Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

نشكر السيد غريغوري شنايتر على المساعدة التقنية في بيانات قياس التدفق الخلوي. البروفيسور موريل كوينديت (مختبر العقاقير ، كلية العلوم الصيدلانية ، وجامعة جنيف) للسماح باستخدام مقياس التدفق الخلوي Attune والمجهر عالي الإنتاجية Cytation 3 ؛ البروفيسورة بريجيت بيتيت للنصائح العلمية.

امتثل بروتوكول الدراسة لإعلان هلسنكي ، وقدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة. يتم الحصول على عينات الجلد من النساء الأصحاء اللائي يخضعن لعملية شد البطن في قسم الجراحة التجميلية والترميمية والتجميلية في مستشفيات جامعة جنيف (جنيف ، سويسرا). يتوافق الإجراء مع مبادئ إع...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

تشمل مزايا استخدام الخلايا الليفية الذاتية كبديل طبيعي مقارنة بمواد الحشو الأخرى في علاج خلايا الجرح التوافق الحيوي الجيد ، والحد الأدنى من الآثار الجانبية ، وسهولة الحصاد والاستخدام. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه العلاجات في بيئة سريرية يومية ، من الضروري إجراء دراسات قبل سريرية مناسبة لتح?...

يهدف الطب التجديدي إلى شفاء أو استبدال الأنسجة والأعضاء التي تضررت بسبب العمر أو المرض أو الصدمة بالإضافة إلى تصحيح العيوب الخلقية. في العلاج الذاتي ، يتم سحب الخلايا أو الأنسجة من المريض ، أو توسيعها أو تعديلها ، ثم إعادة إدخالها إلى المتبرع. هذا النوع من العلاجات له إمكانات واسعة في مجال الأمراض الجلدية1. في علاج الخلايا الليفية الذاتية ، يتم زراعة الخلايا الليفية للمريض وإعادة حقنها لعلاج التجاعيد أو القوافي أو ندبات حب الشباب. نظرا لأن الخلايا الليفية هي الخلايا الوظيفية الرئيسية في الأدمة ، فقد يكون حقن الخلايا الليفية الذاتية أكثر فائدة من العلاجات الأخرى في تجديد شباب الوجه2.
في الجلد ، تكون الخلايا الليفية مسؤولة عن تخليق وإفراز البروتينات خارج الخلية (مثل الكولاجين والإيلاستين وحمض الهيالورونيك والجليكوزامينوجليكان). كما أنها تطلق عوامل النمو التي تنظم وظيفة الخلية ، والهجرة ، وتفاعلات مصفوفة الخلية / الخلية في توازن الجلد الطبيعي والتئام الجروح3. تم بالفعل إدخال الخلايا الليفية الجلدية كعلاج خلوي سريري محتمل لالتئام جروح الجلد4 ، أو تجديد الأنسجة5 ، أو الحشوات الجلدية في إجراءات الجراحة التجميليةوالتجميلية 6. حتى أن بعض الدراسات تشير إلى أنه في سياق الطب التجديدي ، قد تكون الخلايا الليفية علاجا خلويا أكثر عملية وفعالية من الخلايا الجذعية الوسيطة7.
للحصول على عدد كاف من الخلايا الليفية للتطبيقات السريرية ، عادة ما يكون توسيع الخلايا إلزاميا. تتطلب زراعة الخلايا خارج الجسم الحي / في المختبر وسطا قاعديا مكملا بعوامل النمو والبروتينات والإنزيمات لدعم التصاق الخلايا وتكاثرها. مصل الجنين البقري (FBS) هو مكمل شائع لوسائط زراعة الخلايا ، لأن دم الجنين 1) غني بعوامل النمو مقارنة بدم البالغين و 2) يقدم محتوى منخفض من الأجسام المضادة8. مع تقدم العلاج الخلوي، هناك مخاوف بشأن سلامة ظروف زراعة الخلايا الكلاسيكية التي يضاف فيها FBS إلى وسط الثقافة. وعلاوة على ذلك، هناك الآن ميل إلى الاستعاضة عن FBS بالبدائل9. أظهرت العديد من بدائل FBS نتائج واعدة10.
تم اختيار بديل البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) هنا ، وقمنا بتطوير جهاز طبي لإنتاج مستحضر موحد من PRP ، يسمى CuteCell-PRP. الاستخدام المقصود لهذا الجهاز هو إعداد PRP ذاتي المنشأ لاستخدامه كمكمل وسائط استزراع للتوسع في المختبر للخلايا الذاتية في ظل ظروف GMP.
يعرف PRP بأنه تعليق الصفائح الدموية المركز في البلازما. نظرا لوجود العديد من بروتوكولات التحضير ، والتي تختلف في 1) كمية الدم اللازمة ، 2) أنواع الأجهزة المستخدمة ، و 3) بروتوكول الطرد المركزي ، فإن تركيزات الصفائح الدموية الناتجة تختلف من أعلى قليلا إلى أكثر من 10 أضعاف قيمة خط الأساس للدم. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي مستحضرات PRP على مستويات متغيرة من تلوث خلايا الدم الحمراء والبيضاء. وهكذا يستخدم مصطلح "PRP" لوصف المنتجات التي تختلف اختلافا كبيرا في تكوينها البيولوجي وآثارها العلاجية المحتملة.
في معظم الدراسات ، يتم تحقيق استبدال FBS باستخدام تركيزات مختلفة من PRP التي يتم تنشيطها (بواسطة الثرومبين أو الكالسيوم). يثير هذا التنشيط الاصطناعي إطلاقا فوريا ومهما لعوامل نمو الصفائح الدموية من 15 دقيقة حتى 24 ساعة11. لذلك ، يعتقد أن تنشيط الصفائح الدموية غير مرغوب فيه للتطبيقات في مزارع الخلايا ، حيث يلزم الإطلاق البطيء لعوامل النمو من تحلل الصفائح الدموية التدريجي.
يتضمن علاج PRP تحضير الصفائح الدموية الذاتية في البلازما المركزة12. التركيز الأمثل للصفائح الدموية غير واضح ، وتتوفر مجموعة واسعة من الأجهزة التجارية لإعداد PRP13. ينتج هذا النقص في التوحيد القياسي عن عدم الاتساق بين الدراسات وأدى إلى صندوق أسود فيما يتعلق بجرعة الحقن وتوقيتها. يصف هذا البروتوكول إجراء للحصول على PRP ذاتي المنشأ باستخدام جهاز PRP المخصص هذا لتوسيع الخلايا الليفية الجلدية في نموذج ثقافة خارج الجسم الحي ذاتي المنشأ بنسبة 100٪.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

يوجد حاليا اهتمام سريري كبير باستخدام الخلايا الليفية الذاتية لإصلاح الجلد. في معظم الحالات ، مطلوب زراعة خلايا الجلد في المختبر. ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا باستخدام وسائط الثقافة الزينوجينية أو الخيفية لها بعض العيوب (أي خطر انتقال العوامل المعدية أو بطء توسع الخلايا). هنا ، تم تطوير نظام زراعة ذاتي لتوسيع خلايا الخلايا الليفية للجلد البشري في المختبر باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخاصة بالمريض (PRP). يتم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية عن المريض أثناء خضوعه لعملية شد البطن. تتم متابعة الثقافات لمدة تصل إلى 7 أيام باستخدام وسط مكمل إما بمصل بقري الجنين (FBS) أو PRP. يتم تقييم محتوى خلايا الدم في الاستعدادات PRP ، والانتشار ، وتمايز الخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول طريقة الحصول على إعداد موحد وغير نشط ل PRP باستخدام جهاز طبي مخصص. يتطلب التحضير فقط جهازا طبيا (CuteCell-PRP) وأجهزة طرد مركزي. هذا الجهاز مناسب في ظل ظروف الممارسة الطبية الكافية وهو نظام مغلق من خطوة واحدة وخالي من الحيوية ومعقم يتطلب طردا مركزيا واحدا ناعما يبلغ 1500 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل مكونات الدم ، ويتم جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية بسهولة. يسمح هذا الجهاز بإعداد سريع ومتسق وموحد ل PRP يمكن استخدامه كمكمل لزراعة الخلايا للتوسع في المختبر للخلايا البشرية. يحتوي PRP الذي تم الحصول عليه هنا على تركيز 1.5 ضعف الصفائح الدموية مقارنة بالدم الكامل معا ، مع إزالة تفضيلية لخلايا الدم الحمراء والبيضاء. تبين أن PRP يقدم تأثيرا معززا في تكاثر الخلايا مقارنة ب FBS (7.7x) وأن الخلايا الليفية يتم تنشيطها عند علاج PRP.

هذه التقنية الحاصلة على براءة اختراع هي جهاز طبي بسيط وسريع وقابل للتكرار يستخدم لإنتاج مستحضرات PRP موحدة. إنه نظام مغلق بالكامل من خطوة واحدة يسمح بإعداد PRP من الدم الكامل الوريدي بعد 5 دقائق من الطرد المركزي عند 1500 × جم (بسبب تقنية الهلام المنفصل). يتم مسح PRP الذي تم الحصول عليه بعد الط?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

يقدم هذا البروتوكول جهازا ينتج PRP لتعزيز التوسع في المختبر للخلايا في نظام زراعة الخلايا الليفية الذاتية بنسبة 100٪.

إنتاج البلازما الذاتية الغنية بالصفائح الدموية لتعزيز توسع الخلايا الليفية البشرية في المختبر

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

هذا البروتوكول هو النظام الذاتي لثقافة الخلايا الليفية البشرية مع البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخاصة بالمريض وإعداد موحد لمدة خمس دقائق. PRP يعزز التوسع الهائل للخلايا الليفية في الثقافة. أوصيك باستخدام هذه الطريقة باستخدام PRP كمكمل خلوي عندما تحتاج إلى توسع هائل وآمن للخلايا لعلاجات الخلايا الذاتية.عند محاولة هذا البروتوكول ، أوصيك بالتحقق من سلامة PRP. يجب أن تكون البلازما نظيفة جدا مع عدم وجود خلايا الدم الحمراء. عند نقله ، عليك القيام بذلك بعناية فائقة.وفيما يتعلق بهضم أنسجتك ، يجب أن تكون نظيفة جدا قبل المتابعة. للبدء ، اقلب بعناية أنابيب البلازما الغنية بالصفائح الدموية المملوءة بالدم ، أو PRP ، رأسا على عقب ثلاث مرات لخلط الدم مع مضادات التخثر. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم في 1500g لمدة خمس دقائق في دوار ثابت بزاوية 45 درجة وموازنة الأنابيب.بعد الطرد المركزي ، يحتوي الدم المجزأ على خلايا دم حمراء وبيضاء محاصرة تحت الهلام الفاصل والصفائح الدموية على سطح الجل. اقلب أنبوب PRP برفق 20 مرة لإعادة تعليق رواسب الصفائح الدموية في طاف البلازما. تأكد من فصل الصفائح الدموية تماما عن الجل ويجب أن تتغير البلازما من شفافة وشفافة إلى عكرة.اجمع محلول البلازما من الأنبوب باستخدام جهاز نقل متصل بحقنة سعة 10 ملليلتر. ضع عينات الجلد في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وهز الأنبوب برفق. إذا كانت عينة الجلد كبيرة نسبيا، فضعها على غطاء طبق زراعة الأنسجة الذي تبلغ مساحته 150 سنتيمترا مربعا بحيث يكون جانب البشرة لأسفل.إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد باستخدام زوج من ملقط ومقص. لمنع الأنسجة من الجفاف ، اشطف المنديل كل بضع دقائق في برنامج تلفزيوني. عند اكتمال إزالة الدهون ، استخدم مشرطا لتقطيع عينات الجلد إلى شرائح ، حوالي 0.5 × 1.5 سم.بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من مزيج الكولاجين / ديسباز إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر. نقل الأنسجة المقطوعة إلى الأنبوب. تأكد من غمر قطع الأنسجة في المحلول وقم بتغطية الأنبوب بإحكام.ضع الأنابيب في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز المداري لمدة 150 دقيقة. بعد الحضانة ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة إلى خزانة السلامة الحيوية. ضع غطاء طبق استزراع معقم 100 ملم رأسا على عقب في خزانة السلامة البيولوجية.نقل تعليق الأنسجة إلى أسفل طبق الثقافة 100 ملم دون رش. إذا بقيت أي قطع من الأنسجة في الأنبوب ، فاستخدم ماصة معقمة سعة ملليلتر واحد أو ملقط معقم لنقل القطع إلى قاع طبق الاستزراع. مع توجيه البشرة لأعلى ، امسك الأدمة بزوج من الملقط.أمسك حافة البشرة بزوج آخر من الملقط وقشر الأدمة والبشرة بعيدا. مع الحفاظ على القطع المنفصلة على نفس الغطاء ، ضع القطع الجلدية في طبق استزراع جديد 100 ملم يحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، باستخدام ملقط المختبر ، انقل القطع الجلدية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من 0.3٪ Trypsin PBS.احتضن الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واخلط المحتويات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد 10 إلى 20 دقيقة ، أوقف التفاعل بإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسط النمو الكامل المثلج البارد. دوامة الأنبوب بقوة عدة مرات.قم بتصفية التعليق ، الذي يحتوي على الخلايا الليفية ، من خلال شبكة نايلون 85 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر. الطرد المركزي محلول الخلايا الليفية في 150g لمدة 10 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 إلى 200 ميكرولتر من وسط النمو الكامل لعدد الخلايا.ضع الخلايا في دورق زراعة الأنسجة الذي تبلغ مساحته 25 سنتيمترا مربعا. ثم احتضان القارورة عند 37 درجة سلزية. قم بتغيير الوسط الذي يحتوي على خلايا غير ملتصقة في اليوم التالي ، ومرة أخرى ، كل ثلاثة إلى أربعة أيام.عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني وأضف محلول Trypsin-EDTA. بعد احتضان القارورة لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة سلزية، أوقف التفاعل بإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من وسط النمو الكامل الدافئ. ثم ، الطرد المركزي تعليق الخلية في 200g لمدة خمس دقائق.إزالة طاف عن طريق الشفط. استزرع الخلايا الليفية في وسط PRP واحتضانها عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لكثافة الخلايا الموصى بها هو 4،000 خلية قابلة للحياة لكل سنتيمتر مربع.تم استخدام جهاز طبي مخصص لإنتاج PRP عن طريق معالجة الدم الكامل من 10 مرضى مختلفين. أزال الجهاز غالبية خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء. كان متوسط تركيز الصفائح الدموية في PRP أعلى بنسبة 50٪ تقريبا من تركيز الصفائح الدموية في الدم الكامل.تمت زراعة الخلايا الليفية الذاتية في وسط يحتوي على 10٪ FBS أو في وسائط بتركيزات PRP تتراوح من واحد إلى 50٪ بعد سبعة أيام من الثقافة ، دون تغيير الوسط ، أظهرت الثقافات المحضرة ب 20٪ PRP عددا أكبر من الخلايا الليفية القابلة للحياة. كان ل PRP تأثيرات قوية كمعزز للانتشار يصل إلى 7.7 أضعاف مقارنة ب FBS. أظهر تلطيخ Phalloidin أن التغيير المورفولوجي الذي لوحظ عند تنشيط PRP كان مرتبطا بإعادة تنظيم F-actin ، وهو توقيع على تنشيط الخلايا الليفية.أحد المخاوف الرئيسية للتوسع السريع للخلايا هو خطر التعديل الجينومي. من أجل تقييم ذلك ، يمكنك إجراء مقايسة التهجين الجينومي المقارن لتقييم الاستقرار الجيني لخلاياك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استبدال FBS ب PRP ، وهو مكمل بيولوجي ذاتي أكثر قوة.مع هذا ، يمكن للباحث أن ينمو المزيد من الخلايا بشكل أسرع دون أي إضافة لمواد أجنبية. قد نستخدم هذه التقنية لأنواع الخلايا الأخرى التي تحتاج إلى توسيع خارج الجسم الحي قبل التطبيق السريري ، على سبيل المثال ، الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الجذعية الوسيطة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

استرجاع الجراحية، عزل و<em&gt; في المختبر</em&gt; توسيع الأمامي الإنسان الصليبي الخلايا المشتقة من الرباط لتطبيقات هندسة الأنسجة

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

توصيف خلايا الدم البيضاء، الصفائح الدموية الغنية الليفين، رواية بيولوجية

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

الوسيطة اللحمية خلية الثقافة و التوصيل في حالة ذاتي: مقاربة ذكية لتطبيقات العظام

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...