Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Vi takker hr. Grégory Schneiter for den tekniske bistand med flowcytometridata. Professor Muriel Cuendet (Laboratory of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Sciences og University of Geneva) for at tillade brugen af Attune flowcytometeret og Cytation 3 high-throughput mikroskopet; Professor Brigitte Pittet for videnskabelig rådgivning.

Undersøgelsesprotokollen var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen, og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke, før de deltog i undersøgelsen. Hudprøver opnås fra raske kvinder, der gennemgår abdominalplastik i afdelingen for plastisk, rekonstruktiv og æstetisk kirurgi på Genève universitetshospitaler (Genève, Schweiz). Proceduren er i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen og blev godkendt af den lokale institutionelle etiske komité (protokol #3126).
<p class="jov...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Fordelene ved at bruge autologe fibroblaster som et naturligt alternativ sammenlignet med andre fyldmaterialer i sårcelleterapi omfatter god biokompatibilitet, minimale bivirkninger og lethed ved høst og brug. Før du bruger disse lægemidler i en daglig klinisk indstilling, er det imidlertid nødvendigt med ordentlige prækliniske undersøgelser for at identificere vækstfunktionerne og vurdere den biologiske funktion og sikkerhed af isolerede fibroblaster både før og efter transplantation. Direkte efter isolationsp...

Regenerativ medicin sigter mod at helbrede eller erstatte væv og organer, der er beskadiget af alder, sygdom eller traumer samt korrigere medfødte defekter. Ved autolog terapi trækkes celler eller væv ud af en patient, udvides eller modificeres og genindføres derefter til donoren. Denne form for terapi har et bredt potentiale inden for dermatologi1. I autolog fibroblastbehandling dyrkes en patients fibroblaster og injiceres igen til behandling af rynker, rimtider eller acne ar. Da fibroblaster er de vigtigste funktionelle celler i dermis, kan injektion af autologe fibroblaster være mere gavnlig end andre terapier i ansigtsforyngelse2.
I huden er fibroblaster ansvarlige for syntese og sekretion af ekstracellulære proteiner (dvs. kollagen, elastin, hyaluronsyre og glycosaminoglycaner). De frigiver også vækstfaktorer, der regulerer cellefunktion, migration og celle-matrix / celle-celle-interaktioner i normal hudhomeostase og sårheling3. Dermale fibroblaster er allerede blevet introduceret som en potentiel klinisk celleterapi til hudsårheling4, vævsregenerering5 eller dermale fyldstoffer i æstetiske og plastikkirurgiske procedurer6. Nogle undersøgelser tyder endda på, at fibroblaster i forbindelse med regenerativ medicin kan være en mere praktisk og effektiv celleterapi end mesenkymale stamceller7.
For at opnå et tilstrækkeligt antal fibroblaster til kliniske anvendelser er celleudvidelse normalt obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellekultur kræver basalmedium suppleret med vækstfaktorer, proteiner og enzymer for at understøtte celleadhæsion og proliferation. Føtalt bovint serum (FBS) er et almindeligt supplement til cellekulturmedier, fordi føtalt blod 1) er rig på vækstfaktorer sammenlignet med voksent blod og 2) præsenterer et lavt antistofindhold8. Efterhånden som celleterapi skrider frem, er der bekymringer om sikkerheden ved klassiske cellekulturforhold, hvor FBS tilsættes til kulturmediet. Desuden er der nu en tendens til at erstatte FBS med alternativer9. Flere FBS-erstatninger har vist lovende resultater10.
Det blodpladerige plasma (PRP) alternativ er valgt her, og vi har udviklet et medicinsk udstyr til at producere et standardiseret præparat af PRP, kaldet CuteCell-PRP. Den tilsigtede anvendelse af dette udstyr er fremstilling af autolog PRP, der skal anvendes som et kulturmedietilskud til in vitro-ekspansion af autologe celler under GMP-betingelser.
PRP defineres som en koncentreret trombocytsuspension i plasma. Fordi der er adskillige forberedelsesprotokoller, som adskiller sig i 1) den nødvendige mængde blod, 2) anvendte typer enheder og 3) centrifugeringsprotokol, varierer de resulterende blodpladekoncentrationer fra lidt over til mere end 10x blodbaselineværdien. Derudover indeholder PRP-præparater variable niveauer af forurening af røde og hvide blodlegemer. Terminologien "PRP" bruges således til at beskrive produkter, der varierer meget i deres biologiske sammensætning og potentielle terapeutiske virkninger.
I de fleste undersøgelser opnås FBS-substitution ved anvendelse af forskellige koncentrationer af PRP, der aktiveres (af thrombin eller calcium). Denne kunstige aktivering fremkalder en øjeblikkelig og vigtig frigivelse af blodpladevækstfaktorer fra 15 min op til 24 timer11. Derfor menes det, at trombocytaktivering er uønsket til anvendelser i cellekulturer, hvor langsom frigivelse af vækstfaktorer fra gradvis blodpladedegranulering er påkrævet.
PRP-terapi involverer fremstilling af autologe blodplader i koncentreret plasma12. Den optimale blodpladekoncentration er uklar, og der findes en bred vifte af kommercielle enheder til fremstilling af PRP13. Denne mangel på standardisering skyldes inkonsekvens mellem undersøgelser og har ført til en sort boks med hensyn til dosering og tidspunkt for injektion. Denne protokol beskriver en procedure til opnåelse af autolog PRP ved hjælp af denne dedikerede PRP-enhed til at udvide hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo-kulturmodel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Der er i øjeblikket stor klinisk interesse for brugen af autologe fibroblaster til hudreparation. I de fleste tilfælde kræves dyrkning af hudceller in vitro. Imidlertid har cellekultur, der bruger xenogene eller allogene kulturmedier, nogle ulemper (dvs. risiko for infektiøs agenstransmission eller langsom celleudvidelse). Her udvikles et autologt dyrkningssystem til udvidelse af humane hudfibroblastceller in vitro ved hjælp af patientens eget blodpladerige plasma (PRP). Human dermal fibroblaster isoleres fra patienten, mens de gennemgår abdominalplastik. Kulturer følges i op til 7 dage ved hjælp af et medium suppleret med enten føtalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodcelleindhold i PRP-præparater, proliferation og fibroblastdifferentiering vurderes. Denne protokol beskriver metoden til opnåelse af et standardiseret, ikke-aktiveret præparat af PRP ved hjælp af et dedikeret medicinsk udstyr. Præparatet kræver kun medicinsk udstyr (CuteCell-PRP) og centrifuge. Denne enhed er velegnet under tilstrækkelige medicinske praksisforhold og er et et-trins, apyrogent og sterilt lukket system, der kræver en enkelt, blød centrifugering på 1.500 x g i 5 minutter. Efter centrifugering adskilles blodkomponenterne, og det blodpladerige plasma opsamles let. Denne enhed muliggør en hurtig, konsistent og standardiseret forberedelse af PRP, der kan bruges som et cellekulturtilskud til in vitro-ekspansion af humane celler. PRP opnået her indeholder en 1,5 gange blodpladekoncentration sammenlignet med fuldblod sammen med en præferencefjernelse af røde og hvide blodlegemer. Det er vist, at PRP har en boostende effekt i celleproliferation sammenlignet med FBS (7,7x), og at fibroblaster aktiveres ved PRP-behandling.

Denne patenterede teknologi er et enkelt, hurtigt og reproducerbart medicinsk udstyr, der bruges til at fremstille standardiserede PRP-præparater. Det er et et-trins, helt lukket system, der tillader fremstilling af PRP fra venøst fuldblod efter 5 minutters centrifugering ved 1.500 x g (på grund af separeringsgelteknologien). PRP opnået efter centrifugering ryddes fra røde og hvide blodlegemer, som sidder under gelen. Efter flere rørinversioner resuspenderes blodpladerne, der er oven på gelen, i plasmaet,...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Denne protokol præsenterer en enhed, der producerer PRP for at øge in vitro-udvidelsen af celler i et 100% autologt fibroblastkultursystem.

Produktion af autologt blodpladerigt plasma til at øge in vitro human fibroblastekspansion

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Denne protokol er det autologe system til human fibroblastkultur med patientens eget blodpladerige plasma og et standardiseret præparat i fem minutter. PRP fremmer en massiv celleudvidelse af fibroblast i kultur. Jeg vil anbefale dig at bruge denne metode ved hjælp af PRP som et celletilskud, når du har brug for massiv bæk og sikker celleudvidelse til autologe celleterapier.Når du forsøger denne protokol, vil jeg anbefale dig at kontrollere PRP-integriteten. Dit plasma skal være meget rent med fravær af røde blodlegemer. Når du overfører det, skal du gøre det meget omhyggeligt.Og hvad angår fordøjelsen af dit væv, skal det være meget rent, før du fortsætter. Til at begynde med skal du forsigtigt dreje det blodfyldte blodpladerige plasma eller PRP, rør på hovedet tre gange for at blande blodet med antikoagulant. Centrifuger blodprøverne ved 1500 g i fem minutter i en fast 45 graders vinklet rotor og balancer rørene.Efter centrifugering har det fraktionerede blod røde og hvide blodlegemer fanget under skillegelen og blodpladerne på gelens overflade. PRP-røret vendes forsigtigt 20 gange for at resuspendere trombocytaflejringen i plasmasupernatanten. Sørg for, at blodpladerne er helt løsrevet fra gelen, og plasmaet skal skifte fra klar og gennemsigtig til grumset.Opsaml plasmaopløsningen fra røret ved hjælp af en overførselsanordning forbundet til en 10 ml sprøjte. Anbring hudprøverne i et 50 ml polypropylenrør med PBS og ryst røret forsigtigt. Hvis hudprøven er relativt stor, skal du placere den på låget af en 150 kvadratcentimeter vævskulturskål med den epidermale side nedad.Fjern det subkutane fedtvæv ved hjælp af et par tang og saks. For at forhindre vævet i at tørre ud, skylles vævet hvert par minutter i PBS. Når fedtfjernelsen er færdig, skal du bruge en skalpel til at skære hudprøverne i strimler, ca. 0,5 x 1,5 centimeter.Derefter tilsættes fem milliliter Collagenase / Dispase-blanding til et sterilt 15 ml rør. Overfør det afskårne væv til røret. Sørg for, at vævsstykkerne er nedsænket i opløsningen, og dæk røret sikkert.Placer rørene i en inkubator ved 37 grader Celsius med orbital omrystning i 150 minutter. Efter inkubation flyttes røret indeholdende vævet til biosikkerhedsskabet. Placer låget på en steril 100 millimeter kulturskål på hovedet i biosikkerhedsskabet.Overfør vævssuspensionen til bunden af 100 millimeter kulturskålen uden stænk. Hvis der forbliver vævsstykker i røret, skal du bruge en steril milliliter pipette eller steril tang til at overføre stykkerne til bunden af kulturskålen. Med epidermis opad, hold dermis med et par tang.Tag fat i kanten af epidermis med et andet par tang og skræl dermis og epidermis fra hinanden. Hold de adskilte stykker på samme låg, læg de dermale stykker i en ny 100 millimeter kulturskål indeholdende PBS. Derefter overføres de dermale stykker til et 15 ml polypropylenrør indeholdende tre ml 0,3% Trypsin PBS ved hjælp af laboratoriepincet.Inkuber røret i et 37 grader Celsius vandbad og bland indholdet hvert andet til tredje minut ved at vende røret flere gange. Efter 10 til 20 minutter skal du stoppe reaktionen ved at tilsætte tre til fem ml iskold komplet vækstmedium. Vortex røret kraftigt flere gange.Filtrer suspensionen, som indeholder fibroblasterne, gennem et 85 mikron nylonnet i et 50 ml rør. Centrifuger fibroblastopløsningen ved 150 g i 10 minutter. Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen resuspenderes i 100 til 200 mikroliter komplet vækstmedium til celletælling.Plade cellerne i en 25 kvadratcentimeter vævskulturkolbe. Derefter inkuberes kolben ved 37 grader Celsius. Skift mediet, der indeholder ikke-klæbende celler den følgende dag og igen hver tredje til fjerde dag.Når fibroblasterne når 70 til 80% sammenløb, vask dem med PBS og tilsæt Trypsin-EDTA-opløsning. Efter inkubation af kolben i tre minutter ved 37 grader Celsius standses reaktionen ved tilsætning af tre til fem ml varmt komplet vækstmedium. Derefter centrifugeres cellesuspensionen ved 200 g i fem minutter.Supernatanten fjernes ved aspiration. Dyrk fibroblasterne i PRP-medium og inkuber ved 37 grader Celsius. Den anbefalede mindste celletæthed er 4.000 levedygtige celler pr. Centimeter kvadreret.Et dedikeret medicinsk udstyr blev brugt til at producere PRP ved at behandle fuldblod fra 10 forskellige patienter. Enheden fjernede størstedelen af de røde blodlegemer og hvide blodlegemer. Den gennemsnitlige trombocytkoncentration i PRP var ca. 50 % højere end trombocytkoncentrationen i fuldblod.Autologe fibroblaster blev dyrket i medium med 10% FBS eller i medier med PRP-koncentrationer fra en til 50%Efter syv dages dyrkning, uden at ændre mediet, udviste kulturerne primet med 20% PRP et højere antal levedygtige fibroblaster. PRP havde potente virkninger som en proliferation booster op til 7,7 gange sammenlignet med FBS. Phalloidinfarvning viste, at den morfologiske ændring, der blev observeret ved PRP-aktivering, var relateret til F-actin-reorganisering, som er en signatur for fibroblastaktivering.En stor bekymring for hurtig celleudvidelse er risikoen for genomisk modifikation. For at vurdere dette kan du udføre komparativ genomisk hybridiseringsanalyse for at vurdere genomisk stabilitet af dine celler. Den største fordel ved denne teknik er at erstatte FBS med en PRP, som er et mere potent autologt biologisk supplement.Med dette kan forskeren vokse flere celler hurtigere uden tilsætning af xenogene stoffer. Vi kan bruge denne teknik til andre celletyper, der har brug for ex vivo-ekspansion før klinisk anvendelse, for eksempel keratinocyt eller mesenkymal stamcelle.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, Isolering og<em&gt; In vitro</em&gt; Udvidelse af menneskelige Forreste korsbånd-afledte celler til vævsdyrkningsapplikationer

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering af leukocyt-blodpladerigt fibrin, A Novel biomateriale

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromacelle Kultur og Levering i Autologe Betingelser: En smart tilgang til Ortopædisk Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Model af Human Kutan hypertrofisk ardannelse ved hjælp af makromolekylære fortrængning

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...