Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Ringraziamo il signor Grégory Schneiter per l'assistenza tecnica con i dati di citometria a flusso; la professoressa Muriel Cuendet (Laboratorio di farmacognosia, Scuola di scienze farmaceutiche e Università di Ginevra) per aver consentito l'uso del citometro a flusso Attune e del microscopio ad alta produttività Cytation 3; Prof.ssa Brigitte Pittet per consulenze scientifiche.

Il protocollo di studio era conforme alla Dichiarazione di Helsinki e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima di partecipare allo studio. I campioni di pelle sono ottenuti da donne sane sottoposte ad addominoplastica nel Dipartimento di Chirurgia Plastica, Ricostruttiva ed Estetica degli Ospedali Universitari di Ginevra (Ginevra, Svizzera). La procedura è conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stata approvata dal comitato etico istituzionale locale (protocollo #3126).
<...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

I vantaggi dell'utilizzo di fibroblasti autologhi come alternativa naturale rispetto ad altri materiali di riempimento nella terapia cellulare della ferita includono una buona biocompatibilità, effetti collaterali minimi e facilità di raccolta e utilizzo. Tuttavia, prima di utilizzare queste terapie in un contesto clinico quotidiano, sono necessari studi preclinici adeguati per identificare le caratteristiche di crescita e valutare la funzione biologica e la sicurezza dei fibroblasti isolati sia prima che dopo il trapi...

La medicina rigenerativa mira a guarire o sostituire tessuti e organi danneggiati da età, malattie o traumi, nonché a correggere difetti congeniti. Nella terapia autologa, le cellule o i tessuti vengono prelevati da un paziente, espansi o modificati, quindi reintrodotti nel donatore. Questa forma di terapia ha un ampio potenziale nel campo della dermatologia1. Nella terapia con fibroblasti autologhi, i fibroblasti di un paziente vengono coltivati e reiniettati per trattare rughe, ritidi o cicatrici da acne. Poiché i fibroblasti sono le principali cellule funzionali nel derma, l'iniezione di fibroblasti autologhi può essere più vantaggiosa di altre terapie nel ringiovanimento del viso2.
Nella pelle, i fibroblasti sono responsabili della sintesi e della secrezione di proteine extracellulari (cioè collagene, elastina, acido ialuronico e glicosaminoglicani). Rilasciano anche fattori di crescita che regolano la funzione cellulare, la migrazione e le interazioni cellula-matrice / cellula-cellula nella normale omeostasi cutanea e nella guarigione delle ferite3. I fibroblasti dermici sono già stati introdotti come potenziale terapia cellulare clinica per la guarigione delle ferite cutanee4, la rigenerazione dei tessuti5 o i filler dermici nelle procedure di chirurgia estetica e plastica6. Alcuni studi suggeriscono addirittura che, nel contesto della medicina rigenerativa, i fibroblasti possono essere una terapia cellulare più pratica ed efficace rispetto alle cellule staminali mesenchimali7.
Per ottenere un numero sufficiente di fibroblasti per applicazioni cliniche, l'espansione cellulare è solitamente obbligatoria. La coltura cellulare ex vivo/in vitro richiede terreno basale integrato con fattori di crescita, proteine ed enzimi per supportare l'adesione e la proliferazione cellulare. Il siero bovino fetale (FBS) è un integratore comune per i terreni di coltura cellulare, perché il sangue fetale 1) è ricco di fattori di crescita rispetto al sangue adulto e 2) presenta un basso contenuto di anticorpi8. Con il progredire della terapia cellulare, ci sono preoccupazioni sulla sicurezza delle condizioni di coltura cellulare classica in cui FBS viene aggiunto al terreno di coltura. Inoltre, vi è ora una tendenza a sostituire FBS con alternative9. Diversi sostituti FBS hanno mostrato risultati promettenti10.
L'alternativa al plasma ricco di piastrine (PRP) è stata selezionata qui e abbiamo sviluppato un dispositivo medico per produrre una preparazione standardizzata di PRP, denominata CuteCell-PRP. L'uso previsto di questo dispositivo è la preparazione di PRP autologo da utilizzare come integratore di terreni di coltura per l'espansione in vitro di cellule autologhe in condizioni GMP.
Il PRP è definito come una sospensione piastrinica concentrata nel plasma. Poiché esistono numerosi protocolli di preparazione, che differiscono in 1) la quantità di sangue necessaria, 2) i tipi di dispositivi utilizzati e 3) il protocollo di centrifugazione, le concentrazioni piastriniche risultanti variano da leggermente superiore a oltre 10 volte il valore basale del sangue. Inoltre, i preparati di PRP contengono livelli variabili di contaminazione dei globuli rossi e bianchi. La terminologia "PRP" viene quindi utilizzata per descrivere prodotti che variano notevolmente nella loro composizione biologica e nei potenziali effetti terapeutici.
Nella maggior parte degli studi, la sostituzione FBS si ottiene utilizzando diverse concentrazioni di PRP che viene attivato (da trombina o calcio). Questa attivazione artificiale provoca un rilascio immediato e importante di fattori di crescita piastrinica da 15 min fino a 24 h11. Pertanto, si ritiene che l'attivazione piastrinica sia indesiderabile per le applicazioni in colture cellulari, in cui è richiesto il lento rilascio di fattori di crescita dalla graduale degranulazione piastrinica.
La terapia PRP prevede la preparazione di piastrine autologhe nel plasma concentrato12. La concentrazione piastrinica ottimale non è chiara e una vasta gamma di dispositivi commerciali sono disponibili per preparare PRP13. Questa mancanza di standardizzazione deriva dall'incoerenza tra gli studi e ha portato a una scatola nera per quanto riguarda il dosaggio e la tempistica dell'iniezione. Questo protocollo descrive una procedura per ottenere PRP autologo utilizzando questo dispositivo PRP dedicato per espandere i fibroblasti cutanei in un modello di coltura ex vivo autologo al 100%.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Attualmente c'è un grande interesse clinico nell'uso di fibroblasti autologhi per la riparazione della pelle. Nella maggior parte dei casi, è necessaria la coltura di cellule della pelle in vitro. Tuttavia, la coltura cellulare che utilizza terreni di coltura xenogenici o allogenici presenta alcuni svantaggi (ad esempio, rischio di trasmissione di agenti infettivi o lenta espansione cellulare). Qui, viene sviluppato un sistema di coltura autologo per l'espansione delle cellule di fibroblasti della pelle umana in vitro utilizzando il plasma ricco di piastrine (PRP) di un paziente. I fibroblasti dermici umani sono isolati dal paziente durante l'addominoplastica. Le colture vengono seguite per un massimo di 7 giorni utilizzando un terreno integrato con siero bovino fetale (FBS) o PRP. Viene valutato il contenuto delle cellule del sangue nelle preparazioni di PRP, la proliferazione e la differenziazione dei fibroblasti. Questo protocollo descrive il metodo per ottenere una preparazione standardizzata e non attivata di PRP utilizzando un dispositivo medico dedicato. La preparazione richiede solo un dispositivo medico (CuteCell-PRP) e una centrifuga. Questo dispositivo è adatto in condizioni di pratica medica sufficienti ed è un sistema chiuso monopassaggio, apirogeno e sterile che richiede una singola centrifugazione a rotazione morbida di 1.500 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, i componenti del sangue vengono separati e il plasma ricco di piastrine viene facilmente raccolto. Questo dispositivo consente una preparazione rapida, coerente e standardizzata del PRP che può essere utilizzato come integratore di coltura cellulare per l'espansione in vitro delle cellule umane. Il PRP qui ottenuto contiene una concentrazione piastrinica di 1,5 volte rispetto al sangue intero insieme, con una rimozione preferenziale dei globuli rossi e bianchi. È dimostrato che il PRP presenta un effetto potenziante nella proliferazione cellulare rispetto alla FBS (7,7x) e che i fibroblasti vengono attivati dopo il trattamento con PRP.

Questa tecnologia brevettata è un dispositivo medico semplice, veloce e riproducibile utilizzato per produrre preparati PRP standardizzati. Si tratta di un sistema monopassaggio, completamente chiuso che consente la preparazione di PRP da sangue venoso intero dopo 5 minuti di centrifugazione a 1.500 x g (grazie alla tecnologia del gel separatore). Il PRP ottenuto dopo la centrifugazione viene eliminato dai globuli rossi e bianchi, che si trovano sotto il gel. Dopo diverse inversioni del tubo, le piastrine che s...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Questo protocollo presenta un dispositivo che produce PRP per aumentare l'espansione in vitro delle cellule in un sistema di coltura di fibroblasti autologhi al 100%.

Produzione di plasma autologo ricco di piastrine per aumentare l'espansione in vitro dei fibroblasti umani

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Questo protocollo è il sistema autologo per la coltura di fibroblasti umani con plasma ricco di piastrine del paziente e una preparazione standardizzata per cinque minuti. Il PRP promuove una massiccia espansione cellulare dei fibroblasti in coltura. Ti consiglierei di utilizzare questo metodo usando il PRP come integratore cellulare quando hai bisogno di un torrente massiccio e di un'espansione cellulare sicura per le terapie cellulari autologhe.Quando si tenta questo protocollo, si consiglia di verificare l'integrità del PRP. Il plasma deve essere molto pulito con assenza di globuli rossi. Quando lo trasferisci, devi farlo con molta attenzione.E per quanto riguarda la digestione del tessuto, deve essere molto pulito prima di procedere. Per iniziare, capovolgere con attenzione i tubi di plasma ricco di piastrine pieni di sangue, o PRP, tre volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante. Centrifugare i campioni di sangue a 1500 g per cinque minuti in un rotore fisso ad angolo di 45 gradi e bilanciare i tubi.Dopo la centrifugazione, il sangue frazionato ha globuli rossi e bianchi intrappolati sotto il gel separatore e piastrine sulla superficie del gel. Capovolgere delicatamente il tubo PRP 20 volte per risospendere il deposito piastrinico nel surnatante plasmatico. Assicurarsi che le piastrine siano completamente staccate dal gel e che il plasma cambi da trasparente e torbido.Raccogliere la soluzione al plasma dal tubo utilizzando un dispositivo di trasferimento collegato a una siringa da 10 millilitri. Posizionare i campioni di pelle in un tubo di polipropilene da 50 millilitri con PBS e agitare delicatamente il tubo. Se il campione di pelle è relativamente grande, posizionarlo sul coperchio di un piatto di coltura tissutale di 150 centimetri quadrati con il lato epidermico verso il basso.Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo usando un paio di pinze e forbici. Per evitare che il tessuto si secchi, sciacquare il tessuto ogni pochi minuti in PBS. Quando la rimozione del grasso è completa, utilizzare un bisturi per tagliare i campioni di pelle in strisce, circa 0,5 per 1,5 centimetri.Quindi, aggiungere cinque millilitri di miscela di collagenasi / dispase a un tubo sterile da 15 millilitri. Trasferire il tessuto tagliato nel tubo. Assicurarsi che i pezzi di tessuto siano immersi nella soluzione e tappare saldamente il tubo.Posizionare i tubi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con agitazione orbitale per 150 minuti. Dopo l'incubazione, spostare il tubo contenente il tessuto nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il coperchio di un piatto di coltura sterile da 100 millimetri capovolto nell'armadio di biosicurezza.Trasferire la sospensione di tessuto sul fondo del piatto di coltura da 100 millimetri senza schizzi. Se rimangono pezzi di tessuto nel tubo, utilizzare una pipetta sterile da un millilitro o una pinza sterile per trasferire i pezzi sul fondo del piatto di coltura. Con l'epidermide rivolta verso l'alto, tenere il derma con un paio di pinze.Afferrare il bordo dell'epidermide con un altro paio di pinze e staccare il derma e l'epidermide. Mantenendo i pezzi separati sullo stesso coperchio, posizionare i pezzi dermici in un nuovo piatto di coltura da 100 millimetri contenente PBS. Successivamente, utilizzando una pinza da laboratorio, trasferire i pezzi dermici in un tubo di polipropilene da 15 millilitri contenente tre millilitri di 0,3% di Trypsin PBS.Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e mescolare il contenuto ogni due o tre minuti invertendo il tubo più volte. Dopo 10-20 minuti, interrompere la reazione aggiungendo da tre a cinque millilitri di terreno di coltura completo ghiacciato. Vortice il tubo vigorosamente più volte.Filtrare la sospensione, che contiene i fibroblasti, attraverso una rete di nylon da 85 micron in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione di fibroblasti a 150g per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100-200 microlitri di terreno di crescita completo per la conta cellulare.Placcare le cellule in un pallone di coltura tissutale di 25 centimetri quadrati. Quindi, incubare il pallone a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo che contiene cellule non aderenti il giorno seguente, e di nuovo, ogni tre o quattro giorni.Quando i fibroblasti raggiungono il 70-80% di confluenza, lavarli con PBS e aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA. Dopo aver incubato il pallone per tre minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo da tre a cinque millilitri di terreno di coltura completo caldo. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 g per cinque minuti.Rimuovere il surnatante per aspirazione. Coltura dei fibroblasti in mezzo PRP e incubazione a 37 gradi Celsius. La densità cellulare minima raccomandata è di 4.000 cellule vitali per centimetro quadrato.Un dispositivo medico dedicato è stato utilizzato per produrre PRP elaborando sangue intero da 10 pazienti diversi. Il dispositivo ha rimosso la maggior parte dei globuli rossi e dei globuli bianchi. La concentrazione piastrinica media nel PRP era circa il 50% superiore alla concentrazione piastrinica nel sangue intero.I fibroblasti autologhi sono stati coltivati in terreno con il 10% di FBS o in terreni con concentrazioni di PRP comprese tra uno e 50% Dopo sette giorni di coltura, senza cambiare il terreno, le colture innescate con il 20% di PRP hanno mostrato un numero maggiore di fibroblasti vitali. Il PRP ha avuto effetti potenti come booster di proliferazione fino a 7,7 volte rispetto all'FBS. La colorazione con falloidina ha mostrato che il cambiamento morfologico osservato all'attivazione del PRP era correlato alla riorganizzazione della F-actina, che è una firma dell'attivazione dei fibroblasti.Una delle principali preoccupazioni della rapida espansione cellulare è il rischio di modificazione genomica. Per valutare questo, è possibile eseguire un test comparativo di ibridazione genomica per valutare la stabilità genomica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di sostituire FBS con un PRP, che è un integratore biologico autologo più potente.Con questo, il ricercatore può far crescere più cellule più velocemente senza alcuna aggiunta di sostanze xenogeniche. Possiamo usare questa tecnica per altri tipi di cellule che necessitano di espansione ex vivo prima dell'applicazione clinica, ad esempio cheratinociti o cellule staminali mesenchimali.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Recupero chirurgico, Isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Ampliamento anteriore umana crociati Cells Legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Ricerca

Bioingegneria

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Caratterizzazione di leucociti-piastrine Rich fibrina, un biomateriale Novel

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchimali stromali coltura cellulare e la consegna in autologhi Condizioni: un approccio intelligente per applicazioni ortopediche

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...