Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
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Os autores desejam reconhecer o apoio do Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu no Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Os espermatozóides são coletados de 8-16 semanas de idade CD-1 ratos machos. Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Weill Cornell Medicine.
1. Dia antes do ensaio
<ol><li>
Preparação do cartucho do sensor e do calibrador extracelular do analisador do fluxo
	<ol>
<li>Para hidratar o cartucho do sensor, retire o cartucho do sensor do Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular XFe96 e coloque o cartucho de sensor...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

A perda de capacitação do esperma na ausência de certos substratos metabólicos ou enzimas metabólicas críticas revelou o metabolismo energético como um fator chave que suporta a fertilização bem sucedida. Um interruptor metabólico durante a ativação celular é um conceito bem estabelecido em outros tipos de células, no entanto, estamos apenas começando a entender como o esperma adapta seu metabolismo à crescente demanda de energia durante a capacitação. Usando um analisador de fluxo extracelular, desenvo...

A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células1,2,3,4,5.
Os espermatozóides são células motil altamente especializadas; cuja tarefa é entregar o genoma paterno ao ócito. O esperma que sae do intervalo reprodutivo masculino após a ejaculação é ainda funcional imaturo e não pode fertilizar o oócito porque são incapazes de penetrar as vestes dos oócitos. O esperma adquire a competência da fecundação enquanto transitam através do intervalo reprodutivo fêmea em um processo da maturação sabido como a capacitação6,7. Esperma ou esperma recém-ejaculado dissecado do epididímos cauda podem ser capacitados in vitro por incubação em meios de capacitação definido contendo Ca2+,bicarbonato (HCO3-) ou um analógico de axigônta permeável celular (por exemplo, dibutyryl-cAMP), um aceitador de colesterol (por exemplo, albumina de soro bovina, BSA) e uma fonte de energia (por exemplo, glicose). Durante a capacitação, o esperma modifica seu padrão de motilidade em uma batida flagelar assimétrica, representando um modo de natação chamado hiperativação8,9,e eles se tornam competentes para se submeter à reação acrosome7, onde enzimas proteolíticas são liberados que digerem os vestments dos oócitos. Estes processos requerem energia, e semelhante sasmáticas, espermatozóides geram ATP e outros compostos de alta energia através da glicolíse, bem como ciclo de TCA mitocondrial e fosforilação oxidativa (oxphos)10. Enquanto vários estudos demonstram que a glicolyse é necessária e suficiente para suportar a capacitação deespermatozóides 11,12,13,14, a contribuição do oxphos é menos clara. Ao contrário de outros tipos de células onde a glicolíse é fisicamente acoplado ao ciclo tca, espermatozóides são altamente compartimentados e são pensados para manter esses processos em compartimentos flagelar separados: o midpiece concentra a maquinaria mitocondrial, enquanto as enzimas-chave da glicolíse parecem ser restritas à peça principal15,16. Esta compartimentação resulta em um debate em curso sobre se o piruvato produzido na peça principal por glicolíse pode suportar oxphos mitocondrial no meio, e se ATP produzido por oxphos no midpiece seria capaz de difundir suficientemente rapidamente ao longo do comprimento do flagellum para suportar as necessidades energéticas em partesdistaisda peça principal 17,18,19. Há também o apoio de um papel para o oxphos na capacitação de espermatozóides. Não só o oxphos é mais favorável do que a glicolíse, gerando 16 vezes mais ATP do que a glicolíse, mas o volume médio e o conteúdo mitocondrial estão diretamente correlacionados com a aptidão reprodutiva em espécies de mamíferos que apresentam maiores graus de competição entre os machos para os companheiros20. Abordar essas questões requer métodos para examinar as contribuições relativas de glicolíse e oxphos durante a capacitação do esperma.
Tourmente et al. aplicaram um analisador de fluxo extracelular de 24 poços para comparar o metabolismo energético de espécies de camundongos intimamente relacionadas com parâmetros de desempenho deesperma21significativamente diferentes. Em vez de relatar os valores basal de ECAR e de OCR do esperma non-capacitated, aqui, nós adaptamos seu método usando um analisador extracelular do fluxo de 96 poços para monitorar mudanças no metabolismo de energia durante a capacitação do esperma do rato no tempo real. Desenvolvemos um método que permite monitorar simultaneamente a glicolíse e o oxphos em tempo real em espermatozóides com flagela batendo em até doze condições experimentais diferentes, medindo o fluxo de oxigênio (O2)e prótons (H+) (Figura 1A). Devido à quebra de piruvato para lactato durante a glicolíse e a produção de CO2 através do ciclo TCA, espermatozóides não capacitados e capacitados extrude H+ nos meios de ensaio que são detectados pelo analisador de fluxo extracelular via H+fluorofosfos sensíveis imobilizados para a ponta da sonda de um cartucho de sensor. Em paralelo, o consumo de O2 por fosforilação oxidativa é detectado via O2-fluorofóbicos sensíveis imobilizados até a mesma ponta da sonda (Figura 1B). A detecção eficaz do H+ liberado e consumiu O2 requer um amortecedor de esperma modificado com baixa capacidade de tampão sem bicarbonato ou fenol vermelho. Assim, para induzir a capacitação na ausência de bicarbonato, adotamos o uso de um analógico de cAMP permeável celular injetado juntamente com o inibidor de PDE de ampla gama IBMX22. Três portos de injeção independentes adicionais permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores, o que facilita a detecção em tempo real de alterações na taxa de respiração celular e glicolíse devido à manipulação experimental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

O esperma mamífero adquire a capacidade da fecundação no intervalo reprodutivo fêmea em um processo conhecido como a capacitação. Os processos associados à capacitação requerem energia. Ainda há um debate em curso sobre as fontes que geram o ATP que alimenta a motilidade progressiva do esperma, a capacitação, a hiperativação, e a reação acrógrada. Aqui, descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular como uma ferramenta para analisar as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma do rato. Usando h+- e O2- fluoroforres sensíveis, este método permite monitorar a glicolíse e a fosforilação oxidativa em tempo real em espermatozóides não capacitados versus capacitados. Usar este ensaio na presença de diferentes substratos energéticos e/ou ativadores farmacológicos e/ou inibidores pode fornecer insights importantes sobre a contribuição de diferentes vias metabólicas e a interseção entre sinalização de cascatas e metabolismo durante a capacitação do esperma.

Este método usa um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças em tempo real na taxa de glicolíse e oxphos durante a capacitação de espermatozóides do mouse. A figura 4 mostra um experimento exemplar em que o esperma foi capacitado na presença de glicose como o único substrato de energia e 2-DG e antimicina e rotenone como moduladores farmacológicos. O substrato de energia no amortecedor TYH do analisador de fluxo extracelular e os modul...

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Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Este protocolo pode ser usado para aplicar um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma. Desenvolvemos este protocolo para comparar mudanças na glicólise e fosforilação oxidativa em tempo real entre espermatozoides não capacitados e capacitados. Na véspera do ensaio, remova o cartucho do sensor de um kit de ensaio de fluxo extracelular e coloque o cartucho de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade.Encha um reservatório de solução com 25 mililitros de água dupla destilada e adicione 200 microliters de água a cada poço da placa de utilidade, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius. Em seguida, alíquota de 25 mililitros de calibrador de análise de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque o tubo na incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius.Para preparar micro placas revestidas, dissolva 2,5 miligramas de em cinco mililitros de água dupla destilada e use uma pipeta multicanal para encher cada poço de uma placa de 96 poços de fluxo extracelular com 50 microliters da solução, em seguida, deixe a tampa aberta para deixar a placa secar durante a noite. Para preparar o tampão de esperma, aqueça 250 mililitros de tampão TYH analisador de fluxo extracelular a 37 graus Celsius e ajuste o pH para 7,4. No dia do ensaio, substitua a água em cada poço da placa de utilidade por 200 microliters de calibrante XF por poço e coloque a placa de volta na incubadora de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.Para gerar um modelo de onda, ligue o analisador de fluxo extracelular. Enquanto a temperatura está estabilizando para 37 graus Celsius, abra o software de onda e abra um modelo em branco. Sob a guia de definições de grupo, defina o meio de ensaio como TYH e o tipo celular como espermatozoide de rato, deixando as estratégias de injeção e os pré-tratamentos em branco.Crie diferentes grupos para cada condição de ensaio e abra o mapa da placa para atribuir cada grupo a poços específicos. Sob a guia do protocolo, desaqueça o equilíbrio, adicione cada um dos quatro ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e edite os detalhes da medição para que a medida após a injeção seja destacada, em seguida, salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e salve os resultados. Antes de colher o esperma, pré-aqueceu 50 mililitros de tampão TYH a 37 graus Celsius.Após a colheita de caudas de camundongos machos adultos, coloque cada cauda em 500 microliters do tampão TYH pré-aquecido em poços individuais de uma placa de 24 poços. Use fórceps para imobilizar cada cauda individualmente na parte inferior de cada poço e rapidamente fazer cinco a sete pequenas incisões em cada tecido usando tesoura de penas. Quando todas as caudas tiverem sido incisadas, coloque imediatamente a placa na incubadora de dióxido de carbono para permitir que o esperma se disperse por 15 minutos.Para carregar o cartucho do sensor, remova a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carga da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Segurando o guia de carregamento da porta no lugar, insira as pontas da pipeta verticalmente nos orifícios guia de carregamento da porta A e injete 20 microliters de tampão TYH em cada coluna. Para a porta B, injete 22 microliters de tampão TYH nas colunas um a quatro, 22 microlitadores de 500 milmolares 2-desoxiglucose nas colunas cinco a oito, e 25 microlitadores de cinco antimicina micromolar A rotenone nas colunas nove a 12.Para a porta C, injete 25 microliters de tampão TYH em cada coluna com números ímpares e 25 microliters de 10 milimilitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX em cada coluna com números pares, em seguida, coloque o cartucho do sensor com uma placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração levará de 10 a 15 minutos. Para preparar as placas de esperma, adicione três mililitros de três miligramas por mililitro de soro bovino em tampão TYH para cada um dos três tubos de centrífugas de cinco mililitros.Em seguida, poça dois poços de esperma em cada um dos três tubos de centrífugas de 1,5 mililitro. Após a contagem, dilui o esperma em duas vezes 10 para os sete espermatozoides por concentração mililitro por amostra em TYH fresco complementado com albumina de soro bovino. Sedimente o esperma por centrifugação e resuspense as pelotas de esperma em um mililitro de tampão TYH.Centrifugar o esperma novamente e remover os supernacantes tomando cuidado para não perturbar as pelotas. Transfira cada suspensão de esperma em um dos tubos de centrífugas preparados de cinco mililitros e adicione 180 microliters de tampão TYH em cada poço de canto de uma placa revestida. Adicione 180 microliters de esperma em cada poço vazio da placa revestida e centrifugar a placa duas vezes girando a placa 180 graus entre centrífugas, em seguida, coloque a placa de calibração com a placa de esperma e continue o ensaio.Neste experimento representativo, os espermatozoides foram capacitados na presença de glicose como o único substrato energético e 2-desoxicose e antimicina e rotenona como os moduladores farmacológicos. A seta indica indução da capacitação. Na presença de glicose, a capacitação foi acompanhada por um aumento de sete vezes na taxa de acidificação extracelular que é inibida pelo bloqueio da glicolise com 2-desoxicosglucose.O esperma capacitado demonstrou um aumento de 20 vezes na taxa de consumo de oxigênio em comparação com espermatozoides não capacitados demonstrando que o esperma do camundongo melhora tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa para suportar a crescente demanda de energia durante a capacitação. O aumento da taxa de acidificação extracelular durante a capacitação do esperma não é afetado pelos inibidores de fosforilação oxidativa antimicina A e rotenona indicando que a mudança nesta taxa é impulsionada principalmente pela liberação de hidrogênio da glicólise. O aumento da taxa de consumo de oxigênio, no entanto, é bloqueado pela antimicina A e rotenona, bem como por 2-desoxicosglucose revelando que o aumento do OXPHOS durante a capacitação do esperma depende da atividade glicóltica.A fonte de energia e os ativadores e inibidores farmacológicos podem ser variados dependendo do objetivo do experimento e até 12 condições diferentes podem ser medidas em paralelo. O protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies como humano ou bovino, onde as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação são igualmente enigmáticas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Bioquímica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

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Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...