Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Vi takker Grégory Schneiter for teknisk assistanse med flowcytometridata; Professor Muriel Cuendet (Laboratorium for farmakognosi, School of Pharmaceutical Sciences, og Universitetet i Genève) for å tillate bruk av Attune flow cytometer og Cytation 3 high-throughput mikroskop; Professor Brigitte Pittet for vitenskapelige råd.

Studieprotokollen var i samsvar med Helsinkideklarasjonen, og alle pasientene ga skriftlig informert samtykke før de deltok i studien. Hudprøver er tatt fra friske kvinner som gjennomgår bukplastikk ved avdelingen for plastisk, rekonstruktiv og estetisk kirurgi ved universitetssykehusene i Genève (Genève, Sveits). Prosedyren er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av den lokale institusjonelle etiske komiteen (protokoll #3126).
1. Forberedelse av PRP
<p clas...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Fordelene ved å bruke autologe fibroblaster som et naturlig alternativ sammenlignet med andre fyllmaterialer i sårcelleterapi inkluderer god biokompatibilitet, minimale bivirkninger og enkel høsting og bruk. Før du bruker disse terapiene i en daglig klinisk setting, er det imidlertid nødvendig med riktige prekliniske studier for å identifisere vekstfunksjonene og vurdere den biologiske funksjonen og sikkerheten til isolerte fibroblaster både før og etter transplantasjon. Således, rett etter isolasjonsprosessen, ...

Regenerativ medisin tar sikte på å helbrede eller erstatte vev og organer som er skadet av alder, sykdom eller traumer, samt korrigere medfødte defekter. Ved autolog behandling blir celler eller vev trukket fra en pasient, utvidet eller modifisert, og deretter gjeninnført til donoren. Denne formen for terapi har bredt potensial innen dermatologi1. I autolog fibroblastbehandling blir pasientens fibroblaster dyrket og reinjisert for å behandle rynker, rim eller akne arr. Siden fibroblaster er de viktigste funksjonelle cellene i dermis, kan injeksjon av autologe fibroblaster være mer fordelaktig enn andre terapier i ansiktsforyngelse2.
I huden er fibroblaster ansvarlige for syntese og sekresjon av ekstracellulære proteiner (dvs. kollagen, elastin, hyaluronsyre og glykosaminoglykaner). De frigjør også vekstfaktorer som regulerer cellefunksjon, migrasjon og cellematrise / celle-celle-interaksjoner i normal hudhomeostase og sårheling3. Dermale fibroblaster har allerede blitt introdusert som en potensiell klinisk celleterapi for hudsårheling4, vevregenerering5 eller dermale fyllstoffer i estetiske og plastikkirurgiske prosedyrer6. Noen studier tyder til og med på at fibroblaster i sammenheng med regenerativ medisin kan være en mer praktisk og effektiv celleterapi enn mesenkymale stamceller7.
For å oppnå et tilstrekkelig antall fibroblaster for kliniske anvendelser, er celleutvidelse vanligvis obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellekultur krever basalmedium supplert med vekstfaktorer, proteiner og enzymer for å støtte celleadhesjon og proliferasjon. Fetal bovine serum (FBS) er et vanlig supplement for cellekulturmedier, fordi fosterblod 1) er rik på vekstfaktorer sammenlignet med voksent blod og 2) presenterer et lavt antistoffinnhold8. Etter hvert som celleterapi utvikler seg, er det bekymringer om sikkerheten til klassiske cellekulturforhold der FBS legges til kulturmediet. Videre er det nå en tendens til å erstatte FBS med alternativer9. Flere FBS-innbyttere har vist lovende resultater10.
Det blodplaterike plasma (PRP) alternativet er valgt her, og vi har utviklet et medisinsk utstyr for å produsere et standardisert preparat av PRP, kalt CuteCell-PRP. Den tiltenkte bruken av denne enheten er fremstilling av autolog PRP som skal brukes som et kulturmedietilskudd for in vitro-ekspansjon av autologe celler under GMP-betingelser.
PRP er definert som en konsentrert platesuspensjon i plasma. Fordi det er mange forberedelsesprotokoller, som varierer i 1) mengden blod som trengs, 2) typer enheter som brukes, og 3) sentrifugeringsprotokoll, varierer de resulterende blodplatekonsentrasjonene fra litt over til mer enn 10x blodutgangsverdien. I tillegg inneholder PRP-preparater variable nivåer av forurensning av røde og hvite blodlegemer. Terminologien "PRP" brukes dermed til å beskrive produkter som varierer sterkt i sin biologiske sammensetning og potensielle terapeutiske effekter.
I de fleste studier oppnås FBS-substitusjon ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av PRP som aktiveres (av trombin eller kalsium). Denne kunstige aktiveringen provoserer en umiddelbar og viktig frigjøring av blodplatevekstfaktorer fra 15 minutter til 24 timer11. Derfor antas det at blodplateaktivering er uønsket for anvendelser i cellekulturer, hvor langsom frigjøring av vekstfaktorer fra gradvis blodplatedegranulering er nødvendig.
PRP-terapi innebærer fremstilling av autologe blodplater i konsentrert plasma12. Den optimale blodplatekonsentrasjonen er uklar, og et bredt spekter av kommersielle enheter er tilgjengelig for å forberede PRP13. Denne mangelen på standardisering skyldes inkonsekvens blant studier og har ført til en svart boks angående dosering og tidspunkt for injeksjon. Denne protokollen beskriver en prosedyre for å oppnå autolog PRP ved hjelp av denne dedikerte PRP-enheten for å utvide hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo kulturmodell.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Det er for tiden stor klinisk interesse for bruk av autologe fibroblaster for hudreparasjon. I de fleste tilfeller er dyrkning av hudceller in vitro nødvendig. Imidlertid har cellekultur ved bruk av xenogene eller allogene kulturmedier noen ulemper (dvs. risiko for overføring av smittestoff eller langsom celleutvidelse). Her utvikles et autologt dyrkningssystem for utvidelse av humane hudfibroblastceller in vitro ved bruk av pasientens eget blodplaterike plasma (PRP). Humane dermale fibroblaster isoleres fra pasienten mens de gjennomgår bukplastikk. Kulturer følges i opptil 7 dager ved bruk av et medium supplert med enten føtalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodcelleinnhold i PRP-preparater, proliferasjon og fibroblastdifferensiering vurderes. Denne protokollen beskriver metoden for å oppnå et standardisert, ikke-aktivert preparat av PRP ved bruk av et dedikert medisinsk utstyr. Preparatet krever bare en medisinsk enhet (CuteCell-PRP) og sentrifuge. Denne enheten er egnet under tilstrekkelige medisinske praksisforhold og er et ett-trinns, apyrogent og sterilt lukket system som krever en enkelt, myk sentrifugering på 1,500 x g i 5 minutter. Etter sentrifugering separeres blodkomponentene, og det blodplaterike plasmaet samles lett. Denne enheten tillater en rask, konsistent og standardisert fremstilling av PRP som kan brukes som et cellekulturtilskudd for in vitro-utvidelse av humane celler. PRP oppnådd her inneholder en 1,5 ganger blodplatekonsentrasjon sammenlignet med fullblod sammen, med en fortrinnsvis fjerning av røde og hvite blodlegemer. Det er vist at PRP gir en forsterkende effekt i celleproliferasjon sammenlignet med FBS (7.7x) og at fibroblaster aktiveres ved PRP-behandling.

Denne patenterte teknologien er en enkel, rask og reproduserbar medisinsk enhet som brukes til å produsere standardiserte PRP-preparater. Det er et ett-trinns, helt lukket system som tillater fremstilling av PRP fra venøst fullblod etter 5 min sentrifugering ved 1,500 x g (på grunn av separasjonsgelteknologien). PRP oppnådd etter sentrifugering fjernes fra røde og hvite blodlegemer, som sitter under gelen. Etter flere tubeinversjoner resuspenderes blodplatene som ligger på toppen av gelen i plasma, og PRP ...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Denne protokollen presenterer en enhet som produserer PRP for å øke in vitro-utvidelsen av celler i et 100% autologt fibroblastkultursystem.

Produksjon av autologt blodplaterikt plasma for å øke ekspansjon av human fibroblast in vitro

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Denne protokollen er det autologe systemet for human fibroblastkultur med pasientens eget blodplaterikt plasma og et standardisert preparat i fem minutter. PRP fremmer en massiv celleutvidelse av fibroblast i kultur. Jeg vil anbefale deg å bruke denne metoden ved å bruke PRP som et celletilskudd når du trenger massiv bekk og sikker celleutvidelse for autologe celleterapier.Når du prøver denne protokollen, vil jeg anbefale deg å sjekke PRP-integriteten. Plasmaet ditt må være veldig rent med fravær av røde blodlegemer. Når du overfører den, må du gjøre det veldig nøye.Og når det gjelder fordøyelsen av vevet ditt, må det være veldig rent før du fortsetter. For å begynne, skru forsiktig det blodfylte blodplaterike plasmaet, eller PRP, rørene opp ned tre ganger for å blande blodet med antikoagulant. Sentrifuger blodprøvene på 1500g i fem minutter i en fast 45-graders vinklet rotor og balanser rørene.Etter sentrifugering har det fraksjonerte blodet røde og hvite blodlegemer fanget under separasjonsgelen og blodplater på overflaten av gelen. Snu PRP-røret forsiktig 20 ganger for å resuspendere blodplateavleiringen i plasmasupernatanten. Forsikre deg om at blodplatene er helt løsnet fra gelen, og at plasmaet endres fra klart og gjennomsiktig til uklart.Samle plasmaoppløsningen fra røret ved hjelp av en overføringsanordning koblet til en 10 milliliter sprøyte. Plasser hudprøvene i et 50 milliliter polypropylenrør med PBS og rist røret forsiktig. Hvis hudprøven er relativt stor, legg den på lokket på en 150 kvadratcentimeter vevskulturskål med epidermal side ned.Fjern det subkutane fettvevet ved hjelp av en tang og saks. For å forhindre at vevet tørker ut, skyll vevet noen få minutter i PBS. Når fettfjerning er fullført, bruk en skalpell til å kutte hudprøvene i strimler, omtrent 0,5 x 1,5 centimeter.Deretter legger du til fem milliliter kollagenase / Dispase-blanding til et sterilt 15 milliliter rør. Overfør kuttvevet til røret. Forsikre deg om at vevstykkene er nedsenket i løsningen og dekk røret forsvarlig.Plasser rørene i en inkubator ved 37 grader Celsius med orbital risting i 150 minutter. Etter inkubering, flytt røret som inneholder vevet til biosikkerhetsskapet. Plasser lokket på en steril 100 millimeter dyrkningsfat opp ned i biosikkerhetsskapet.Overfør vevssuspensjonen til bunnen av 100 millimeter kulturskålen uten sprut. Hvis noen biter av vev forblir i røret, bruk en steril en-milliliter pipette eller steril tang for å overføre bitene til bunnen av kulturfatet. Med epidermis vendt opp, hold dermis med et par tang.Ta tak i kanten av epidermis med et annet par tang og skrell dermis og epidermis fra hverandre. Hold de adskilte stykkene på samme lokk, legg de dermale bitene i en ny 100 millimeter kulturskål som inneholder PBS. Deretter overfører du dermale biter ved hjelp av laboratorietang til et 15 milliliter polypropylenrør som inneholder tre milliliter 0,3% Trypsin PBS.Inkuber røret i et 37 grader Celsius vannbad og bland innholdet hvert to til tre minutter ved å snu røret flere ganger. Etter 10 til 20 minutter, stopp reaksjonen ved å tilsette tre til fem milliliter iskaldt komplett vekstmedium. Virv røret kraftig flere ganger.Filtrer suspensjonen, som inneholder fibroblastene, gjennom et 85-mikron nylonnett i et 50 milliliter rør. Sentrifuge fibroblastoppløsningen ved 150g i 10 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 til 200 mikroliter komplett vekstmedium for celletall.Plate cellene i en 25 kvadratcentimeter vevskulturkolbe. Deretter inkuberer kolben ved 37 grader Celsius. Endre mediet som inneholder ikke-adherente celler neste dag, og igjen, hver tredje til fjerde dag.Når fibroblastene når 70 til 80% sammenløp, vask dem med PBS og tilsett Trypsin-EDTA-løsningen. Etter å ha inkubert kolben i tre minutter ved 37 grader Celsius, stopp reaksjonen ved å tilsette tre til fem milliliter varmt komplett vekstmedium. Deretter sentrifugerer du cellesuspensjonen ved 200g i fem minutter.Fjern supernatanten ved aspirasjon. Kultur fibroblastene i PRP-medium og inkuberer ved 37 grader Celsius. Den minste celletettheten som anbefales er 4.000 levedyktige celler per centimeter i kvadrat.Et dedikert medisinsk utstyr ble brukt til å produsere PRP ved å behandle fullblod fra 10 forskjellige pasienter. Enheten fjernet flertallet av de røde blodcellene og hvite blodlegemer. Gjennomsnittlig blodplatekonsentrasjon i PRP var ca. 50 % høyere enn blodplatekonsentrasjonen i fullblod.Autologe fibroblaster ble dyrket i medium med 10%FBS eller i medier med PRP-konsentrasjoner fra en til 50%Etter syv dager med kultur, uten å endre mediet, viste kulturene primet med 20%PRP et høyere antall levedyktige fibroblaster. PRP hadde sterke effekter som en spredningsforsterker opptil 7,7 ganger sammenlignet med FBS. Falloidinfarging viste at den morfologiske endringen observert ved PRP-aktivering var relatert til F-aktinreorganisering, som er en signatur for fibroblastaktivering.En stor bekymring for rask celleutvidelse er risikoen for genomisk modifikasjon. For å vurdere dette kan du utføre komparativ genomisk hybridiseringsanalyse for å vurdere den genomiske stabiliteten til cellene dine. Den største fordelen med denne teknikken er å erstatte FBS med en PRP, som er et mer potent autologt biologisk supplement.Med dette kan forskeren vokse mer celle raskere uten tilsetning av xenogene stoffer. Vi kan bruke denne teknikken for andre celletyper som trenger ex vivo ekspansjon før klinisk anvendelse, for eksempel keratinocytt eller mesenkymal stamcelle.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk henting, isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Utvidelse av Menneskelig Fremre korsbånd-deriverte celler for tissue engineering applikasjoner

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering av Leukocytt-plate Rich fibrin, A Novel Biomateriale

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromal cellekultur og levering autolog Betingelser: En smart tilnærming for Ortopedisk Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...