømming modus kalt hyperactivation8,9, og de blir kompetente til å gjennomgå acrosome reaksjon7, der proteolytiske enzymer slippes som fordøye oocytter ' gevantene. Disse prosessene krever energi, og ligner på somatiske celler, sperm generere ATP og andre høy energi forbindelser via Glykolysen samt mitokondrie TCA-syklus og oksidativt fosforylering (oxphos)10. Mens flere studier viser at Glykolysen er nødvendig og tilstrekkelig for å støtte sperm capacitation11,12,13,14, er bidraget fra oxphos mindre klart. I motsetning til andre celletyper der Glykolysen er fysisk koblet til TCA-syklusen, sperm er svært compartmentalized og antas å opprettholde disse prosessene i separate flagellar rom: midpiece konsentrerer mitokondrie maskiner, mens de viktigste enzymene av Glykolysen synes å være begrenset til rektor stykket15,16. Dette compartmentalization resulterer i en pågående debatt om hvorvidt pyruvat produsert i hoveddelen av Glykolysen kan støtte mitokondrie oxphos i midpiece, og om ATP produsert av oxphos i midpiece ville være i stand til å diffuse tilstrekkelig raskt langs lengden av flagellum for å støtte energibehovet i klare deler av rektor stykket17,18,19. Det er også støtte av en rolle for oxphos i sperm capacitation. Ikke bare er oxphos mer energisk gunstige enn Glykolysen, genererer 16 ganger mer ATP enn Glykolysen, men midpiece volum og mitokondrie innhold er direkte korrelert med reproduktiv fitness i pattedyrarter som viser større grad av konkurranse mellom menn for kameratene20. Adressering disse spørsmålene krever metoder for å undersøke den relative bidrag av Glykolysen og oxphos under sperm capacitation.
Tourmente et al. påføres en 24-brønn ekstracellulære Flux analysator å sammenligne energimetabolismen av nært beslektede mus arter med signifikant forskjellig sperm ytelse parametere21. I stedet for å rapportere basal ECAR og OCR verdier av ikke-capacitated sperm, her tilpasser vi deres metode ved hjelp av en 96-brønn ekstracellulære Flux analysator for å overvåke endringer i energi metabolisme under musen sperm capacitation i sanntid. Vi utviklet en metode som gjør det mulig samtidig overvåking Glykolysen og oxphos i sanntid i sperm med juling flagella i opptil tolv ulike eksperimentelle forhold ved å måle Flux av oksygen (O2) og protoner (H+) (figur 1a). På grunn av nedbryting av pyruvat til melkesyre under Glykolysen og produksjon av CO2 via TCA-syklusen, ikke-capacitated og capacitated sperm extrude h+ inn i analysen Media som oppdages av ekstracellulære Flux analysator via H+-sensitive fluorophores immobilisert til sonden spissen av en sensor patron. I parallell oppdages O2 -forbruk ved oksidativt fosforylering via O2-følsom fluorophores immobilisert til samme sonde TIP (figur 1B). Effektiv påvisning av den utgitte H+ og forbrukes O2 krever en modifisert sperm buffer med lav bufring kapasitet uten bikarbonat eller fenol rød. Således, for å indusere capacitation i fravær av bikarbonat, vedtok vi bruk av en celle gjennomtrengelig cAMP analog injisert sammen med bred-Range PDE inhibitor IBMX22. Tre ekstra uavhengige injeksjon porter tillate injeksjon av farmakologiske Aktivator og/eller hemmere, som forenkler sanntids deteksjon av endringer i cellulær åndedrett og Glykolysen rate på grunn av eksperimentell manipulasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Pattedyr sperm erverve befruktning kapasitet i den kvinnelige reproduktive tarmkanalen i en prosess kjent som capacitation. Capacitation-assosierte prosesser krever energi. Det gjenstår en pågående debatt om kildene generere ATP som brensel sperm progressiv motilitet, capacitation, hyperactivation, og acrosome reaksjon. Her beskriver vi anvendelsen av en ekstracellulære Flux analysator som et verktøy for å analysere endringer i energi metabolisme under musen sperm capacitation. Ved bruk av H+-og O2-sensitive fluorophores, kan denne metoden overvåke Glykolysen og oksidativt fosforylering i sanntid i ikke-capacitated versus capacitating sperm. Ved hjelp av denne analysen i nærvær av ulike energi underlag og/eller farmakologiske Aktivator og/eller hemmere kan gi viktig innsikt i bidraget av ulike metabolske trasé og skjæringspunktet mellom signalering kaskader og metabolisme under sperm capacitation.

Denne metoden bruker en ekstracellulære Flux analysator å overvåke sanntid endringer i frekvensen av Glykolysen og oxphos under musen sperm capacitation. Figur 4 viser en eksemplarisk eksperiment der sperm ble capacitated i nærvær av glukose som den eneste energien underlaget og 2-DG og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Energien underlaget i ekstracellulære Flux analysator TYH buffer og farmakologiske modulatorer kan fritt velges avhe...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Vi beskriver anvendelsen av en ekstracellulære Flux analysator å overvåke sanntid endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under musen sperm capacitation.

Bruke en ekstracellulære Flux Analyzer til å måle endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under Mouse sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Denne protokollen kan brukes til å bruke en ekstracellulær flux analysator for å overvåke endringer i energimetabolismen under spermkapasitet. Vi utviklet denne protokollen for å sammenligne endringer i glykose og oksidativ fosforylering i sanntid mellom ikke-kapasitert og kapasitert mussæd. Dagen før analysen fjerner du sensorkassetten fra et ekstracellulært fluksanalysesett og plasserer sylinderampullen opp ned ved siden av bruksplaten.Fyll et løsningsreservoar med 25 milliliter dobbelt destillert vann og tilsett 200 mikroliter vann til hver brønn på nytteplaten, og plasser deretter sensorkassetten tilbake i nytteplaten. Plasser platen i en 37 graders Celsius ikke-karbondioksid inkubator. Deretter aliquot 25 milliliter ekstracellulær flux analysator kalibrant i en 50 milliliter konisk rør og plassere røret i 37 grader Celsius ikke-karbondioksid inkubator.For å forberede ConA-belagte mikroplater, oppløs 2,5 milligram ConA i fem milliliter dobbelt destillert vann og bruk en flerkanals pipette til å fylle hver brønn av en ekstracellulær fluksasanalysator 96-brønnsplate med 50 mikroliter av ConA-løsningen, og la lokket stå åpent for å la platen tørke over natten. For å forberede spermbufferen, varme 250 milliliter ekstracellulær flux analysator TYH buffer til 37 grader Celsius og justere pH til 7,4. På analysedagen, bytt vannet i hver brønn av nytteplaten med 200 mikroliter XF-kalifar per brønn og plasser platen tilbake i ikke-karbondioksidinkubatoren i minst en time.Hvis du vil generere en bølgemal, slår du på den ekstracellulære fluksalysatoren. Mens temperaturen stabiliserer seg til 37 grader Celsius, åpner du bølgeprogramvaren og åpner en tom mal. Under kategorien Gruppedefinisjoner definerer du analysemediet som TYH og celletypen som musesæd, slik at injeksjonsstrategiene og forbehandlingene er tomme.Opprett forskjellige grupper for hver analysebetingelse og åpne platekartet for å tilordne hver gruppe til bestemte brønner. Legg til hver av fire forskjellige målesykluser under protokollfanen, la til hver av fire forskjellige målesykluser, velger den respektive porten og redigerer måledetaljene slik at målet etter injeksjonen er uthevet, lagrer deretter analysemalen, fyller ut prosjektsammendraget og lagrer resultatene. Før høsting av sæden, prewarm 50 milliliter TYH buffer ved 37 grader Celsius.Etter høsting av caudas fra voksne hannmus, legg hver cauda i 500 mikroliter av den forhåndsoppvarmede TYH-bufferen i individuelle brønner av en 24-brønns plate. Bruk tang til å immobilisere hver cauda individuelt på bunnen av hver brønn og raskt gjøre fem til syv små snitt i hvert vev ved hjelp av fjær saks. Når alle caudas er inkuert, legg umiddelbart platen i inkubatoren av ikke karbondioksid for å la sæden spre seg i 15 minutter.Hvis du vil laste sensorkassetten, fjerner du lokket fra sensorkassetten og justerer bokstaven i den respektive portlastingsføreren med øvre venstre hjørne av sylinderampullen. Hold portlastingsføreren på plass, sett pipettespissene vertikalt inn i portlastingsføringshullene i port A og injiser 20 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne. For port B, injiser 22 mikroliter tyh-buffer i kolonner en til fire, 22 mikroliter på 500 millimolar 2-deoksyglucose i kolonner fem til åtte, og 25 mikroliter av fem mikromolar antimycin En rotenone i kolonner ni til 12.For port C, injiser 25 mikroliter TYH-buffer i hver kolonne med oddetall og 25 mikroliter på 10 millimolar dibutyrylsykliske AMP 500 mikromos IBMX i hver kolonne med jevne tall, og plasser deretter sensorkassetten med en kalibreringsplate i den ekstracellulære fluksanalysatoren og start analysen. Kalibreringen tar 10 til 15 minutter. For å forberede spermplater, tilsett tre milliliter på tre milligram per milliliter storfe serum albumin i TYH buffer til hver av tre fem milliliter sentrifuge rør.Deretter, pool to brønner av sperm i hver av tre 1,5 milliliter sentrifuge rør. Etter telling, fortynne sperm til en to ganger 10 til syv sperm per milliliter konsentrasjon per prøve i fersk TYH supplert med storfe serum albumin. Sediment sperm ved sentrifugering og resuspend sperm pellets i en milliliter TYH buffer.Sentrifuger sæden igjen og fjern supernativa som tar vare på å ikke forstyrre pellets. Overfør hver sperm suspensjon til en av de tilberedte fem milliliter sentrifuge rør og tilsett 180 mikroliter tyh buffer i hvert hjørne brønn av en ConA belagt plate. Tilsett 180 mikroliter sperm i hver tomme brønn av ConA-belagt plate og sentrifuger platen to ganger roterende platen 180 grader mellom sentrifuger, plasser kalibreringsplaten med sædplaten og fortsett analysen.I dette representative eksperimentet ble sæd kapasitert i nærvær av glukose som det eneste energisubstratet og 2-deoksyglucose og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Pilen indikerer induksjon av kapasitet. I nærvær av glukose ble kapacitation ledsaget av en syvgangers økning i ekstracellulær forsuringshastighet som hemmes ved å blokkere glykose med 2-deoksygllukose.Kapasitert sperm viste en 20-ganger økning i oksygenforbruket sammenlignet med ikke-kapasitert sperm viser at mus sperm forbedre både glykose og oksidativ fosforylering for å støtte den økende energietterspørselen under kapasitet. Økningen i den ekstracellulære forsuringsraten under spermkapasitet påvirkes ikke av oksidative fosforyleringshemmere antimycin A og rotenon som indikerer at endringen i denne hastigheten hovedsakelig drives av hydrogenutgivelse fra glykose. Økningen i oksygenforbruket er imidlertid blokkert av antimycin A og rotenon, samt av 2-deoksyglucose som avslører at økningen i OXPHOS under spermkapasitet er avhengig av glykolytisk aktivitet.Energikilden og farmakologiske aktivatorer og hemmere kan varieres avhengig av målet med eksperimentet og opptil 12 forskjellige forhold kan måles parallelt. Protokollen kan lett tilpasses andre arter som menneskelig eller storfe hvor endringene i energimetabolismen under kapasitet er like gåtefulle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En rask, objektiv fluorescerende metode for å oppdage endringer i synapsetetthet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimalisert enkeltmolekyls pull-down-analyse for kvantifisering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseuttømming som et indirekte mål på glukoseopptak i celler og vev ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...