Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Wij danken de heer Grégory Schneiter voor de technische bijstand met flowcytometriegegevens; Professor Muriel Cuendet (Laboratorium voor Farmacognosie, School of Pharmaceutical Sciences en Universiteit van Genève) voor het toestaan van het gebruik van de Attune flow cytometer en de Cytation 3 high-throughput microscoop; Professor Brigitte Pittet voor wetenschappelijk advies.

Het onderzoeksprotocol voldeed aan de Verklaring van Helsinki en alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat ze aan het onderzoek deelnamen. Huidmonsters worden verkregen van gezonde vrouwen die abdominoplastiek ondergaan op de afdeling Plastische, Reconstructieve en Esthetische Chirurgie van de Universitaire Ziekenhuizen van Genève (Genève, Zwitserland). De procedure is in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de lokale institutionele ethisc...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

De voordelen van het gebruik van autologe fibroblasten als een natuurlijk alternatief in vergelijking met andere vulmaterialen in wondceltherapie omvatten een goede biocompatibiliteit, minimale bijwerkingen en gemak van oogsten en gebruik. Voordat deze therapieën echter in een dagelijkse klinische omgeving worden gebruikt, zijn goede preklinische studies nodig om de groeikenmerken te identificeren en de biologische functie en veiligheid van geïsoleerde fibroblasten zowel voor als na transplantatie te beoordelen. Direct...

Regeneratieve geneeskunde is gericht op het genezen of vervangen van weefsels en organen die zijn beschadigd door leeftijd, ziekte of trauma, evenals het corrigeren van aangeboren afwijkingen. Bij autologe therapie worden cellen of weefsel van een patiënt teruggetrokken, uitgebreid of gemodificeerd en vervolgens opnieuw aan de donor geïntroduceerd. Deze vorm van therapeutica heeft een breed potentieel op het gebied van dermatologie1. Bij autologe fibroblasttherapie worden de fibroblasten van een patiënt gekweekt en opnieuw geïnjecteerd om rimpels, rijmden of acnelittekens te behandelen. Aangezien fibroblasten de belangrijkste functionele cellen in de dermis zijn, kan injectie van autologe fibroblasten gunstiger zijn dan andere therapieën bij gezichtsverjonging2.
In de huid zijn fibroblasten verantwoordelijk voor de synthese en afscheiding van extracellulaire eiwitten (d.w.z. collageen, elastine, hyaluronzuur en glycosaminoglycanen). Ze geven ook groeifactoren vrij die de celfunctie, migratie en cel-matrix / cel-cel interacties reguleren in normale huidhomeostase en wondgenezing3. Dermale fibroblasten zijn al geïntroduceerd als een potentiële klinische celtherapie voor huidwondgenezing4, weefselregeneratie5 of dermale fillers in esthetische en plastische chirurgieprocedures6. Sommige studies suggereren zelfs dat, in de context van regeneratieve geneeskunde, fibroblasten een meer praktische en effectieve celtherapie kunnen zijn dan mesenchymale stamcellen7.
Om een voldoende aantal fibroblasten voor klinische toepassingen te verkrijgen, is celuitbreiding meestal verplicht. Ex vivo /in vitro celkweek vereist basaal medium aangevuld met groeifactoren, eiwitten en enzymen om celadhesie en proliferatie te ondersteunen. Foetaal runderserum (FBS) is een veel voorkomend supplement voor celkweekmedia, omdat foetaal bloed 1) rijk is aan groeifactoren in vergelijking met volwassen bloed en 2) eenlaag antilichaamgehalte 8 vertoont. Naarmate de celtherapie vordert, zijn er zorgen over de veiligheid van klassieke celkweekomstandigheden waarbij FBS aan het kweekmedium wordt toegevoegd. Verder is er nu een tendens om FBS te vervangen door alternatieven9. Verschillende FBS-vervangers hebben veelbelovende resultaten laten zien10.
Het alternatief voor bloedplaatjesrijk plasma (PRP) is hier geselecteerd en we hebben een medisch hulpmiddel ontwikkeld om een gestandaardiseerd preparaat van PRP te produceren, genaamd CuteCell-PRP. Het beoogde gebruik van dit apparaat is de bereiding van autologe PRP voor gebruik als kweekmediasupplement voor in vitro expansie van autologe cellen onder GMP-omstandigheden.
PRP wordt gedefinieerd als een geconcentreerde bloedplaatjessuspensie in plasma. Omdat er tal van voorbereidingsprotocollen zijn, die verschillen in 1) de hoeveelheid bloed die nodig is, 2) soorten apparaten die worden gebruikt en 3) centrifugatieprotocol, variëren de resulterende bloedplaatjesconcentraties van iets boven tot meer dan 10x de bloedbasislijnwaarde. Bovendien bevatten PRP-preparaten variabele niveaus van rode en witte bloedcelbesmetting. De terminologie "PRP" wordt dus gebruikt om producten te beschrijven die sterk variëren in hun biologische samenstelling en potentiële therapeutische effecten.
In de meeste onderzoeken wordt FBS-substitutie bereikt met behulp van verschillende concentraties PRP die worden geactiveerd (door trombine of calcium). Deze kunstmatige activering veroorzaakt een onmiddellijke en belangrijke afgifte van bloedplaatjesgroeifactoren van 15 min tot 24 h11. Daarom wordt aangenomen dat bloedplaatjesactivering ongewenst is voor toepassingen in celculturen, waarbij de langzame afgifte van groeifactoren uit geleidelijke bloedplaatjesdegranulatie vereist is.
PRP-therapie omvat de bereiding van autologe bloedplaatjes in geconcentreerd plasma12. De optimale bloedplaatjesconcentratie is onduidelijk en er is een breed scala aan commerciële apparaten beschikbaar om PRP13 te bereiden. Dit gebrek aan standaardisatie is het gevolg van inconsistentie tussen studies en heeft geleid tot een zwarte doos met betrekking tot de dosering en timing van injectie. Dit protocol beschrijft een procedure om autologe PRP te verkrijgen met behulp van dit speciale PRP-apparaat om huidfibroblasten uit te breiden in een 100% autoloog ex vivo cultuurmodel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Er is momenteel grote klinische belangstelling voor het gebruik van autologe fibroblasten voor huidherstel. In de meeste gevallen is kweek van huidcellen in vitro vereist. Celkweek met behulp van xenogene of allogene kweekmedia heeft echter enkele nadelen (d.w.z. risico op overdracht van infectieuze agentia of langzame celexpansie). Hier wordt een autoloog kweeksysteem ontwikkeld voor de uitbreiding van menselijke huidfibroblastcellen in vitro met behulp van het eigen bloedplaatjesrijke plasma (PRP) van een patiënt. Menselijke dermale fibroblasten worden geïsoleerd van de patiënt tijdens het ondergaan van abdominoplastiek. Culturen worden gedurende maximaal 7 dagen gevolgd met behulp van een medium aangevuld met foetaal runderserum (FBS) of PRP. Bloedcelgehalte in PRP-preparaten, proliferatie en fibroblastdifferentiatie worden beoordeeld. Dit protocol beschrijft de methode voor het verkrijgen van een gestandaardiseerd, niet-geactiveerd preparaat van PRP met behulp van een speciaal medisch hulpmiddel. Het preparaat vereist alleen een medisch hulpmiddel (CuteCell-PRP) en centrifuge. Dit apparaat is geschikt onder voldoende medische praktijkomstandigheden en is een eenstaps, apyrogeen en steriel gesloten systeem dat een enkele, zachte centrifugatie van 1.500 x g gedurende 5 minuten vereist. Na centrifugatie worden de bloedbestanddelen gescheiden en wordt het bloedplaatjesrijke plasma gemakkelijk verzameld. Dit apparaat maakt een snelle, consistente en gestandaardiseerde bereiding van PRP mogelijk die kan worden gebruikt als een celkweeksupplement voor in vitro expansie van menselijke cellen. De hier verkregen PRP bevat een 1,5-voudige bloedplaatjesconcentratie in vergelijking met volbloed samen, met een preferentiële verwijdering van rode en witte bloedcellen. Het is aangetoond dat PRP een stimulerend effect heeft op celproliferatie in vergelijking met FBS (7,7x) en dat fibroblasten worden geactiveerd bij PRP-behandeling.

Deze gepatenteerde technologie is een eenvoudig, snel en reproduceerbaar medisch hulpmiddel dat wordt gebruikt om gestandaardiseerde PRP-preparaten te produceren. Het is een volledig gesloten systeem in één stap dat de bereiding van PRP uit veneus volbloed mogelijk maakt na 5 minuten centrifugeren bij 1.500 x g (vanwege de scheidende geltechnologie). De PRP verkregen na centrifugatie wordt geklaard uit rode en witte bloedcellen, die onder de gel zitten. Na verschillende buisinversies worden de bloedplaatjes di...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Dit protocol presenteert een apparaat dat PRP produceert om de in vitro expansie van cellen in een 100% autoloog fibroblastkweeksysteem te stimuleren.

Productie van autoloog bloedplaatjesrijk plasma voor het stimuleren van in vitro menselijke fibroblastexpansie

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Dit protocol is het autologe systeem voor menselijke fibroblastcultuur met het eigen bloedplaatjesrijke plasma van de patiënt en een gestandaardiseerd preparaat gedurende vijf minuten. PRP bevordert een enorme celuitbreiding van fibroblast in cultuur. Ik zou je aanraden om deze methode te gebruiken met PRP als een celsupplement wanneer je enorme kreek en veilige celuitbreiding nodig hebt voor autologe celtherapieën.Wanneer u dit protocol probeert, raad ik u aan de PRP-integriteit te controleren. Je plasma moet heel schoon zijn met afwezigheid van rode bloedcellen. Wanneer je het overdraagt, moet je het heel voorzichtig doen.En wat betreft de vertering van je weefsel, het moet heel schoon zijn voordat je verder gaat. Om te beginnen, draai voorzichtig de met bloed gevulde bloedplaatjesrijke plasma, of PRP, buizen ondersteboven drie keer om het bloed te mengen met anticoagulans. Centrifugeer de bloedmonsters gedurende vijf minuten op 1500 g in een vaste rotor met een hoek van 45 graden en breng de buizen in balans.Na centrifugatie heeft het gefractioneerde bloed rode en witte bloedcellen gevangen onder de scheidende gel en bloedplaatjes op het oppervlak van de gel. Keer de PRP-buis 20 keer voorzichtig om om de bloedplaatjesafzetting in het plasmasupernatant te resuspenderen. Zorg ervoor dat de bloedplaatjes volledig loskomen van de gel en dat het plasma moet veranderen van helder en transparant naar troebel.Verzamel de plasma-oplossing uit de buis met behulp van een transferapparaat dat is aangesloten op een spuit van 10 milliliter. Plaats de huidmonsters in een polypropyleenbuis van 50 milliliter met PBS en schud de buis voorzichtig. Als het huidmonster relatief groot is, plaats het dan op het deksel van een weefselkweekschaal van 150 vierkante centimeter met de epidermale kant naar beneden.Verwijder het onderhuidse vetweefsel met een tang en schaar. Om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt, spoelt u het weefsel om de paar minuten in PBS. Wanneer de vetverwijdering is voltooid, gebruikt u een scalpel om de huidmonsters in reepjes te snijden, ongeveer 0,5 bij 1,5 centimeter.Voeg vervolgens vijf milliliter Collagenase / Dispase-mix toe aan een steriele buis van 15 milliliter. Breng het gesneden weefsel over in de buis. Zorg ervoor dat de stukjes weefsel ondergedompeld zijn in de oplossing en sluit de buis goed af.Plaats de buizen in een couveuse op 37 graden Celsius met orbitaal schudden gedurende 150 minuten. Verplaats na de incubatie de buis met het weefsel naar de bioveiligheidskast. Plaats het deksel van een steriele kweekschaal van 100 millimeter ondersteboven in de bioveiligheidskast.Breng de weefselsuspensie over op de bodem van de kweekschaal van 100 millimeter zonder te spatten. Als er stukjes weefsel in de buis achterblijven, gebruik dan een steriele pipet van één milliliter of een steriele tang om de stukjes over te brengen naar de bodem van de kweekschaal. Met de opperhuid naar boven gericht, houdt u de dermis vast met een tang.Pak de rand van de opperhuid vast met een andere tang en pel de dermis en opperhuid uit elkaar. Houd de gescheiden stukken op hetzelfde deksel en plaats de dermale stukken in een nieuwe kweekschaal van 100 millimeter met PBS. Breng vervolgens met behulp van een laboratoriumtang de dermale stukken over naar een polypropyleenbuis van 15 milliliter met drie milliliter 0,3% Trypsine PBS.Incubeer de buis in een waterbad van 37 graden Celsius en meng de inhoud om de twee tot drie minuten door de buis meerdere keren om te keren. Stop na 10 tot 20 minuten de reactie door drie tot vijf milliliter ijskoud compleet groeimedium toe te voegen. Vortex de buis krachtig meerdere keren.Filter de suspensie, die de fibroblasten bevat, door een nylon gaas van 85 micron in een buis van 50 milliliter. Centrifugeer de fibroblastoplossing gedurende 10 minuten op 150 g. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in 100 tot 200 microliter volledig groeimedium voor het celgetal.Plaats de cellen in een weefselkweekkolf van 25 vierkante centimeter. Incubeer vervolgens de kolf bij 37 graden Celsius. Verander het medium dat niet-hechtende cellen bevat de volgende dag, en opnieuw, om de drie tot vier dagen.Wanneer de fibroblasten 70 tot 80% confluentie bereiken, was ze dan met PBS en voeg Trypsine-EDTA-oplossing toe. Na het incuberen van de kolf gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius, stopt u de reactie door drie tot vijf milliliter warm groeimedium toe te voegen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende vijf minuten op 200 g.Verwijder het supernatant door aspiratie. Kweek de fibroblasten in PRP-medium en incubeer bij 37 graden Celsius. De aanbevolen minimale celdichtheid is 4.000 levensvatbare cellen per vierkante centimeter.Een speciaal medisch hulpmiddel werd gebruikt om PRP te produceren door volbloed van 10 verschillende patiënten te verwerken. Het apparaat verwijderde het grootste deel van de rode bloedcellen en witte bloedcellen. De gemiddelde bloedplaatjesconcentratie in de PRP was ongeveer 50% hoger dan de bloedplaatjesconcentratie in volbloed.Autologe fibroblasten werden gekweekt in medium met 10% FBS of in media met PRP-concentraties variërend van één tot 50% Na zeven dagen cultuur, zonder het medium te veranderen, vertoonden de culturen geprimed met 20% PRP een hoger aantal levensvatbare fibroblasten. PRP had krachtige effecten als proliferatiebooster tot 7,7 keer in vergelijking met FBS. Falloïdinekleuring toonde aan dat de morfologische verandering die werd waargenomen bij PRP-activering verband hield met F-actinereorganisatie, wat een handtekening is van fibroblastactivering.Een grote zorg van snelle celexpansie is het risico van genomische modificatie. Om dit te beoordelen, kunt u een vergelijkende genomische hybridisatietest uitvoeren om de genomische stabiliteit van uw cellen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om FBS te vervangen door een PRP, een krachtiger autoloog biologisch supplement.Hiermee kan de onderzoeker sneller meer cellen laten groeien zonder toevoeging van een xenogene stof. We kunnen deze techniek gebruiken voor andere celtypen die ex vivo expansie nodig hebben voor klinische toepassing, bijvoorbeeld keratinocyt of mesenchymale stamcel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Chirurgische Retrieval, Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Uitbreiding van de Mens Voorste kruisband-afgeleide cellen voor Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering van Leukocyte bloedplaatjes Rich fibrine, A Novel Biomateriaal

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...