Name: using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Yazarlar Rockefeller Yüksek Throughput ve Spektroskopi Kaynak Merkezi'nde Dr Lavoisier Ramos-Espiritu destek kabul etmek istiyorum.

Spermler 8-16 haftalık CD-1 erkek farelerden toplanır. Hayvan deneyleri Weill Cornell Medicine'in Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tsamadan önceki gün
<ol><li>
Sensör kartuşunun ve hücre dışı akı analizörü kallibrantının hazırlanması
	<ol>
<li>Sensör kartuşunu nemlendirmek için sensör kartuşunu XFe96 Hücre Dışı Akı Çıkış Kiti'nden çıkarın ve sensör kartuşunu servis plakasının yanına t...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T.">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li><li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li><li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12/E1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype.">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54 (2009).</li><li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77.">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li><li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes.">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li><li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization.">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li><li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa.">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li><li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+hyperactivation+in+sperm.">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li><li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation.">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse:+the+influence+of+glucose.">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li><li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoglycerate+kinase+2+(PGK2)+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice.">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li><li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S,+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme,+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li><li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+(mHk1-s)+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail.">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li><li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa.">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li><li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella.">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li><li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm.">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li><li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm.">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li><li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection:+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size.">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li><li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species.">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li><li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals.">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li><li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation.">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li><li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation.">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li></ol>

Bazı metabolik substratların veya kritik metabolik enzimlerin yokluğunda sperm kapaizatif kaybı başarılı döllenmeyi destekleyen önemli bir faktör olarak enerji metabolizmasını ortaya koymuştur. Hücre aktivasyonu sırasında bir metabolik geçiş diğer hücre tiplerinde köklü bir kavramdır, ancak, biz sadece nasıl sperm kapasiasyon sırasında artan enerji talebine metabolizmaadapte anlamaya başlıyor. Hücre dışı akı analizörü kullanarak, sperm kapasitasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fos...

Kütle spektrometresi uygulaması metabolizma çalışmalarında devrim yarattı. Hedeflenen metabolik profilleme ve metabolomik izleme, enerji metabolizmasındaki değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. Ancak, metabolomik performans başarıyla kapsamlı eğitim gerektirir, deneyimli personel, ve pahalı, son derece hassas kütle spektrometreler her laboratuvar için hazır değil. Son yıllarda, bir hücre dışı akı analizörü kullanarak, Seahorse XFe96 gibi çeşitli hücre tiplerinde enerji metabolizmasında ki değişiklikleri ölçmek için bir vekil yöntemi olarak popüler büyüdü1,2,3,4,5.
Sperm son derece özel hareketli hücrelerdir; kimin görevi yumurta için baba genomu teslim etmektir. Boşaldıktan sonra erkek üreme sisteminden ayrılan spermler hala işlevsel olarak olgunlaşmamış durumdadır ve yumurtaların yeleklerine giremedikleri için yumurtayı dölleyemezler. Onlar kapacitation6,7olarak bilinen bir olgunlaşma sürecinde kadın üreme sistemi ile transit olarak Sperm döllenme yetkinliği elde . Cauda epididimisinden yeni boşalan sperm veya sperm, Ca2+içeren tanımlanmış kapasitasyon ortamlarında inkübasyon veya hücregeçirgen cAMP analogu (örn. dibutyryl-cAMP), kolesterol kabul verici (örneğin, sığır serum albumini, BSA) ve bir enerji kaynağı (örneğin, glikoz). Kapacitation sırasında, sperm asimetrik kamçı ritmi içine hareketlilik deseni değiştirmek, hiperaktivasyon denilen bir yüzme modu temsil 8,9, ve onlar akrozom reaksiyonu geçmesi için yetkili hale7, proteolitik enzimler yumurtaların vestments sindirmek serbest bırakılır. Bu süreçler enerji gerektirir ve somatik hücrelere benzer, sperm glikoliz yanı sıra mitokondriyal TCA döngüsü ve oksidatif fosfor (oksfos)10yoluyla ATP ve diğer yüksek enerjibileşikleri üretmek . Birden fazla çalışma glikoli gerekli ve sperm kapacitation desteklemek için yeterli olduğunu göstermek iken11,12,13,14, okfos katkısı daha az açıktır. Glikolisfiziksel TCA döngüsü ile birleştiğinde diğer hücre türlerinin aksine, sperm son derece bölümlere ayrılmıştır ve ayrı kamer bölmelerinde bu süreçleri korumak için düşünülmektedir: midpiece mitokondriyal makine konsantreleri, glikoli anahtar enzimleri ana parça 15 ile sınırlı gibi görünür ise16. Bu bölümleme, glikoliz tarafından ana parçada üretilen pirüvatın orta parçadaki mitokondriyal okfosu destekleyip desteklemeyeceği ve orta parçada oxphos tarafından üretilen ATP'nin anaparçanın 17,18,19'undistal kısımlarındaki enerji gereksinimlerini desteklemek için kamçının uzunluğu boyunca yeterince hızlı bir şekilde yayılıp dağıtılamayacağı konusunda devam eden bir tartışmayla sonuçlanır. Ayrıca sperm kapasitasyonunda oksfos rolü desteklenir. Sadece oxphos glikoliz daha enerjik olumlu, glikoliz daha 16 kat daha fazla ATP üreten, ancak orta hacim ve mitokondriyal içerik doğrudan eşleri için erkekler arasında rekabet daha büyük derece sergileyen memeli türlerinde üreme fitness ile ilişkilidir20. Bu soruların ele alınması, sperm kapanizasyonu sırasında glikoli ve okfosun göreceli katkılarını incelemek için yöntemler gerektirir.
Tourmente ve ark. 24-iyi ekstrasellüler akı analizörü uygulanan önemli ölçüde farklı sperm performans parametreleri ile yakından ilişkili fare türlerinin enerji metabolizmasını karşılaştırmak için21. Kapasitif olmayan spermin bazal ECAR ve OCR değerlerini raporlamak yerine, fare sperm kapaizasyonu sırasında ki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için 96 kuyulu hücre dışı akı analizörü kullanarak metodlarını uyarlıyoruz. Oksijen (O2) ve proton (H+)(Şekil 1A)akını ölçerek, spermde glikoliz ve okfosların on iki farklı deneysel koşullarda kamçıyı yenerek gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Glikoliz sırasında laktat için piruvat ın bozulması ve TCA-döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, kapasite olmayan ve kapasitasyonlu sperm ekstrüzyonu H+ ispret media içine h+-hassas floropores ile algılanan bir sensör kartuşunun prob ucuna hareketsiz. Buna paralel olarak, oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimi aynı prob ucuna hareketsiz hale getirilen O2-duyarlı florofores ile tespit edilir(Şekil 1B). Serbest bırakılan H+ ve tüketilen O2 etkili tespiti bikarbonat veya fenol kırmızı olmadan düşük tamponlama kapasitesi ile değiştirilmiş bir sperm tampon gerektirir. Böylece, bikarbonat yokluğunda kapacitation indüklemek için, geniş menzilli PDE inhibitörü IBMX22ile birlikte enjekte bir hücre geçirgen cAMP analog kullanımını kabul etti. Üç ek bağımsız enjeksiyon portu farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin enjeksiyonuna izin verir, bu da deneysel manipülasyon nedeniyle hücresel solunum ve glikoliz hızındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak algılanmasını kolaylaştırır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375</td>
			<td>2-DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1470</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7381</td>
			<td>ConA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567761</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-Dibutyryladenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>db-cAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13995</td>
			<td>Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 10-100 &#956;L</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>ES-12-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipette 50-300 &#956;L</td>
			<td>vwr</td>
			<td>613-5257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C, non-CO2 incubator</td>
			<td>vwr</td>
			<td>1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL cetrifuge tubes</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30119380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>vwr</td>
			<td>76211-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with plate adapter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IEC FL40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope with 40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an extracellular flux analyzer to measure changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation

Memeli spermleri kapacitation olarak bilinen bir süreç içinde kadın üreme sisteminde döllenme kapasitesi elde. Kapacitation ile ilişkili süreçler enerji gerektirir. Sperm progresif hareketliliği, kapasitasyon, hiperaktivasyon ve akrozom reaksiyonunu besleyen ATP'yi üreten kaynaklar hakkında devam eden tartışmalar devam etmektedir. Burada, fare sperm kapamanı sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için bir araç olarak hücre dışı akı analizörü uygulaması açıklar. H+ve O2- hassas floropores kullanarak, bu yöntem glikoliz ve oksidatif fosforilasyon un kapasitif olmayan ve kapasitif sperm gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Farklı enerji yüzeyleri ve/veya farmakolojik aktivatörler ve/veya inhibitörlerin varlığında bu titreşmenin kullanılması, farklı metabolik yolların katkısı ve sperm kapacitation sırasında sinyal basamakları ile metabolizma arasındaki kesişim hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Bu yöntem, fare sperm kapamansırasında glikoliz ve oksfos oranındaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü kullanır. Şekil 4, farmakolojik modülatörler olarak tek enerji substratı ve 2-DG ve antimisin ve rotenon olarak glikoz varlığında spermin kapasitif olduğu örnek bir deney göstermektedir. Ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponundaki enerji substratı ve farmakolojik modülatörler deneyin amac?...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation at JoVE.com

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Fare sperm kapamanı sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü uygulamasını tanımladık.

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Bu protokol sperm kapaizasyonu sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri izlemek için bir hücre dışı akı analizörü uygulamak için kullanılabilir. Bu protokolü, kondansatif olmayan ve kapasitif fare spermi arasındaki glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak karşılaştırmak için geliştirdik. Tramadan bir gün önce, sensör kartuşunu hücre dışı akı temizleme kitinden çıkarın ve kartuşun ubeyv plakasının yanına ters yerleştirin.Bir çözelti haznesini 25 mililitre çift distile suyla doldurun ve kullanım plakasının her kuyuya 200 mikrolitre su ekleyin, ardından sensör kartuşunu tekrar servis plakasına yerleştirin. Plakayı 37 derece karbondioksit olmayan bir kuvöze yerleştirin. Sonra, 50 mililitrekonik tüp içine ekstrasellüler akı analizörü calibrant 25 mililitre aliquot ve 37 derece santigrat anti-karbondioksit kuluçka içine tüp yerleştirin.ConA kaplı mikro plakalar hazırlamak için, çift distile su beş mililitre ConA 2,5 miligram eritmek ve ConA çözeltisi 50 mikrolitre ile bir ekstrasellüler akı analizörü 96-iyi plaka her kuyu doldurmak için çok kanallı pipet kullanın, sonra plaka bir gecede kurumasını sağlamak için kapağı açık bırakın. Sperm tamponunu hazırlamak için 250 mililitre ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponunu 37 dereceye ısıtın ve pH'ı 7,4 dereceye ayarlayın. Teşbibin olduğu gün, yardımcı plakanın her kuyudaki suyu kuyu başına 200 mikrolitre XF kalibrant ile değiştirin ve plakayı en az bir saat boyunca karbondioksit olmayan kuvöze geri yerleştirin.Dalga şablonu oluşturmak için hücre dışı akı çözümleyicisini açın. Sıcaklık 37 santigrat dereceye sabitlenirken, dalga yazılımını açın ve boş bir şablon açın. Grup tanımları sekmesinde, assay ortamını TYH, hücre tipini fare spermi olarak tanımlayarak enjeksiyon stratejilerini ve ön işlemleri boş bırakabilirsiniz.Her bir teşp koşulu için farklı gruplar oluşturun ve her grubu belirli kuyulara atamak için plaka haritasını açın. Protokol sekmesinin altında, dengeleyin, dört farklı ölçüm döngüsünün her birini ekleyin, ilgili bağlantı noktasını seçin ve enjeksiyondan sonraki ölçünün vurgulanması için ölçüm ayrıntılarını edin, ardından tahkikat şablonuna kaydedin, proje özetini doldurun ve sonuçları kaydedin. Spermhasat önce, 37 santigrat derece TYH tampon 50 mililitre önceden ısıtın.Yetişkin erkek farelerden cauda hasat ettikten sonra, her kauda'yı önceden ısıtılmış TYH tamponunun 500 mikrolitresine yerleştirin. Her kuyunun alt kısmında ayrı ayrı her kauda hareketsizleştirmek için forceps kullanın ve hızlı bir şekilde tüy makası kullanarak her dokuda beş ila yedi küçük kesiler yapmak. Tüm cauda'lar indiktif edildiğinde, hemen plakayı karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin ve spermin 15 dakika boyunca dağılmasını bekleyin.Sensör kartuşunu yüklemek için, sensörün kartuşunun kapağını çıkarın ve ilgili bağlantı noktası yükleme kılavuzunun harfini kartuşun sol üst köşesine hizalayın. Bağlantı noktası yükleme kılavuzunu yerinde tutarak, pipet uçlarını A portunun bağlantı noktası yükleme kılavuzu deliklerine dikey olarak yerleştirin ve her kolona 20 mikrolitre TYH tampon enjekte edin. B limanı için, 22 mikrolitre TYH tamponunu 1'den 4'e kadar sütunlara, 500 milimolar 2-deoksigluküllü 2-deoksigluküllü 22 mikrolitreyi beş ila sekiz arasında sütunlara ve 25 mikrolitre beş mikromolar antimisin A rotenonunu 9'dan 12'ye kadar sütunlara enjekte edin.C limanı için, her sütuna tek sayılarve 25 mikrolitre dibutyryl-siklik AMP 500 mikromolar IBMX ile 25 mikrolitre TYH tampon enjekte edin, ardından sensör kartuşunu kalibrasyon plakalı bir kalibrasyon plakalı hücre dışı akı analizörüne yerleştirin ve taramaya başlayın. Kalibrasyon 10 ila 15 dakika sürer. Sperm plakalarını hazırlamak için, üç beş mililitrelik santrifüj tüplerinin her birine TYH tamponunda mililitre büyükbaş hayvan serum albumini başına üç mililitre ekleyin.Sonra, üç 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerin her içine sperm havuz iki kuyu. Saydıktan sonra, büyükbaş hayvan serum albumini ile takviye taze TYH örnek başına mililitre konsantrasyonu başına yedi sperm iki kez 10 için sperm seyreltin. Spermi santrifüj ile tortula çökün ve tyh tamponunun bir mililitresinde sperm peletlerini yeniden askıya alın.Tekrar sperm santrifüj ve pelet rahatsız etmemeye dikkat supernatants kaldırın. Her sperm süspansiyonu hazırlanan beş mililitrelik santrifüj tüplerinden birine aktarın ve ConA kaplamalı bir plakanın her köşesine 180 mikrolitre TYH tampon ekleyin. ConA kaplamalı plakanın her boş kuyuya 180 mikrolitre sperm ekleyin ve plakayı santrifüjler arasında 180 derece döndürerek iki kez santrifüj edin, sonra kalibrasyon plakasını sperm plakası ile yerleştirin ve taramaya devam edin.Bu temsili deneyde, sperm sadece enerji substratı ve 2-deoksiglukoz ve antimisin ve farmakolojik modülatörler olarak rotenon olarak glikoz varlığında kapasitiyon edildi. Ok, kapacitation indüksiyongösterir. Glikoz varlığında, kapacitation 2-deoksiglukoz ile glikoli bloke tarafından inhibe ekstrasellüler asitleşme hızında yedi kat artış eşlik etti.Kapasitif sperm, kapasitif olmayan sperme kıyasla oksijen tüketim hızında 20 kat artış gösterdi ve fare sperminin kapasiasyon sırasında artan enerji talebini desteklemek için hem glikoliz hem de oksidatif fosforilasyonun arttığını gösterdi. Sperm kapaizasyonu sırasında ekstrasellüler asitleşme hızındaki artış oksidatif fosforilasyon inhibitörleri antimisin A ve rotenon bu orandaki değişimin esas olarak glikolizden hidrojen salınımı ile kaynaklandığını gösterir. Oksijen tüketim hızındaki artış, ancak, antimisin A ve rotenon yanı sıra sperm kapaji sırasında OXPHOS artış glikolitik aktiviteye bağlı olduğunu ortaya koyan 2-deoksiglukoz tarafından bloke edilir.Enerji kaynağı ve farmakolojik aktivatörler ve inhibitörler deneyin amacına bağlı olarak çeşitli olabilir ve 12 farklı koşullara paralel olarak ölçülebilir. Protokol, kapacitation sırasında enerji metabolizmasındaki değişikliklerin eşit derecede esrarengiz olduğu insan veya büyükbaş hayvan gibi diğer türlere kolayca adapte edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...