Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd från Dr Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller hög genomströmning och spektroskopi Resource Center.

Spermier samlas in från 8-16-veckors gamla CD-1 hanmöss. Djurförsök godkändes av Weill Cornell medicins institutionella djurvårds-och användnings kommitté (IACUC).
1. dag före analys
<ol><li>
Beredning av sensor patron och extracellulär Flux Analyzer kalibrant
	<ol>
<li>För att återfukta sensor patronen, ta bort sensor patronen från XFe96 extracellulära Flux assay kit och Placera sensorn patronen upp och ner bredvid verktyget plattan.</li>
		<li>Fyll en lösnin...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Förlusten av spermie kapacitet i avsaknad av vissa metaboliska substrat eller kritiska metaboliska enzymer avslöjade energimetabolism som en nyckelfaktor som stöder framgångsrik befruktning. En metabolisk switch under cell aktivering är ett väletablerat begrepp i andra celltyper, men vi är bara börjar förstå hur spermier anpassa sin metabolism till den ökande efterfrågan på energi under kapacitet. Med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer utvecklade vi ett lätt tillämpligt verktyg för att övervaka f?...

Tillämpningen av masspektrometri har revolutionerat studiet av metabolism. Riktad metabolisk profilering och metabolomiska spårning möjliggöra noggrann övervakning av förändringar i energimetabolism. Emellertid, utför metabolomik framgångsrikt kräver omfattande utbildning, erfaren personal, och dyra, mycket känsliga masspektrometrar inte lätt tillgängliga för varje laboratorium. Under de senaste åren, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer, såsom Seahorse XFe96 har vuxit populär som en surrogat metod för att mäta förändringar i energimetabolism i olika celltyper1,2,3,4,5.
Spermier är mycket specialiserade motila celler; vars uppgift är att leverera det faderliga genomet till äggocyten. Sperma som lämnar de manliga reproduktionsorganen efter utlösning är fortfarande funktionellt omogen och kan inte befrukta äggcell eftersom de inte kan tränga in i oocyters skruvor. Spermier förvärva fertilisering kompetens som de transitering genom den kvinnliga reproduktionsorganen i en mognande process som kallas capacitation6,7. Nyligen ejakulerade spermier eller spermier dissekeras från cauda bitestiklarna kan kapas in vitro genom inkubation i definierade kapacitet media som innehåller ca2 +, bikarbonat (HCO3-) eller en cell-permeable Camp analog (t. ex., dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (t. ex., bovint serum albumin, BSA), och en energikälla (t. ex., glukos). Under kapacitet, spermier ändra deras motilitet mönster i en asymmetrisk flagellar Beat, som representerar en simning läge som kallas hyperaktivering8,9, och de blir behöriga att genomgå den acrosome reaktion7, där proteolytiska enzymer frigörs att smälta oocyterna ' s vestments. Dessa processer kräver energi, och liknar somatiska celler, spermier generera ATP och andra hög energi föreningar via glykolys samt mitokondriell TCA cykel och oxidativ fosforylering (oxfos)10. Medan flera studier visar att glykolys är nödvändig och tillräcklig för att stödja spermier kapacitet11,12,13,14, bidraget av oxfos är mindre tydlig. I motsats till andra celltyper där glykolys är fysiskt kopplad till TCA-cykeln, spermier är mycket uppdelade och tros upprätthålla dessa processer i separata flagellar utrymmen: den midpiece koncentrerar mitokondriella maskiner, medan de viktigaste enzymerna av glykolys verkar vara begränsad till den viktigaste pjäs15,16. Denna uppdelning resulterar i en pågående debatt om huruvida pyruvat produceras i huvuddelen av glykolys kan stödja mitokondriella oxfos i mittpunkten, och om ATP produceras av oxfos i mellanstycket skulle kunna sprida tillräckligt snabbt längs längden av flagellen se att stödja energibehovet i distala delar av det viktigaste pjäs17,18,19. Det finns också stöd för en roll för oxfos i spermie kapacitet. Inte bara oxfos mer energiskt gynnsam än glykolys, genererar 16 gånger mer ATP än glykolys, men midpiece volym och mitokondriellt innehåll är direkt korrelerade med reproduktiv kondition i däggdjursarter som uppvisar större grad av konkurrens mellan män för kompisar20. Att ta itu med dessa frågor kräver metoder för att undersöka de relativa bidragen från glykolys och oxfos under spermie kapacitet.
Tourmente et al. tillämpat en 24-brunn extracellulär Flux Analyzer för att jämföra energimetabolism av närbesläktade mus arter med betydligt olika spermie prestandaparametrar21. Istället för att rapportera de basala ECAR och OCR värden av icke-kondenserad sperma, här anpassar vi sin metod med hjälp av en 96-väl extracellulära Flux Analyzer för att övervaka förändringar i energimetabolism under mus spermier kapacitet i realtid. Vi utvecklade en metod som gör det möjligt att samtidigt övervaka glykolys och oxfos i realtid i spermier med att slå flageller i upp till tolv olika experimentella förhållanden genom att mäta flödet av syre (O2) och protoner (H+) (figur 1a). På grund av nedbrytningen av pyruvat till laktat under glykolys och produktion av CO2 via TCA-cykeln, icke-kondenserad och kondenserad sperma extrudera H+ in i analysen media som upptäcks av extracellulära Flux Analyzer via H+-känsliga fluoroforer immobiliserade till sonden spetsen av en sensor patron. Parallellt med detta upptäcks O2 -konsumtionen genom oxidativ fosforylering via O2-känsliga fluoroforer immobiliserade till samma sond spets (figur 1b). Effektiv detektering av den släppta H+ och konsumeras O2 kräver en modifierad spermie buffert med låg buffring kapacitet utan bikarbonat eller fenolrött. Sålunda, för att inducera kapacitet i avsaknad av bikarbonat, vi antog användningen av en cell-permeable cAMP analog injiceras tillsammans med brett spektrum PDE inhibitor IBMX22. Tre ytterligare oberoende injektions portar möjliggör injektion av farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare, vilket underlättar realtidsdetektering av förändringar i cellandningen och glykolysfrekvens på grund av experimentell manipulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Spermier från däggdjur förvärvar fertiliseringsförmåga i de kvinnliga reproduktionsorganen i en process som kallas kapacitet. Kapacitet-associerade processer kräver energi. Det återstår en pågående debatt om de källor som genererar ATP som bränslen spermier progressiv motilitet, kapacitet, hyperaktivering, och acrosome reaktion. Här beskriver vi tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer som ett verktyg för att analysera förändringar i energimetabolism under mus spermie kapacitet. Med hjälp av H+-och O2-känsliga fluoroforer, denna metod gör det möjligt att övervaka glykolys och oxidativ fosforylering i realtid i icke-kondenserad kontra politiker spermier. Med hjälp av denna analys i närvaro av olika energisubstrat och/eller farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare kan ge viktiga insikter i bidraget från olika metaboliska vägar och skärningspunkten mellan signalering kaskader och metabolism under sperma kapacitet.

Denna metod använder en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i graden av glykolys och oxfos under mus spermie kapacitet. Figur 4 visar en exemplarisk experiment där spermier var kondenserad i närvaro av glukos som enda energisubstrat och 2-DG och a och Rotenon som farmakologiska modulatorer. Energi underlaget i den extracellulära Flux Analyzer TYH buffert och farmakologiska modulatorer kan väljas fritt beroende på mål...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Vi beskriver tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet.

Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Detta protokoll kan användas för att tillämpa en extracellulär flux analysator för att övervaka förändringar i energimetabolism under spermier kapacitering. Vi utvecklade detta protokoll för att jämföra förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering i realtid mellan icke-kapacierade och kapacierade mus spermier. Dagen före analysen tar du bort sensorpatronen från en extracellulär fluxanalyssats och placerar patronen upp och ned bredvid bruksplattan.Fyll en lösning reservoar med 25 milliliter dubbel destillerat vatten och tillsätt 200 mikroliter vatten till varje brunn av verktyget plattan, sedan placera sensorn patronen tillbaka i verktyget plattan. Placera plattan i en 37 grader Celsius icke-koldioxid inkubator. Därefter alikvot 25 milliliter extracellulära flux analysator calibrant i en 50 milliliter koniska röret och placera röret i 37 grader Celsius icke-koldioxid inkubator.För att förbereda ConA belagda mikroplattor, lös 2,5 milligram ConA i fem milliliter dubbel destillerat vatten och använda en flerkanalig pipett för att fylla varje brunn av en extracellulär flux analysator 96-brunnsplatta med 50 mikroliter av ConA-lösningen, lämna sedan locket öppet för att låta plattan torka över natten. För att förbereda spermabufferten, värm 250 milliliter extracellulära fluxanalysator TYH buffert till 37 grader Celsius och justera pH till 7,4. På dagen för analysen, byt ut vattnet i varje brunn av bruksplåten med 200 mikroliter av XF calibrant per brunn och placera plattan tillbaka i icke-koldioxidinkubatorn i minst en timme.Om du vill generera en vågmall slår du på den extracellulära fluxanalysatorn. Medan temperaturen stabiliseras till 37 grader Celsius, öppna vågprogramvaran och öppna en tom mall. Under fliken gruppdefinitioner definierar du analysmediet som TYH och celltypen som musspermier, vilket gör att injektionsstrategierna och förbehandlingarna blir tomma.Skapa olika grupper för varje analysvillkor och öppna plattkartan för att tilldela varje grupp till specifika brunnar. Under fliken protokoll, unhighlight jämvikt, lägga till var och en av fyra olika mätcykler, välj respektive port och redigera mätdetaljerna så att måttet efter injektionen markeras, sedan spara assay-mallen, fyll i projektsammanfattningen och spara resultaten. Före skörden av spermierna, prewarm 50 milliliter AV TYH buffert vid 37 grader Celsius.Efter skörd caudas från vuxna handjur möss, placera varje cauda i 500 mikroliter av den förvuppvade TYH buffert i enskilda brunnar av en 24-brunns platta. Använd forceps för att immobilisera varje cauda individuellt i botten av varje brunn och snabbt göra fem till sju små snitt i varje vävnad med hjälp av fjäder sax. När alla caudas har incised, omedelbart placera plattan i icke-koldioxid inkubatorn så att spermierna att skingra i 15 minuter.För att ladda sensorkassetten, ta bort locket från sensorkassetten och rikta in bokstaven för respektive portladdningsguide med patronens övre vänstra hörn. Håll portlastningsguiden på plats, sätt in pipettspetsarna vertikalt i portens lastningsguidehål i port A och injicera 20 mikroliter AV TYH-buffert i varje kolumn. För port B, injicera 22 mikroliter av TYH buffert i kolumnerna en till fyra, 22 mikroliter på 500 millimolar 2-deoxyglucose i kolumner fem till åtta, och 25 mikroliter av fem mikromolar antimycin A rotenon i kolumner nio till 12.För port C, injicera 25 mikroliter av TYH buffert i varje kolumn med udda siffror och 25 mikroliter på 10 millimolar av dibutyryl-cykliska AMP 500 mikromolar IBMX i varje kolumn med jämna nummer, sedan placera sensorn patronen med en kalibreringsplatta i extracellulära flux analysatorn och starta analysen. Kalibreringen tar 10 till 15 minuter. För att förbereda spermier plattor, tillsätt tre milliliter av tre milligram per milliliter nötkreatur serum albumin i TYH buffert till var och en av tre fem milliliter centrifugrör.Därefter pool två brunnar av spermier i var och en av tre 1,5 milliliter centrifugrör. Efter räkning, späda spermierna till en två gånger 10 till de sju spermier per milliliter koncentration per prov i färska TYH kompletteras med bovin serum albumin. Sediment sperma genom centrifugering och resuspend spermier pellets i en milliliter av TYH buffert.Centrifugera spermierna igen och ta bort supernatanterna noga med att inte störa pellets. Överför varje spermiefjädring i ett av de beredda fem millilitercentrifugerören och tillsätt 180 mikroliter av TYH-buffert i varje hörnväl av en ConA-belagd platta. Lägg till 180 mikroliter av spermier i varje tom brunn av ConA-belagd platta och centrifug plattan två gånger roterande plattan 180 grader mellan centrifugering, sedan placera kalibreringsplattan med spermierna platta och fortsätta analysen.I detta representativa experiment var spermier kapaciterade i närvaro av glukos som enda energi substrat och 2-deoxyglucose och antimycin och rotenon som de farmakologiska modulators. Pilen indikerar induktion av kapacitation. I närvaro av glukos, capacitation åtföljdes av en sjufaldig ökning av extracellulära försurningshastighet som hämmas genom att blockera glykolys med 2-deoxyglucose.Kapaciterade spermier visat en 20-faldig ökning av syreförbrukning jämfört med icke-kapaciterade spermier som visar att mus spermier förbättra både glykolys och oxidativ fosforylering för att stödja den ökande efterfrågan på energi under kapacitering. Ökningen av den extracellulära försurningsgraden under sperma kapacitation påverkas inte av de oxidativa fosforyleringshämmare antimycin A och rotenon som visar att förändringen i denna takt huvudsakligen drivs av väteutsläpp från glykolys. Ökningen av syreförbrukningshastigheten blockeras dock av antimycin A och rotenon samt av 2-deoxyglucose avslöjar att ökningen av OXPHOS under sperma kapalylering är beroende av glykolytisk aktivitet.Energikällan och farmakologiska aktivatorer och inhibitorer kan varieras beroende på målet med försöket och upp till 12 olika förhållanden kan mätas parallellt. Protokollet kan lätt anpassas till andra arter som människa eller nötkreatur där förändringarna i energiomsättningen under kapajakation är lika gåtfulla.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Mycket känslig och snabb fluorescensdetektion med en bärbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkompetitionsanalys för fosforyleringsställningsbestämning

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Nonradioactive Analys för att mäta Polynukleotid Fosforylering av små Nukleotid Substrat

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En snabb, opartisk fluorescerande metod för att upptäcka förändringar i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimerad enmolekylär pull-down-analys för kvantifiering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...