Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
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Los autores desean reconocer el apoyo del Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu en el Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Los espermatozoides se recogen de ratones machos CD-1 de 8-16 semanas de edad. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de Weill Cornell Medicine.
1. Día antes del ensayo
<ol><li>
Preparación del cartucho del sensor y calibrador del analizador de flujo extracelular
	<ol>
<li>Para hidratar el cartucho del sensor, retire el cartucho del sensor del kit de ensayo de flujo extracelular XFe96 y colo...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular,...

La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células1,2,3,4,5.
Los espermatozoides son células móviles altamente especializadas; cuya tarea es entregar el genoma paterno al ovocitos. Los espermatozoides que salen del tracto reproductivo masculino después de la eyaculación siguen siendo funcionalmente inmaduros y no pueden fertilizar el ovocitos porque son incapaces de penetrar las vestiduras de los ovocitos. Los espermatozoides adquieren competencia de fertilización a medida que transitan por el tracto reproductivo femenino en un proceso de maduración conocido como capacitación6,7. Los espermatozoides o espermatozoides recién eyaculados diseccionados del epidídimo cauda pueden ser capacitados in vitro por incubación en medios de capacitación definidos que contengan Ca2+,bicarbonato (HCO3-) o un análogo de campo permeable a las células (por ejemplo, dibutiryl-cAMP), un aceptador de colesterol (por ejemplo, albúmina de suero de la bolina bovina, BSA) y una fuente de energía (por ejemplo, glucosa). Durante la capacitación, los espermatozoides modifican su patrón de motilidad en un latido flagelante asimétrico, representando un modo de natación llamado hiperactivación8,9, y se vuelven competentes para someterse a la reacción acrosomesa7, donde se liberan enzimas proteolíticas que digieren las vestiduras de los ovocitos. Estos procesos requieren energía, y similar a las células somáticas, espermatozoides generan ATP y otros compuestos de alta energía a través de la glucólisis, así como ciclo de TCA mitocondrial y fosforilación oxidativa (oxfos)10. Mientras que múltiples estudios demuestran que la glucólisis es necesaria y suficiente para apoyar la capacitación de espermatozoides11,12,13,14, la contribución de la oxfos es menos clara. A diferencia de otros tipos de células donde la glucólisis está físicamente acoplada al ciclo TCA, los espermatozoides están altamente compartimentados y se cree que mantienen estos procesos en compartimentos flagelantes separados: la pieza media concentra la maquinaria mitocondrial, mientras que las enzimas clave de la glucólisis parecen limitarse a la pieza principal15,16. Esta compartimentación da lugar a un debate en curso sobre si el piruvato producido en la pieza principal por glicólisis puede soportar oxfos mitocondriales en la pieza media, y si la ATP producida por los buperos en la pieza media sería capaz de difundirse lo suficientemente rápidamente a lo largo de la longitud del flagelo para apoyar los requisitos energéticos en partes distales de la pieza principal17,18,19. También hay apoyo de un papel para el oxfos en la capacitación de espermatozoides. El oxfos no sólo es más favorable energéticamente que la glucólisis, generando 16 veces más ATP que la glucólisis, sino que el volumen de la pieza media y el contenido mitocondrial están directamente relacionados con la aptitud reproductiva en las especies de mamíferos que presentan mayores grados de competencia entre los machos por las parejas20. Abordar estas preguntas requiere métodos para examinar las contribuciones relativas de la glucólisis y el oxfos durante la capacitación de los espermatozoides.
Tourmente et al. aplicaron un analizador de flujo extracelular de 24 polos para comparar el metabolismo energético de especies de ratones estrechamente relacionadas con parámetros de rendimiento de espermatozoides significativamente diferentes21. En lugar de reportar los valores basales de ECAR y OCR de espermatozoides no capacitados, aquí, adaptamos su método usando un analizador de flujo extracelular de 96 polos para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides de ratón en tiempo real. Desarrollamos un método que permite monitorear simultáneamente la glucólisis y el oxfos en tiempo real en esperma con la batida flagelos en hasta doce condiciones experimentales diferentes midiendo el flujo de oxígeno (O2)y protones (H+) (Figura 1A). Debido a la descomposición del piruvato para lactato durante la glucólisis y la producción de CO2 a través del ciclo TCA, los espermatozoides no capacitados y capacitados extruyen H+ en los medios de ensayo que son detectados por el analizador de flujo extracelular a través de fluoróforos sensibles A+-inmovilizados a la punta de la sonda de un cartucho de sensor. Paralelamente, el consumo de O2 por fosforilación oxidativa se detecta a través de fluoróforos sensibles a O2inmovilizados a la misma punta de sonda(Figura 1B). La detección efectiva del H+ liberado y o2 consumido requiere un búfer de espermatozoides modificado con baja capacidad de amortiguación sin bicarbonato o fenol rojo. Por lo tanto, para inducir la capacitación en ausencia de bicarbonato, adoptamos el uso de un campo analógico permeable a la célula inyectado junto con el inhibidor de PDE de amplio rango IBMX22. Tres puertos de inyección independientes adicionales permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores, lo que facilita la detección en tiempo real de los cambios en la respiración celular y la tasa de glucólisis debido a la manipulación experimental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H+- y O2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.

Este método utiliza un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la tasa de glucólisis y oxfos durante la capacitación del esperma del ratón. La Figura 4 muestra un experimento ejemplar donde los espermatozoides fueron capacitados en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-DG y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. El sustrato de energía en el tampón de flujo extracelular TYH y ...

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Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.

Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Este protocolo se puede utilizar para aplicar un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides. Desarrollamos este protocolo para comparar los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real entre espermatozoides de ratón no capacitados y capacitados. El día antes del ensayo, retire el cartucho del sensor de un kit de ensayo de flujo extracelular y coloque el cartucho boca abajo junto a la placa de utilidad.Llene un depósito de solución con 25 mililitros de agua destilada doble y agregue 200 microlitros de agua a cada pozo de la placa de servicio, luego coloque el cartucho del sensor de nuevo en la placa de servicio. Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius. A continuación, aliquot 25 mililitros de calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 mililitros y coloque el tubo en la incubadora de dióxido de carbono no carbono de 37 grados Celsius.Para preparar microplacas recubiertas con ConA, disolver 2,5 miligramos de ConA en cinco mililitros de agua doble destilada y utilizar una pipeta multicanal para llenar cada pozo de un analizador de flujo extracelular de placa de 96 pozos con 50 microlitros de la solución ConA, luego dejar la tapa abierta para dejar la placa seca durante la noche. Para preparar el tampón de espermatozoides, calienta 250 mililitros del analizador de flujo extracelular TYH buffer a 37 grados Celsius y ajusta el pH a 7.4. El día del ensayo, sustituya el agua de cada pozo de la placa de servicios públicos por 200 microlitros de calibrador XF por pozo y vuelva a colocar la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono durante al menos una hora.Para generar una plantilla de onda, active el analizador de flujo extracelular. Mientras la temperatura se está estabilizando a 37 grados Celsius, abra el software de onda y abra una plantilla en blanco. En la pestaña de definiciones de grupo, defina el medio de ensayo como TYH y el tipo de celda como esperma de ratón, dejando las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco.Cree diferentes grupos para cada condición de ensayo y abra el mapa de placas para asignar cada grupo a pozos específicos. En la pestaña protocolo, unhighlight equilibrate, agregue cada uno de los cuatro ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición para que se resalte la medida después de la inyección, luego guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y guarde los resultados. Antes de cosechar el esperma, precalienta 50 mililitros de tampón TYH a 37 grados Celsius.Después de cosechar caudas de ratones machos adultos, coloque cada cauda en 500 microlitros del tampón TYH precalentó en pozos individuales de un plato de 24 pozos. Utilice fórceps para inmovilizar cada cauda individualmente en la parte inferior de cada pozo y rápidamente haga de cinco a siete pequeñas incisiones en cada tejido usando tijeras de plumas. Cuando todas las caudas hayan sido incedidas, coloque inmediatamente la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono para permitir que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.Para cargar el cartucho del sensor, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Manteniendo la guía de carga del puerto en su lugar, inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto A e inyecte 20 microlitros de búfer TYH en cada columna. Para el puerto B, inyecte 22 microlitros de tyH buffer en las columnas uno a cuatro, 22 microlitros de 500 mililitros de 2-desoxiglucosa en columnas de cinco a ocho, y 25 microlitros de cinco antimicina micromolar A rotenona en columnas nueve a 12.Para el puerto C, inyecte 25 microlitros de tyH buffer en cada columna con números impares y 25 microlitros de 10 mililitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX en cada columna con números pares, luego coloque el cartucho del sensor con una placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tardará de 10 a 15 minutos. Para preparar las placas de esperma, agregue tres mililitros de tres miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina en tampón TYH a cada uno de los tres tubos centrífugos de cinco mililitros.A continuación, a la continuación, la piscina de dos pozos de espermatozoides en cada uno de los tres tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Después de contar, diluir el esperma a un dos veces 10 a la concentración de siete espermatozoides por mililitro por muestra en TYH fresco complementado con albúmina sérica bovina. Sedimentar el esperma por centrifugación y resuspender los gránulos de espermatozoides en un mililitro de tampón TYH.Centrifugar el esperma de nuevo y eliminar los sobrenadantes teniendo cuidado de no molestar los gránulos. Transfiera cada suspensión de espermatozoides a uno de los tubos de centrífuga de cinco mililitros preparados y agregue 180 microlitros de tampón TYH en cada pozo de esquina de una placa recubierta con ConA. Añadir 180 microlitros de esperma en cada pozo vacío de la placa recubierta de ConA y centrifugar la placa dos veces girando la placa 180 grados entre centrifugaciones, luego coloque la placa de calibración con la placa de esperma y continúe el ensayo.En este experimento representativo, los espermatozoides se capacitaron en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-desoxiglucosa y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. La flecha indica la inducción de la capacitación. En presencia de glucosa, la capacitación fue acompañada por un aumento de siete veces en la tasa de acidificación extracelular que se inhibe por el bloqueo de la glucólisis con 2-desoxiglucosa.Los espermatozoides capacitados demostraron un aumento de 20 veces en la tasa de consumo de oxígeno en comparación con los espermatozoides no capacitados que demuestran que los espermatozoides del ratón mejoran tanto la glucólisis como la fosforilación oxidativa para apoyar la creciente demanda de energía durante la capacitación. El aumento de la tasa de acidificación extracelular durante la capacitación de espermatozoides no se ve afectado por los inhibidores de la fosforilación oxidativa antimicina A y la rotenona, lo que indica que el cambio en esta tasa es impulsado principalmente por la liberación de hidrógeno de la glucólisis. El aumento en la tasa de consumo de oxígeno, sin embargo, está bloqueado por la antimicina A y la rotenona, así como por la 2-desoxiglucosa revelando que el aumento de OXPHOS durante la capacitación de espermatozoides depende de la actividad glucolítica.La fuente de energía y los activadores e inhibidores farmacológicos pueden variar dependiendo del objetivo del experimento y hasta 12 condiciones diferentes se pueden medir en paralelo. El protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies como la humana o la bovina donde los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación son igualmente enigmáticos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Investigación

Bioquímica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

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The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...