Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Мы благодарим г-на Грегори Шнайтера за техническую помощь в предоставлении данных проточной цитометрии; Профессору Мюриэль Куэнде (Лаборатория фармакогнозии, Школа фармацевтических наук и Женевский университет) за разрешение использовать проточный цитометр Attune и высокопроизводительный микроскоп Cytation 3; Профессор Бриджит Питте за научные советы.

Протокол исследования соответствовал Хельсинкской декларации, и все пациенты предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании. Образцы кожи берутся у здоровых женщин, перенесших абдоминопластику в отделении пластической, реконструктивной и эстетичес?...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Преимущества использования аутологичных фибробластов в качестве естественной альтернативы по сравнению с другими наполнителями в терапии раневых клеток включают хорошую биосовместимость, минимальные побочные эффекты и простоту сбора и использования. Однако, прежде чем использоват...

Регенеративная медицина направлена на лечение или замену тканей и органов, поврежденных возрастом, болезнью или травмой, а также на исправление врожденных дефектов. При аутологичной терапии клетки или ткань изымаются у пациента, расширяются или модифицируются, а затем снова вводятся донору. Эта форма терапии имеет широкий потенциал в области дерматологии1. При терапии аутологичными фибробластами фибробласты пациента культивируются и повторно вводятся для лечения морщин, ритид или шрамов от угревой сыпи. Поскольку фибробласты являются основными функциональными клетками дермы, инъекция аутологичных фибробластов может быть более полезной, чем другие методы лечения омоложения лица2.
В коже фибробласты отвечают за синтез и секрецию внеклеточных белков (то есть коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и гликозаминогликанов). Они также высвобождают факторы роста, которые регулируют функцию клеток, миграцию и взаимодействия между клетками и матриксом/клетками при нормальном гомеостазе кожи и заживлении ран3. Дермальные фибробласты уже были введены в качестве потенциальной клинической клеточной терапии для заживления кожных ран4, регенерациитканей 5 или дермальных наполнителей в процедурах эстетической и пластической хирургии6. Некоторые исследования даже предполагают, что в контексте регенеративной медицины фибробласты могут быть более практичной и эффективной клеточной терапией, чем мезенхимальные стволовые клетки7.
Для получения достаточного количества фибробластов для клинического применения обычно обязательна клеточная экспансия. Культура клеток ex vivo / in vitro требует базальной среды, дополненной факторами роста, белками и ферментами для поддержки клеточной адгезии и пролиферации. Фетальная бычья сыворотка (FBS) является распространенной добавкой для сред для культивирования клеток, поскольку кровь плода 1) богата факторами роста по сравнению с кровью взрослого человека и 2) имеет низкое содержание антител8. По мере развития клеточной терапии возникают опасения по поводу безопасности классических условий культивирования клеток, в которых FBS добавляется в питательную среду. Кроме того, в настоящее время наблюдается тенденция к замене FBS альтернативами9. Несколько заменителей FBS показали многообещающие результаты10.
Здесь была выбрана альтернатива обогащенной тромбоцитами плазме (PRP), и мы разработали медицинское устройство для производства стандартизированного препарата PRP под названием CuteCell-PRP. Предполагаемое использование этого устройства заключается в приготовлении аутологичного PRP для использования в качестве добавки питательной среды для экспансии аутологичных клеток in vitro в условиях GMP.
PRP определяется как концентрированная суспензия тромбоцитов в плазме. Поскольку существует множество протоколов подготовки, которые различаются по 1) количеству необходимой крови, 2) типам используемых устройств и 3) протоколу центрифугирования, результирующие концентрации тромбоцитов варьируются от чуть выше до более чем в 10 раз по сравнению с исходным значением крови. Кроме того, препараты PRP содержат различные уровни загрязнения эритроцитов и лейкоцитов. Таким образом, терминология «PRP» используется для описания продуктов, которые сильно различаются по своему биологическому составу и потенциальным терапевтическим эффектам.
В большинстве исследований замещение FBS достигается с использованием различных концентраций PRP, который активируется (тромбином или кальцием). Эта искусственная активация провоцирует немедленное и важное высвобождение факторов роста тромбоцитов от 15 мин до 24 ч11. Поэтому считается, что активация тромбоцитов нежелательна для применений в клеточных культурах, в которых требуется медленное высвобождение факторов роста от постепенной дегрануляции тромбоцитов.
PRP-терапия включает приготовление аутологичных тромбоцитов в концентрированной плазме12. Оптимальная концентрация тромбоцитов неясна, и существует широкий спектр коммерческих устройств для получения PRP13. Это отсутствие стандартизации является результатом несогласованности между исследованиями и привело к черному ящику в отношении дозировки и времени инъекции. Этот протокол описывает процедуру получения аутологичного PRP с использованием этого специального устройства PRP для расширения фибробластов кожи в 100% аутологичной модели культуры ex vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

В настоящее время существует большой клинический интерес к использованию аутологичных фибробластов для восстановления кожи. В большинстве случаев требуется культивирование клеток кожи in vitro. Однако культивирование клеток с использованием ксеногенных или аллогенных питательных сред имеет некоторые недостатки (например, риск передачи инфекционного агента или медленную экспансию клеток). Здесь разрабатывается система аутологичного культивирования для расширения клеток фибробластов кожи человека in vitro с использованием собственной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) пациента. Дермальные фибробласты человека выделяются у пациента во время абдоминопластики. Посевы проводят в течение 7 дней с использованием среды, дополненной либо фетальной бычьей сывороткой (FBS), либо PRP. Оценивают содержание клеток крови в препаратах PRP, пролиферацию и дифференцировку фибробластов. В этом протоколе описан способ получения стандартизированного, неактивированного препарата PRP с использованием специального медицинского изделия. Для приготовления препарата требуется только медицинский прибор (CuteCell-PRP) и центрифуга. Это устройство подходит для достаточных условий медицинской практики и представляет собой одноступенчатую, апирогенную и стерильную закрытую систему, которая требует однократного центрифугирования с мягким вращением 1,500 x g в течение 5 минут. После центрифугирования компоненты крови отделяются, и богатая тромбоцитами плазма легко собирается. Это устройство позволяет быстро, последовательно и стандартизированно получать PRP, который можно использовать в качестве добавки к клеточным культурам для экспансии клеток человека in vitro. PRP, полученный здесь, содержит 1,5-кратную концентрацию тромбоцитов по сравнению с цельной кровью вместе, с преимущественным удалением эритроцитов и лейкоцитов. Показано, что PRP оказывает стимулирующее действие в пролиферации клеток по сравнению с FBS (7,7x) и что фибробласты активируются при лечении PRP.

Эта запатентованная технология представляет собой простое, быстрое и воспроизводимое медицинское устройство, используемое для производства стандартизированных препаратов PRP. Это одноступенчатая, полностью закрытая система, которая позволяет получать PRP из венозной цельной крови по?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Этот протокол представляет собой устройство, которое производит PRP для стимулирования экспансии клеток in vitro в 100% аутологичной системе культивирования фибробластов.

Получение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы для усиления экспансии фибробластов человека in vitro

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Этот протокол представляет собой аутологичную систему для культивирования фибробластов человека с собственной обогащенной тромбоцитами плазмой пациента и стандартизированным препаратом в течение пяти минут. PRP способствует массивной клеточной экспансии фибробластов в культуре. Я бы порекомендовал вам использовать этот метод с использованием PRP в качестве клеточной добавки, когда вам нужен массивный поток и безопасная клеточная экспансия для аутологичной клеточной терапии.Когда вы попробуете этот протокол, я бы порекомендовал вам проверить целостность PRP. Ваша плазма должна быть очень чистой, с отсутствием эритроцитов. Когда вы переносите его, вы должны делать это очень осторожно.Что касается переваривания вашей ткани, она должна быть очень чистой, прежде чем продолжить. Для начала осторожно переверните заполненную кровью плазму, богатую тромбоцитами, или PRP, пробирки вверх дном три раза, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом. Центрифугируйте образцы крови весом 1500 г в течение пяти минут в фиксированном роторе под углом 45 градусов и балансируйте пробирки.После центрифугирования фракционированная кровь имеет эритроциты и лейкоциты, попавшие под разделительный гель, и тромбоциты на поверхности геля. Осторожно инвертируйте PRP-пробирку 20 раз, чтобы ресуспендировать отложение тромбоцитов в надосадочной жидкости плазмы. Убедитесь, что тромбоциты полностью отделены от геля, а плазма должна измениться с прозрачной и прозрачной на мутную.Соберите плазменный раствор из пробирки с помощью передаточного устройства, подключенного к 10-миллилитровому шприцу. Поместите образцы кожи в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку с PBS и осторожно встряхните пробирку. Если образец кожи относительно большой, поместите его на крышку чашки для культивирования тканей площадью 150 квадратных сантиметров эпидермальной стороной вниз.Удалите подкожно-жировую клетчатку с помощью щипцов и ножниц. Чтобы предотвратить высыхание ткани, промывайте салфетку каждые несколько минут в PBS. Когда удаление жира будет завершено, используйте скальпель, чтобы разрезать образцы кожи на полоски примерно 0,5 на 1,5 сантиметра.Затем добавьте пять миллилитров смеси коллагеназы и диспазы в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Переложите разрезанную ткань в трубку. Убедитесь, что кусочки ткани погружены в раствор, и надежно закройте трубку.Поместите пробирки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с орбитальным встряхиванием в течение 150 минут. После инкубации переместите пробирку, содержащую ткань, в шкаф биобезопасности. Поместите крышку стерильной 100-миллиметровой чашки для культур вверх дном в шкаф биобезопасности.Перенесите тканевую суспензию на дно 100-миллиметровой чашки для культуры, не разбрызгивая. Если в пробирке остались какие-либо кусочки ткани, используйте стерильную пипетку объемом один миллилитр или стерильные щипцы, чтобы перенести кусочки на дно чашки для культуры. Эпидермисом вверх удерживайте дерму щипцами.Возьмитесь за край эпидермиса другой парой щипцов и разделите дерму и эпидермис. Держа отделенные кусочки на одной крышке, поместите кожные кусочки в новую 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую PBS. Затем, используя лабораторные щипцы, перенесите кусочки кожи в 15-миллилитровую полипропиленовую пробирку, содержащую три миллилитра 0,3% трипсина PBS.Инкубируйте пробирку на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия и перемешивайте содержимое каждые две-три минуты, несколько раз переворачивая пробирку. Через 10-20 минут остановите реакцию, добавив от трех до пяти миллилитров ледяной среды для роста. Энергично прокрутите трубку несколько раз.Отфильтруйте суспензию, содержащую фибробласты, через 85-микронную нейлоновую сетку в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте раствор фибробластов в дозе 150 г в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 100-200 микролитрах полной питательной среды для подсчета клеток.Поместите клетки в колбу для культуры тканей площадью 25 квадратных сантиметров. Затем инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия. Меняйте среду, содержащую неадгезивные клетки, на следующий день и снова каждые три-четыре дня.Когда фибробласты достигнут слияния от 70 до 80%, промойте их PBS и добавьте раствор трипсина-ЭДТА. После инкубации колбы в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия остановите реакцию, добавив от трех до пяти миллилитров теплой среды для полного роста. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 200 г в течение пяти минут.Удаляют надосадочную жидкость с помощью аспирации. Культивируют фибробласты в среде PRP и инкубируют при 37 градусах Цельсия. Минимальная рекомендуемая плотность клеток составляет 4 000 жизнеспособных клеток на квадратный сантиметр.Специальное медицинское устройство использовалось для производства PRP путем обработки цельной крови 10 разных пациентов. Устройство удалило большинство эритроцитов и лейкоцитов. Средняя концентрация тромбоцитов в PRP была примерно на 50% выше, чем концентрация тромбоцитов в цельной крови.Аутологичные фибробласты культивировали в среде с 10% FBS или в среде с концентрацией PRP в диапазоне от одного до 50%После семи дней культивирования, без смены среды, культуры, загрунтованные 20% PRP, показали большее количество жизнеспособных фибробластов. PRP оказывал мощное действие в качестве усилителя пролиферации в 7,7 раза по сравнению с FBS. Окрашивание фаллоидином показало, что морфологические изменения, наблюдаемые при активации PRP, были связаны с реорганизацией F-актина, которая является признаком активации фибробластов.Основной проблемой быстрого размножения клеток является риск геномной модификации. Чтобы оценить это, вы можете выполнить сравнительный анализ геномной гибридизации для оценки геномной стабильности ваших клеток. Основным преимуществом этого метода является замена FBS на PRP, который является более мощной аутологичной биологической добавкой.Благодаря этому исследователь может быстрее вырастить больше клеток без добавления каких-либо ксеногенных веществ. Мы можем использовать этот метод для других типов клеток, которые нуждаются в расширении ex vivo перед клиническим применением, например, для кератиноцитов или мезенхимальных стволовых клеток.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Хирургическое извлечение, Изоляция и<em&gt; В пробирке</em&gt; Расширение человека передней крестообразной связки клетки, полученные из за тканевой инженерии

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Характеристика лейкоцитов тромбоцитов Rich фибрина, роман биоматериала

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Мезенхимальных стромальных Культура клеток и доставки в аутологичных условиях: Интеллектуальный подход для протезных применений

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...