Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить поддержку д-ра Лавуазье Рамоса-Эспириту в Центре ресурсов Рокфеллера и спектроскопии.

Сперма тона собрана у 8-16-недельных мышей CD-1. Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Вейла Корнелла (IACUC).
1. День до ассеидов
<ol><li>
Приготовление сенсорного картриджа и калибровщика внеклеточного анализ?...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Потеря емкостя спермы при отсутствии определенных метаболических субстратов или критических метаболических ферментов выявила энергетический обмен в качестве ключевого фактора, поддерживающего успешное оплодотворение. Метаболический переключатель во время активации клеток являет...

Применение масс-спектрометрии произвело революцию в изучении метаболизма. Целенаправленное метаболическое профилирование и метаболомическое отслеживание позволяют точно контролировать изменения в энергетическом метаболизме. Тем не менее, выполнение метаболомики успешно требует обширной подготовки, опытный персонал, и дорогие, высокочувствительные масс-спектрометры не легко доступны для каждой лаборатории. В последние годы, используя внеклеточный анализатор потока, таких как Seahorse XFe96 стал популярным в качестве суррогатного метода для измерения изменений в энергетическом метаболизме в различных типах клеток1,2,3,4.
Сперма являются узкоспециализированными мотильные клетки; чья задача состоит в том, чтобы доставить отцовский геном к яйцеклетке. Сперматозоиды, покидающие мужской репродуктивный тракт после эякуляции, по-прежнему функционально незрелы и не могут оплодотворить яйцеклетки, потому что они не могут проникнуть в облачения яйцеклеток. Сперма приобретает компетенцию по оплодотворению, поскольку они проходят через женский репродуктивный тракт в процессе созревания, известном как конденсация6,7. Свежеэякуляция сперма или сперма, расчлененные из кауда эпидидимис может быть конденсирован в пробирке путем инкубации в определенных емчечных носителях, содержащих Ca2 ", бикарбонат (HCO3-) или клеточной проницаемой аналоге cAMP (например, dibutyryl-cAMP), принимая холестерин (например, буйный сывороточный альбомин, BSA) и источник энергии (например, глюкоза). Во время емкости, спермаизменить их шаблон подвижности в асимметричный флагельер бить, представляющий режим плавания называется гиперактивации8,9, и они становятся компетентными пройти акросома реакции7, где протеолитических ферментов освобождены, которые переваривают облачения яйцеклеток. Эти процессы требуют энергии, и аналогичные соматические клетки, сперматозоиды генерировать АТФ и других соединений высокой энергии с помощью гликолиза, а также митохондриальный цикл TCA и окислительного фосфорилирования (оксифос)10. Хотя многочисленные исследования показывают, что гликолиз необходим и достаточно для поддержки спермы емчебой11,12,13,14, вклад oxphos менее ясно. В отличие от других типов клеток, где гликолиз физически связан с циклом TCA, сперма сильно разобщена и, как полагают, поддерживает эти процессы в отдельных отсеках флагеллара: средний элемент концентратирует митохондриальную технику, в то время как ключевые ферменты гликолиза, как представляется, ограничены основной частью15,16. Это разобщенности приводит к продолжающейся дискуссии о том, pyruvate производится в основной кусок гликолизом может поддерживать митохондриальный oxphos в середине, и является ли АТФ производства oxphos в середине будет в состоянии рассеять достаточно быстро по длине flagellum для поддержки энергетических потребностей в дистальных частей основной части17,19. Существует также поддержка роли oxphos в емчеобразной сперме. Мало того, что oxphos более энергетически благоприятным, чем гликолиз, генерации 16 раз больше АТФ, чем гликолиз, но средний объем и митохондриальный содержание непосредственно коррелируют с репродуктивной пригодности у млекопитающих видов, которые демонстрируют большую степень конкуренции между мужчинами для товарищей20. Для решения этих вопросов требуются методы изучения относительного вклада гликолиза и оксифоса во время конденсации спермы.
Tourmente et al. применили 24-хорошо внеклеточный анализатор потока, чтобы сравнить энергетический метаболизм тесно связанных видов мышей со значительно отличаемыми параметрами производительности спермы21. Вместо того, чтобы сообщать о базальных значениях ECAR и OCR неконденционной спермы, здесь мы адаптируем их метод с помощью 96-хорошо внеклеточного анализатора потока потока для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме во время емкостя спермы мыши в режиме реального времени. Мы разработали метод, который позволяет одновременно контролировать гликолиз и oxphos в режиме реального времени в сперме с избиением флагеллы в до двенадцати различных экспериментальных условиях путем измерения потока кислорода (O2) и протонов (H)(Рисунок 1A). В связи с разбивкой пировата лактата во время гликолиза и производства CO2 через Цикл TCA, неемные и емкие спермы экструдировать Hв анализ средств, которые обнаруживаются внеклеточного анализатора флюкса через H-чувствительные флюорофоры обездвижены к кончику зонда датчика. Параллельно, O2 потребление окислительного фосфорилирования обнаруживается через O2чувствительных флюорофоров обездвижены к тому же наконечник зонда (Рисунок 1B). Эффективное обнаружение высвобожденных Hи потребляемых O2 требует модифицированного буфера спермы с низкой буферной емкостью без бикарбоната или фенола красного цвета. Таким образом, чтобы вызвать емки при отсутствии бикарбоната, мы приняли использование клеточного аналога cAMP, введенного вместе с широкодиапазонным ингибитором PDE IBMX22. Три дополнительных независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов, что облегчает обнаружение в режиме реального времени изменений в клеточном дыхании и скорости гликолиза в связи с экспериментальными манипуляциями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению в женском репродуктивном тракте в процессе, известном как емкости. Процессы, связанные с конденсацией, требуют энергии. Остается продолжающаяся дискуссия об источниках генерации АТФ, который питает прогрессивную подвижность спермы, емкости, гиперактивации и акросома реакции. Здесь мы описываем применение внеклеточного анализатора потока как инструмент для анализа изменений в энергетическом метаболизме во время конденсации спермы мыши. Используя Hq- и O2- чувствительные фторофоры, этот метод позволяет контролировать гликолиз и окислительный фосфорилирование в режиме реального времени в не-конденсированных против емкисперма спермы. Использование этого анализа в присутствии различных энергетических субстратов и/или фармакологических активаторов и/или ингибиторов может дать важное представление о вкладе различных метаболических путей и пересечении сигнальных каскадов и метаболизма во время конденсации спермы.

Этот метод использует внеклеточный анализатор потока для мониторинга в реальном времени изменения в скорости гликолиза и oxphos во время емки спермы мыши. На рисунке 4 показан образцовый эксперимент, в ходе котором сперма точника была вложена в присутств...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Мы описываем применение внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений гликолиза в режиме реального времени и окислительного фосфорилирования во время конденсации спермы мыши.

Использование внеклеточного анализатора flux для измерения изменений в гликолизе и окислительной фосфорилации во время емки спермы мыши

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Этот протокол может быть использован для применения внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений энергетического метаболизма во время емкости спермы. Мы разработали этот протокол для сравнения изменений в гликолизе и окислительном фосфорилировании в режиме реального времени между недееспособной и недееспособной спермой мыши. За день до анализа снимите сенсорный картридж с комплекта анализа внеклеточного потока и поместите картридж вверх дном рядом с коммунальной пластиной.Заполните резервуар раствора 25 миллилитров двойной дистиллированной воды и добавьте 200 микролитров воды к каждому колодец полезной пластины, а затем поместите картридж датчика обратно в утилиту пластины. Поместите пластину в инкубатор неуглеродного диоксида по Цельсию на 37 градусов Цельсия. Далее, aliquot 25 миллилитров внеклеточного потока анализатора калибранта в 50 миллилитров конической трубки и поместите трубку в 37 градусов по Цельсию неуглеродного диоксида инкубатора.Для подготовки ConA покрытием микро пластин, растворить 2,5 миллиграмма ConA в пяти миллилитров двойной дистиллированной воды и использовать многоканальный пипетку, чтобы заполнить каждый колодец внеклеточного потока анализатор 96-ну пластины с 50 микролитров раствора ConA, а затем оставить крышку открытой, чтобы пластина высохнуть на ночь. Чтобы подготовить буфер спермы, нагрейте 250 миллилитров внеклеточного анализатора потока TYH буфера до 37 градусов по Цельсию и отрегулируйте рН до 7,4. В день анализа замените воду в каждом колодеце коммунальной пластины 200 микролитров калибранта XF на колодец и поместите пластину обратно в инкубатор неуглеродного диоксида, по крайней мере, на один час.Чтобы создать шаблон волны, включите внеклеточный анализатор потока. В то время как температура стабилизируется до 37 градусов по Цельсию, откройте программное обеспечение волны и откройте пустой шаблон. В соответствии с группой определений вкладке, определить анализ среды, как TYH и типа клеток, как мышь спермы, в результате чего инъекционные стратегии и предварительной обработки пустым.Создайте различные группы для каждого состояния анализа и откройте карту плиты, чтобы назначить каждую группу к определенным скважинам. В соответствии с вкладкой протокола, unhighlight equilibrate, добавить каждый из четырех различных циклов измерения, выбрать соответствующий порт, и редактировать детали измерения так, что мера после инъекции выделена, а затем сохранить шаблон анализа, заполнить резюме проекта и сохранить результаты. Перед сбором спермы, довоенная 50 миллилитров буфера TYH при 37 градусах по Цельсию.После сбора кауд от взрослых мышей мужского пола, поместите каждую кауду в 500 микролитров предварительно разогретого буфера TYH в отдельных колодцах 24-хорошо пластины. Используйте типсы, чтобы обездвижить каждую кауду индивидуально в нижней части каждого хорошо и быстро сделать пять-семь небольших разрезов в каждой ткани с помощью перьевых ножниц. Когда все caudas были incised, немедленно поместите пластину в неуглеродный инкубатор диоксида, чтобы позволить сперме разойтись в течение 15 минут.Чтобы загрузить сенсорный картридж, снимите крышку с сенсорного картриджа и выровняйте букву соответствующего руководства по погрузке порта с верхним левым углом картриджа. Удерживая руководство по погрузке порта на месте, вставьте наконечники пипетки вертикально в отверстия для загрузки порта А и ввелите 20 микролитров буфера TYH в каждую колонку. Для порта B, введать 22 микролитров буфера TYH в столбцы от одного до четырех, 22 микролитров 500 миллимолярный 2-deoxyglucose в столбцы от пяти до восьми, и 25 микролитров из пяти микромолечных антимицина ротенон в столбцы с девяти до 12.Для порта C ввезу 25 микролитров буфера TYH в каждую колонку с нечетными числами и 25 микролитров по 10 миллимоляров дибутирил-циклического микромолара IBMX в каждую колонку с четными числами, затем поместите сенсорный картридж с калибровочной пластиной во внеклеточный анализатор потока и начните анализатор. Калибровка займет от 10 до 15 минут. Чтобы подготовить сперматозоиды, добавьте три миллилитра по три миллиграмма на миллилитр бычьего альбумин сыворотки в буфере TYH к каждой из трех пяти миллилитровых центрифугных трубок.Далее, бассейн два колодца спермы в каждой из трех 1,5 миллилитров центрифуг трубки. После подсчета, разбавить сперму в два раза от 10 до семи сперматозоидов на миллилитр концентрации на образец в свежем TYH дополняется бычьей сыворотки альбумин. Осадок спермы центрифугации и повторного высасывания гранул спермы в один миллилитр буфера TYH.Центрифуга спермы снова и удалить supernatants заботы, чтобы не беспокоить гранулы. Перенесите каждую суспензию спермы в одну из подготовленных пяти миллилитров центрифуг и добавьте 180 микролитров буфера TYH в каждый угол хорошо пластины с покрытием ConA. Добавьте 180 микролитров спермы в каждый пустой колодец пластины с покрытием ConA и центрифуга пластины два раза вращая пластину 180 градусов между центрифугациями, затем поместите калибровочную пластину с пластиной спермы и продолжить анализ.В этом репрезентативном эксперименте сперматозоиды были емкости в присутствии глюкозы в качестве единственного энергетического субстрата и 2-дезиглюкозы и антимицина и ротенона в качестве фармакологических модуляторов. Стрелка указывает на индукцию емкости. При наличии глюкозы, емкость сопровождалась семикратным увеличением внеклеточной скорости подкисления, которая подавляется блокированием гликолиза с 2-дезиглюкозой.Конденсатная сперма продемонстрировала 20-кратное увеличение скорости потребления кислорода по сравнению с недееспособной спермой, демонстрируя, что сперма мыши усиливает как гликолиз, так и окислительный фосфорилирование для поддержки растущего спроса на энергию во время емкости. На рост уровня внеклеточного подкисления во время емкости спермы не влияют ингибиторы окислительного фосфорилирования антимицин А и ротенон, указывающие на то, что изменение этого уровня в основном обусловлено выбросом водорода из гликолиза. Увеличение скорости потребления кислорода, однако, блокируется антимицином А и ротеноном, а также 2-дезиглиглукозой, показывая, что увеличение ОКСФОС во время емкости спермы зависит от гликолитической активности.Источник энергии и фармакологические активаторы и ингибиторы могут быть разнообразны в зависимости от цели эксперимента и до 12 различных условий могут быть измерены параллельно. Протокол может быть легко адаптирован к другим видам, таким как человек или бык, где изменения в энергетическом метаболизме во время емкости одинаково загадочны.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Изучение динамики клеточной адгезии и распространения эпителиальных клеток на фибронектин во время окислительного стресса

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...