Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
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Nous remercions M. Grégory Schneiter pour son assistance technique concernant les données de cytométrie en flux; Professeur Muriel Cuendet (Laboratoire de pharmacognosie, Faculté des sciences pharmaceutiques et Université de Genève) pour avoir autorisé l’utilisation du cytomètre en flux Attune et du microscope à haut débit Cytation 3; Professeur Brigitte Pittet pour des avis scientifiques.

Le protocole de l’étude était conforme à la Déclaration d’Helsinki et tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer à l’étude. Les échantillons de peau sont prélevés sur des femmes en bonne santé subissant une abdominoplastie dans le service de chirurgie plastique, reconstructive et esthétique des Hôpitaux universitaires de Genève (Genève, Suisse). La procédure est conforme aux principes de la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le comité d’éthi...

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G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. 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B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Les avantages de l’utilisation de fibroblastes autologues comme alternative naturelle par rapport à d’autres matériaux de remplissage dans la thérapie cellulaire des plaies comprennent une bonne biocompatibilité, des effets secondaires minimes et une facilité de récolte et d’utilisation. Cependant, avant d’utiliser ces traitements dans un cadre clinique quotidien, des études précliniques appropriées sont nécessaires pour identifier les caractéristiques de croissance et évaluer la fonction biologique e...

La médecine régénérative vise à guérir ou à remplacer les tissus et les organes endommagés par l’âge, la maladie ou les traumatismes, ainsi qu’à corriger les malformations congénitales. Dans le traitement autologue, les cellules ou les tissus sont prélevés sur un patient, élargis ou modifiés, puis réintroduits chez le donneur. Cette forme de thérapeutique a un large potentiel dans le domaine de la dermatologie1. Dans la thérapie autologue par fibroblastes, les fibroblastes d’un patient sont cultivés et réinjectés pour traiter les rides, les rides ou les cicatrices d’acné. Comme les fibroblastes sont les principales cellules fonctionnelles du derme, l’injection de fibroblastes autologues peut être plus bénéfique que d’autres thérapies dans le rajeunissement du visage2.
Dans la peau, les fibroblastes sont responsables de la synthèse et de la sécrétion de protéines extracellulaires (collagène, élastine, acide hyaluronique et glycosaminoglycanes). Ils libèrent également des facteurs de croissance qui régulent la fonction cellulaire, la migration et les interactions cellule-matrice/cellule-cellule dans l’homéostasie cutanée normale et la cicatrisation des plaies3. Les fibroblastes dermiques ont déjà été introduits en tant que thérapie cellulaire clinique potentielle pour la cicatrisation des plaies cutanées4, la régénération tissulaire5 ou les produits de comblement dermique dans les procédures de chirurgie esthétique et plastique6. Certaines études suggèrent même que, dans le cadre de la médecine régénérative, les fibroblastes pourraient être une thérapie cellulaire plus pratique et efficace que les cellules souches mésenchymateuses7.
Pour obtenir un nombre suffisant de fibroblastes pour des applications cliniques, l’expansion cellulaire est généralement obligatoire. La culture cellulaire ex vivo/in vitro nécessite un milieu basal complété par des facteurs de croissance, des protéines et des enzymes pour soutenir l’adhésion cellulaire et la prolifération. Le sérum fœtal bovin (FBS) est un supplément courant pour les milieux de culture cellulaire, car le sang fœtal 1) est riche en facteurs de croissance par rapport au sang adulte et 2) présente une faible teneur en anticorps8. Au fur et à mesure que la thérapie cellulaire progresse, on s’inquiète de la sécurité des conditions de culture cellulaire classiques dans lesquelles le FBS est ajouté au milieu de culture. En outre, on a maintenant tendance à remplacer FBS par des alternatives9. Plusieurs substituts FBS ont montré des résultats prometteurs10.
L’alternative au plasma riche en plaquettes (PRP) a été sélectionnée ici, et nous avons développé un dispositif médical pour produire une préparation standardisée de PRP, appelée CuteCell-PRP. L’utilisation prévue de ce dispositif est la préparation de PRP autologue à utiliser comme complément de milieu de culture pour l’expansion in vitro de cellules autologues dans des conditions de BPF.
Le PRP est défini comme une suspension plaquettaire concentrée dans le plasma. Parce qu’il existe de nombreux protocoles de préparation, qui diffèrent par 1) la quantité de sang nécessaire, 2) les types de dispositifs utilisés et 3) le protocole de centrifugation, les concentrations plaquettaires résultantes varient d’un peu au-dessus à plus de 10 fois la valeur de base du sang. En outre, les préparations PRP contiennent des niveaux variables de contamination des globules rouges et blancs. La terminologie « PRP » est donc utilisée pour décrire des produits dont la composition biologique et les effets thérapeutiques potentiels varient considérablement.
Dans la plupart des études, la substitution FBS est obtenue en utilisant différentes concentrations de PRP qui est activé (par la thrombine ou le calcium). Cette activation artificielle provoque une libération immédiate et importante des facteurs de croissance plaquettaires de 15 min jusqu’à 24 h11. Par conséquent, on pense que l’activation plaquettaire n’est pas souhaitable pour les applications dans les cultures cellulaires, dans lesquelles la libération lente des facteurs de croissance de la dégranulation plaquettaire progressive est nécessaire.
La thérapie PRP implique la préparation de plaquettes autologues dans le plasma concentré12. La concentration plaquettaire optimale n’est pas claire et une large gamme de dispositifs commerciaux sont disponibles pour préparer le PRP13. Ce manque de normalisation résulte de l’incohérence entre les études et a conduit à une boîte noire concernant la posologie et le moment de l’injection. Ce protocole décrit une procédure pour obtenir du PRP autologue à l’aide de ce dispositif PRP dédié pour étendre les fibroblastes cutanés dans un modèle de culture ex vivo 100% autologue.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Il existe actuellement un grand intérêt clinique pour l’utilisation de fibroblastes autologues pour la réparation de la peau. Dans la plupart des cas, une culture de cellules cutanées in vitro est nécessaire. Cependant, la culture cellulaire utilisant des milieux de culture xénogéniques ou allogéniques présente certains inconvénients (c.-à-d. risque de transmission d’agents infectieux ou de ralentissement de l’expansion cellulaire). Ici, un système de culture autologue est développé pour l’expansion des cellules fibroblastes de la peau humaine in vitro en utilisant le plasma riche en plaquettes (PRP) d’un patient. Les fibroblastes dermiques humains sont isolés du patient lors de l’abdominoplastie. Les cultures sont suivies jusqu’à 7 jours à l’aide d’un milieu supplémenté en sérum fœtal bovin (FBS) ou PRP. La teneur en cellules sanguines dans les préparations de PRP, la prolifération et la différenciation des fibroblastes sont évaluées. Ce protocole décrit la méthode permettant d’obtenir une préparation standardisée et non activée de PRP à l’aide d’un dispositif médical dédié. La préparation ne nécessite qu’un dispositif médical (CuteCell-PRP) et une centrifugeuse. Ce dispositif convient à des conditions de pratique médicales suffisantes et est un système fermé apyrogène et stérile en une étape qui nécessite une centrifugation à spin souple unique de 1 500 x g pendant 5 min. Après centrifugation, les composants sanguins sont séparés et le plasma riche en plaquettes est facilement collecté. Ce dispositif permet une préparation rapide, cohérente et standardisée de PRP qui peut être utilisé comme supplément de culture cellulaire pour l’expansion in vitro de cellules humaines. Le PRP obtenu ici contient une concentration plaquettaire de 1,5 fois supérieure à celle du sang total, avec une élimination préférentielle des globules rouges et blancs. Il est démontré que le PRP présente un effet stimulant sur la prolifération cellulaire par rapport au FBS (7,7x) et que les fibroblastes sont activés lors du traitement par PRP.

Cette technologie brevetée est un dispositif médical simple, rapide et reproductible utilisé pour produire des préparations PRP standardisées. Il s’agit d’un système entièrement fermé en une étape qui permet la préparation de PRP à partir de sang total veineux après 5 min de centrifugation à 1 500 x g (grâce à la technologie du gel de séparation). Le PRP obtenu après centrifugation est éliminé des globules rouges et blancs, qui se trouvent sous le gel. Après plusieurs inversions de tubes,...

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Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Ce protocole présente un dispositif qui produit du PRP pour stimuler l’expansion in vitro des cellules dans un système de culture de fibroblastes 100% autologue.

Production de plasma autologue riche en plaquettes pour stimuler l’expansion in vitro des fibroblastes humains

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Ce protocole est le système autologue pour la culture de fibroblastes humains avec le propre plasma riche en plaquettes du patient et une préparation standardisée pendant cinq minutes. Le PRP favorise une expansion cellulaire massive des fibroblastes en culture. Je vous recommande d’utiliser cette méthode en utilisant le PRP comme supplément cellulaire lorsque vous avez besoin d’une expansion massive de la crique et de la cellule sûre pour les thérapies cellulaires autologues.Lorsque vous essayez ce protocole, je vous recommande de vérifier l’intégrité du PRP. Votre plasma doit être très propre en l’absence de globules rouges. Lorsque vous le transférez, vous devez le faire très soigneusement.Et en ce qui concerne la digestion de vos tissus, ils doivent être très propres avant de procéder. Pour commencer, tournez soigneusement les tubes de plasma riche en plaquettes remplis de sang, ou PRP, à l’envers trois fois pour mélanger le sang avec un anticoagulant. Centrifuger les échantillons de sang à 1500g pendant cinq minutes dans un rotor fixe incliné de 45 degrés et équilibrer les tubes.Après centrifugation, le sang fractionné a des globules rouges et blancs piégés sous le gel de séparation et les plaquettes à la surface du gel. Retourner doucement le tube PRP 20 fois pour remettre en suspension le dépôt plaquettaire dans le surnageant plasmatique. Assurez-vous que les plaquettes sont complètement détachées du gel et que le plasma doit passer de clair et transparent à trouble.Prélever la solution plasmatique du tube à l’aide d’un dispositif de transfert connecté à une seringue de 10 millilitres. Placez les échantillons de peau dans un tube en polypropylène de 50 millilitres avec du PBS et secouez doucement le tube. Si l’échantillon de peau est relativement grand, placez-le sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire de 150 centimètres carrés avec le côté épidermique vers le bas.Retirez le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince et de ciseaux. Pour éviter que le tissu ne se dessèche, rincez-le toutes les quelques minutes dans du PBS. Lorsque l’élimination de la graisse est terminée, utilisez un scalpel pour couper les échantillons de peau en bandes, environ 0,5 par 1,5 centimètre.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de mélange collagénase / dispase dans un tube stérile de 15 millilitres. Transférer le tissu coupé dans le tube. Assurez-vous que les morceaux de tissu sont immergés dans la solution et refermez solidement le tube.Placez les tubes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation orbitale pendant 150 minutes. Après l’incubation, déplacer le tube contenant le tissu dans l’enceinte de biosécurité. Placez le couvercle d’une boîte de culture stérile de 100 millimètres à l’envers dans l’enceinte de biosécurité.Transférer la suspension de tissu au fond de la capsule de culture de 100 millimètres sans éclaboussures. S’il reste des morceaux de tissu dans le tube, utilisez une pipette stérile d’un millilitre ou une pince stérile pour transférer les morceaux au fond de la boîte de culture. Avec l’épiderme tourné vers le haut, tenez le derme avec une paire de pinces.Saisissez le bord de l’épiderme avec une autre paire de forceps et épluchez le derme et l’épiderme. En gardant les morceaux séparés sur le même couvercle, placez les morceaux dermiques dans une nouvelle boîte de culture de 100 millimètres contenant du PBS. Ensuite, à l’aide d’une pince de laboratoire, transférer les morceaux dermiques dans un tube en polypropylène de 15 millilitres contenant trois millilitres de PBS à 0,3% de trypsine.Incuber le tube dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et mélanger le contenu toutes les deux à trois minutes en retournant le tube plusieurs fois. Après 10 à 20 minutes, arrêtez la réaction en ajoutant trois à cinq millilitres de milieu de croissance complet glacé. Vortex le tube vigoureusement plusieurs fois.Filtrez la suspension, qui contient les fibroblastes, à travers un filet de nylon de 85 microns dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger la solution de fibroblastes à 150g pendant 10 minutes. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 à 200 microlitres de milieu de croissance complet pour le nombre de cellules.Plaquer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de 25 centimètres carrés. Ensuite, incuber la fiole à 37 degrés Celsius. Changez le milieu qui contient des cellules non adhérentes le lendemain, et de nouveau, tous les trois ou quatre jours.Lorsque les fibroblastes atteignent 70 à 80% de confluence, lavez-les avec du PBS et ajoutez une solution de trypsine-EDTA. Après avoir incubé le ballon pendant trois minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction en ajoutant trois à cinq millilitres de milieu de croissance complet chaud. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 200g pendant cinq minutes.Retirer le surnageant par aspiration. Culture des fibroblastes en milieu PRP et incuber à 37 degrés Celsius. La densité cellulaire minimale recommandée est de 4 000 cellules viables par centimètre carré.Un dispositif médical dédié a été utilisé pour produire du PRP en traitant le sang total de 10 patients différents. L’appareil a éliminé la majorité des globules rouges et des globules blancs. La concentration plaquettaire moyenne dans le PRP était d’environ 50% plus élevée que la concentration plaquettaire dans le sang total.Les fibroblastes autologues ont été cultivés en milieu avec 10%FBS ou en milieu avec des concentrations de PRP allant de un à 50%Après sept jours de culture, sans changer le milieu, les cultures amorcées avec 20%PRP présentaient un nombre plus élevé de fibroblastes viables. Le PRP a eu des effets puissants en tant que booster de prolifération jusqu’à 7,7 fois par rapport au FBS. La coloration à la phalloïdine a montré que le changement morphologique observé lors de l’activation du PRP était lié à la réorganisation de la F-actine, qui est une signature de l’activation des fibroblastes.Une préoccupation majeure de l’expansion cellulaire rapide est le risque de modification génomique. Afin d’évaluer cela, vous pouvez effectuer un test d’hybridation génomique comparative pour évaluer la stabilité génomique de vos cellules. Le principal avantage de cette technique est de remplacer FBS par un PRP, qui est un supplément biologique autologue plus puissant.Avec cela, le chercheur peut développer plus de cellules plus rapidement sans aucun ajout de substances xénogéniques. Nous pouvons utiliser cette technique pour d’autres types de cellules qui nécessitent une expansion ex vivo avant l’application clinique, par exemple, les cellules souches kératinocytaires ou mésenchymateuses.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bio-ingénierie

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