Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
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Agradecemos ao senhor deputado Grégory Schneiter pela assistência técnica com os dados da citometria de fluxo; a professora Muriel Cuendet (Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e da Universidade de Genebra) por permitir o uso do citômetro de fluxo Attune e do microscópio de alto rendimento Cytation 3; Professora Brigitte Pittet pelos pareceres científicos.

O protocolo do estudo seguiu a Declaração de Helsinque, e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de participarem do estudo. As amostras de pele são obtidas de mulheres saudáveis submetidas à abdominoplastia no Departamento de Cirurgia Plástica, Reconstrutiva e Estética dos Hospitais Universitários de Genebra (Genebra, Suíça). O procedimento está em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética institucional local (pro...

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As vantagens do uso de fibroblastos autólogos como uma alternativa natural em comparação com outros materiais de preenchimento na terapia celular de feridas incluem boa biocompatibilidade, efeitos colaterais mínimos e facilidade de coleta e uso. No entanto, antes de usar essas terapêuticas em um ambiente clínico diário, estudos pré-clínicos adequados são necessários para identificar as características de crescimento e avaliar a função biológica e a segurança dos fibroblastos isolados antes e após o trans...

A medicina regenerativa visa curar ou substituir tecidos e órgãos danificados pela idade, doença ou trauma, bem como corrigir defeitos congênitos. Na terapia autóloga, células ou tecidos são retirados de um paciente, expandidos ou modificados e, em seguida, reintroduzidos no doador. Essa forma terapêutica tem amplo potencial no campo da dermatologia1. Na terapia autóloga de fibroblastos, os fibroblastos de um paciente são cultivados e reinjetados para tratar rugas, rítides ou cicatrizes de acne. Como os fibroblastos são as principais células funcionais da derme, a injeção de fibroblastos autólogos pode ser mais benéfica do que outras terapias no rejuvenescimentofacial2.
Na pele, os fibroblastos são responsáveis pela síntese e secreção de proteínas extracelulares (colágeno, elastina, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos). Eles também liberam fatores de crescimento que regulam a função celular, migração e interações célula-matriz/célula-célula na homeostase normal da pele e cicatrização de feridas3. Os fibroblastos dérmicos já foram introduzidos como potencial terapia celular clínica para cicatrização de feridascutâneas4, regeneração tecidual5 ou preenchimentos dérmicos em procedimentos estéticos e de cirurgiaplástica6. Alguns estudos até sugerem que, no contexto da medicina regenerativa, os fibroblastos podem ser uma terapia celular mais prática e eficaz do que as células-tronco mesenquimais7.
Para obter um número suficiente de fibroblastos para aplicações clínicas, a expansão celular é geralmente obrigatória. A cultura de células ex vivo/in vitro requer meio basal suplementado com fatores de crescimento, proteínas e enzimas para apoiar a adesão e proliferação celular. O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento comum para meios de cultura celular, pois o sangue fetal 1) é rico em fatores de crescimento em comparação com o sangue adulto e 2) apresenta baixo conteúdo de anticorpos8. À medida que a terapia celular progride, há preocupações sobre a segurança das condições clássicas de cultura de células nas quais a SFB é adicionada ao meio de cultura. Além disso, há uma tendência de substituir a SFB por alternativas9. Vários substitutos de FBS têm mostrado resultados promissores10.
A alternativa de plasma rico em plaquetas (PRP) foi selecionada aqui, e desenvolvemos um dispositivo médico para produzir uma preparação padronizada de PRP, denominada CuteCell-PRP. O uso pretendido deste dispositivo é a preparação de PRP autólogo para ser usado como um suplemento de meio de cultura para expansão in vitro de células autólogas sob condições de GMP.
O PRP é definido como uma suspensão concentrada de plaquetas no plasma. Como existem inúmeros protocolos de preparação, que diferem em 1) a quantidade de sangue necessária, 2) os tipos de dispositivos usados e 3) o protocolo de centrifugação, as concentrações plaquetárias resultantes variam de um pouco acima a mais de 10x o valor basal do sangue. Além disso, as preparações de PRP contêm níveis variáveis de contaminação de glóbulos vermelhos e brancos. A terminologia "PRP" é, portanto, usada para descrever produtos que variam muito em sua composição biológica e potenciais efeitos terapêuticos.
Na maioria dos estudos, a substituição da SFB é obtida usando diferentes concentrações de PRP que é ativado (por trombina ou cálcio). Essa ativação artificial provoca uma liberação imediata e importante de fatores de crescimento plaquetário de 15 min até 24 h11. Portanto, acredita-se que a ativação plaquetária seja indesejável para aplicações em culturas celulares, nas quais a liberação lenta de fatores de crescimento a partir da degranulação plaquetária gradual é necessária.
A terapia com PRP envolve a preparação de plaquetas autólogas em plasma concentrado12. A concentração plaquetária ideal não é clara, e uma ampla gama de dispositivos comerciais está disponível para preparar o PRP13. Essa falta de padronização decorre da inconsistência entre os estudos e levou a uma caixa preta em relação à dosagem e ao momento da injeção. Este protocolo descreve um procedimento para obtenção de PRP autólogo usando este dispositivo de PRP dedicado para expandir fibroblastos da pele em um modelo de cultura ex vivo 100% autóloga.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Atualmente, há grande interesse clínico no uso de fibroblastos autólogos para reparação cutânea. Na maioria dos casos, a cultura de células da pele in vitro é necessária. No entanto, a cultura celular usando meios de cultura xenogênicos ou alogênicos tem algumas desvantagens (i.e., risco de transmissão de agentes infecciosos ou expansão celular lenta). Aqui, um sistema de cultura autóloga é desenvolvido para a expansão de células de fibroblastos da pele humana in vitro usando o plasma rico em plaquetas (PRP) do próprio paciente. Os fibroblastos dérmicos humanos são isolados do paciente durante a abdominoplastia. As culturas são acompanhadas por até 7 dias usando um meio suplementado com soro fetal bovino (SFB) ou PRP. O conteúdo de células sanguíneas em preparações de PRP, proliferação e diferenciação de fibroblastos são avaliados. Este protocolo descreve o método para obter uma preparação padronizada e não ativada de PRP usando um dispositivo médico dedicado. A preparação requer apenas um dispositivo médico (CuteCell-PRP) e centrífuga. Este dispositivo é adequado sob condições de prática médica suficientes e é um sistema fechado de uma etapa, apirogênico e estéril que requer uma centrifugação única e suave de rotação de 1.500 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, os componentes sanguíneos são separados e o plasma rico em plaquetas é facilmente coletado. Este dispositivo permite uma preparação rápida, consistente e padronizada de PRP que pode ser usado como um suplemento de cultura celular para expansão in vitro de células humanas. O PRP obtido aqui contém uma concentração plaquetária de 1,5 vezes em comparação com o sangue total em conjunto, com uma remoção preferencial de glóbulos vermelhos e brancos. Demonstrou-se que o PRP apresenta um efeito potencializador na proliferação celular em comparação com a SFB (7,7x) e que os fibroblastos são ativados no tratamento com PRP.

Esta tecnologia patenteada é um dispositivo médico simples, rápido e reprodutível usado para produzir preparações padronizadas de PRP. É um sistema de uma etapa, totalmente fechado, que permite a preparação do PRP a partir do sangue total venoso após 5 min de centrifugação a 1.500 x g (devido à tecnologia de gel separador). O PRP obtido após a centrifugação é eliminado dos glóbulos vermelhos e brancos, que ficam abaixo do gel. Após várias inversões tubárias, as plaquetas que estão em cima ...

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Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Este protocolo é o sistema autólogo para cultura de fibroblastos humanos com plasma rico em plaquetas do próprio paciente e preparo padronizado por cinco minutos. O PRP promove uma expansão celular maciça de fibroblastos em cultura. Eu recomendaria que você use este método usando PRP como um suplemento celular quando você precisa de riacho maciço e expansão celular segura para terapias celulares autólogas.Quando você tenta esse protocolo, eu recomendo que você verifique a integridade do PRP. Seu plasma tem que ser muito limpo com ausência de glóbulos vermelhos. Quando você transfere, você tem que fazê-lo com muito cuidado.E em relação à digestão do seu tecido, ele tem que estar muito limpo antes de prosseguir. Para começar, vire cuidadosamente os tubos de plasma rico em plaquetas cheios de sangue, ou PRP, de cabeça para baixo três vezes para misturar o sangue com anticoagulante. Centrifugar as amostras de sangue a 1500g por cinco minutos em um rotor fixo de 45 graus angulados e equilibrar os tubos.Após a centrifugação, o sangue fracionado tem glóbulos vermelhos e brancos presos sob o gel separador e plaquetas na superfície do gel. Inverter suavemente o tubo de PRP 20 vezes para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático. Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel e que o plasma deve mudar de límpido e transparente para turvo.Recolher a solução de plasma do tubo utilizando um dispositivo de transferência ligado a uma seringa de 10 mililitros. Coloque as amostras de pele em um tubo de polipropileno de 50 mililitros com PBS e agite o tubo suavemente. Se a amostra de pele for relativamente grande, coloque-a na tampa de uma placa de cultura de tecido de 150 centímetros quadrados com o lado epidérmico para baixo.Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS. Quando a remoção de gordura estiver completa, use um bisturi para cortar as amostras de pele em tiras, aproximadamente 0,5 por 1,5 centímetros.Em seguida, adicione cinco mililitros de mistura de colagenase/dispase a um tubo estéril de 15 mililitros. Transfira o tecido cortado para o tubo. Certifique-se de que as peças de tecido estão submersas na solução e tampar o tubo com segurança.Coloque os tubos em uma incubadora a 37 graus Celsius com agitação orbital por 150 minutos. Após a incubação, mova o tubo contendo o tecido para o gabinete de biossegurança. Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 milímetros de cabeça para baixo no armário de biossegurança.Transfira a suspensão de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 milímetros sem respingar. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de um mililitro ou pinça estéril para transferir as peças para o fundo da placa de cultura. Com a epiderme voltada para cima, segure a derme com um par de pinças.Segure a borda da epiderme com outro par de pinças e descasque a derme e a epiderme. Mantendo as peças separadas na mesma tampa, coloque as peças dérmicas em uma nova placa de cultura de 100 milímetros contendo PBS. Em seguida, utilizando pinça de laboratório, transferir as peças dérmicas para um tubo de polipropileno de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS de tripsina 0,3%.Incube o tubo em banho-maria de 37 graus Celsius e misture o conteúdo a cada dois ou três minutos, invertendo o tubo várias vezes. Após 10 a 20 minutos, pare a reação adicionando de três a cinco mililitros de meio de crescimento completo gelado. Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes.Filtre a suspensão, que contém os fibroblastos, através de uma malha de nylon de 85 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a solução de fibroblastos a 150g durante 10 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 a 200 microlitros de meio de crescimento completo para contagem celular.Plaquear as células em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados. Em seguida, incubar o balão a 37 graus Celsius. Troque o meio que contém células não aderentes no dia seguinte e, novamente, a cada três ou quatro dias.Quando os fibroblastos atingirem 70 a 80% de confluência, lave-os com PBS e adicione solução de tripsina-EDTA. Depois de incubar o balão durante três minutos a 37 graus Celsius, pare a reacção adicionando três a cinco mililitros de meio de crescimento completo quente. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 200g por cinco minutos.Remover o sobrenadante por aspiração. Cultivar os fibroblastos em meio PRP e incubar a 37 graus Celsius. A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis por centímetro ao quadrado.Um dispositivo médico dedicado foi usado para produzir PRP através do processamento de sangue total de 10 pacientes diferentes. O dispositivo removeu a maioria dos glóbulos vermelhos e glóbulos brancos. A concentração plaquetária média no PRP foi aproximadamente 50% maior que a concentração plaquetária no sangue total.Fibroblastos autólogos foram cultivados em meio com SFB a 10% ou em meio com concentrações de PRP variando de um a 50% Após sete dias de cultivo, sem alterar o meio, as culturas submetidas a priming com 20% de PRP exibiram maior número de fibroblastos viáveis. O PRP teve efeitos potentes como impulsionador da proliferação até 7,7 vezes em comparação com a SFB. A coloração com faloidina mostrou que a alteração morfológica observada na ativação do PRP estava relacionada à reorganização da F-actina, que é uma assinatura da ativação dos fibroblastos.Uma grande preocupação da rápida expansão celular é o risco de modificação genômica. Para avaliar isso, você pode realizar um ensaio de hibridização genômica comparativa para avaliar a estabilidade genômica de suas células. A principal vantagem dessa técnica é substituir a SFB por um PRP, que é um suplemento biológico autólogo mais potente.Com isso, o pesquisador pode crescer mais células mais rápido sem qualquer adição de uma substância xenogênica. Podemos utilizar esta técnica para outros tipos celulares que necessitem de expansão ex vivo antes da aplicação clínica, por exemplo, queratinócitos ou células-tronco mesenquimais.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Recuperação cirúrgica, isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Expansão de humanos anteriores Cruciate células do ligamento derivados para aplicações em engenharia de tecidos

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Bioengenharia

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Caracterização de leucócito-rico em plaquetas de fibrina, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Estromais mesenquimais cultura de células e Entrega em condições autólogas: Uma abordagem inteligente para aplicações ortopédicas

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...