Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
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Damos las gracias al Sr. Grégory Schneiter por su asistencia técnica con los datos de citometría de flujo; la profesora Muriel Cuendet (Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Universidad de Ginebra) por permitir el uso del citómetro de flujo Attune y el microscopio de alto rendimiento Citation 3; Profesora Brigitte Pittet para consejos científicos.

El protocolo del estudio cumplió con la Declaración de Helsinki, y todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Se obtienen muestras de piel de mujeres sanas sometidas a abdominoplastia en el Departamento de Cirugía Plástica, Reconstructiva y Estética de los Hospitales Universitarios de Ginebra (Ginebra, Suiza). El procedimiento se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética institucional local (protoc...

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Las ventajas de usar fibroblastos autólogos como una alternativa natural en comparación con otros materiales de relleno en la terapia celular de heridas incluyen una buena biocompatibilidad, efectos secundarios mínimos y facilidad de recolección y uso. Sin embargo, antes de usar estas terapias en un entorno clínico diario, se necesitan estudios preclínicos adecuados para identificar las características de crecimiento y evaluar la función biológica y la seguridad de los fibroblastos aislados tanto antes como desp...

La medicina regenerativa tiene como objetivo curar o reemplazar tejidos y órganos dañados por la edad, enfermedad o trauma, así como corregir defectos congénitos. En la terapia autóloga, las células o tejidos se extraen de un paciente, se expanden o modifican, y luego se vuelven a introducir al donante. Esta forma de terapéutica tiene un amplio potencial en el campo de la dermatología1. En la terapia con fibroblastos autólogos, los fibroblastos de un paciente se cultivan y se reinyectan para tratar arrugas, arrugas o cicatrices de acné. Como los fibroblastos son las principales células funcionales de la dermis, la inyección de fibroblastos autólogos puede ser más beneficiosa que otras terapias en el rejuvenecimiento facial2.
En la piel, los fibroblastos son responsables de la síntesis y secreción de proteínas extracelulares (es decir, colágeno, elastina, ácido hialurónico y glicosaminoglicanos). También liberan factores de crecimiento que regulan la función celular, la migración y las interacciones célula-matriz / célula-célula en la homeostasis normal de la piel y la cicatrización de heridas3. Los fibroblastos dérmicos ya se han introducido como una terapia celular clínica potencial para la cicatrización de heridas cutáneas4, la regeneración tisular5 o los rellenos dérmicos en procedimientos estéticos y de cirugía plástica6. Algunos estudios incluso sugieren que, en el contexto de la medicina regenerativa, los fibroblastos pueden ser una terapia celular más práctica y efectiva que las células madre mesenquimales7.
Para obtener un número suficiente de fibroblastos para aplicaciones clínicas, la expansión celular suele ser obligatoria. El cultivo celular ex vivo/in vitro requiere un medio basal suplementado con factores de crecimiento, proteínas y enzimas para apoyar la adhesión y proliferación celular. El suero fetal bovino (FBS) es un suplemento común para medios de cultivo celular, porque la sangre fetal 1) es rica en factores de crecimiento en comparación con la sangre adulta y 2) presenta un bajo contenido de anticuerpos8. A medida que avanza la terapia celular, existen preocupaciones sobre la seguridad de las condiciones clásicas de cultivo celular en las que se agrega FBS al medio de cultivo. Además, ahora hay una tendencia a reemplazar FBS con alternativas9. Varios sustitutos de FBS han mostrado resultados prometedores10.
La alternativa de plasma rico en plaquetas (PRP) ha sido seleccionada aquí, y hemos desarrollado un dispositivo médico para producir una preparación estandarizada de PRP, llamado CuteCell-PRP. El uso previsto de este dispositivo es la preparación de PRP autólogo para ser utilizado como un suplemento de medios de cultivo para la expansión in vitro de células autólogas en condiciones GMP.
El PRP se define como una suspensión plaquetaria concentrada en plasma. Debido a que existen numerosos protocolos de preparación, que difieren en 1) la cantidad de sangre necesaria, 2) los tipos de dispositivos utilizados y 3) el protocolo de centrifugación, las concentraciones de plaquetas resultantes varían de ligeramente por encima a más de 10 veces el valor basal de la sangre. Además, las preparaciones de PRP contienen niveles variables de contaminación de glóbulos rojos y blancos. Por lo tanto, la terminología "PRP" se utiliza para describir productos que varían mucho en su composición biológica y posibles efectos terapéuticos.
En la mayoría de los estudios, la sustitución de FBS se logra utilizando diferentes concentraciones de PRP que se activa (por trombina o calcio). Esta activación artificial provoca una liberación inmediata e importante de factores de crecimiento plaquetario desde 15 min hasta 24 h11. Por lo tanto, se cree que la activación plaquetaria es indeseable para aplicaciones en cultivos celulares, en los que se requiere la liberación lenta de factores de crecimiento a partir de la desgranulación plaquetaria gradual.
La terapia PRP implica la preparación de plaquetas autólogas en plasma concentrado12. La concentración óptima de plaquetas no está clara, y hay una amplia gama de dispositivos comerciales disponibles para preparar PRP13. Esta falta de estandarización se debe a la inconsistencia entre los estudios y ha llevado a una caja negra con respecto a la dosis y el momento de la inyección. Este protocolo describe un procedimiento para obtener PRP autólogo utilizando este dispositivo PRP dedicado para expandir fibroblastos de la piel en un modelo de cultivo ex vivo 100% autólogo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Actualmente existe un gran interés clínico en el uso de fibroblastos autólogos para la reparación de la piel. En la mayoría de los casos, se requiere el cultivo de células de la piel in vitro. Sin embargo, el cultivo celular que utiliza medios de cultivo xenogénicos o alogénicos tiene algunas desventajas (es decir, riesgo de transmisión de agentes infecciosos o expansión celular lenta). Aquí, se desarrolla un sistema de cultivo autólogo para la expansión de células de fibroblastos de la piel humana in vitro utilizando el propio plasma rico en plaquetas (PRP) del paciente. Los fibroblastos dérmicos humanos se aíslan del paciente mientras se somete a una abdominoplastia. Los cultivos se siguen durante un máximo de 7 días utilizando un medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) o PRP. Se evalúa el contenido de células sanguíneas en las preparaciones de PRP, la proliferación y la diferenciación de fibroblastos. Este protocolo describe el método para obtener una preparación estandarizada y no activada de PRP utilizando un dispositivo médico dedicado. La preparación requiere solo un dispositivo médico (CuteCell-PRP) y una centrífuga. Este dispositivo es adecuado en condiciones de práctica médica suficientes y es un sistema cerrado de un solo paso, apirogénico y estéril que requiere una sola centrifugación de centrifugación de centrifugación suave de 1.500 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, los componentes sanguíneos se separan y el plasma rico en plaquetas se recoge fácilmente. Este dispositivo permite una preparación rápida, consistente y estandarizada de PRP que se puede utilizar como un suplemento de cultivo celular para la expansión in vitro de células humanas. El PRP obtenido aquí contiene una concentración de plaquetas de 1,5 veces en comparación con la sangre total junta, con una eliminación preferencial de glóbulos rojos y blancos. Está demostrado que el PRP presenta un efecto potenciador en la proliferación celular en comparación con FBS (7.7x) y que los fibroblastos se activan con el tratamiento con PRP.

Esta tecnología patentada es un dispositivo médico simple, rápido y reproducible utilizado para producir preparaciones estandarizadas de PRP. Es un sistema de un solo paso, totalmente cerrado, que permite la preparación de PRP a partir de sangre total venosa después de 5 min de centrifugación a 1.500 x g (debido a la tecnología de gel separador). El PRP obtenido después de la centrifugación se elimina de los glóbulos rojos y blancos, que se encuentran debajo del gel. Después de varias inversiones del ...

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Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Este protocolo presenta un dispositivo que produce PRP para impulsar la expansión in vitro de las células en un sistema de cultivo de fibroblastos 100% autólogo.

Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Este protocolo es el sistema autólogo para el cultivo de fibroblastos humanos con plasma rico en plaquetas propio del paciente y una preparación estandarizada durante cinco minutos. El PRP promueve una expansión celular masiva de fibroblastos en cultivo. Le recomendaría que utilice este método utilizando PRP como un suplemento celular cuando necesite una expansión celular masiva y segura para terapias celulares autólogas.Cuando intente este protocolo, le recomendaría que verifique la integridad del PRP. Su plasma tiene que estar muy limpio con ausencia de glóbulos rojos. Cuando lo transfieres, tienes que hacerlo con mucho cuidado.Y con respecto a la digestión de su tejido, tiene que estar muy limpio antes de continuar. Para comenzar, gire cuidadosamente los tubos de plasma rico en plaquetas llenos de sangre, o PRP, al revés tres veces para mezclar la sangre con anticoagulante. Centrifugar las muestras de sangre a 1500 g durante cinco minutos en un rotor fijo en ángulo de 45 grados y equilibrar los tubos.Después de la centrifugación, la sangre fraccionada tiene glóbulos rojos y blancos atrapados debajo del gel separador y las plaquetas en la superficie del gel. Invierta suavemente el tubo de PRP 20 veces para resuspender el depósito de plaquetas en el sobrenadante plasmático. Asegúrese de que las plaquetas estén completamente separadas del gel y que el plasma cambie de claro y transparente a turbio.Recoja la solución plasmática del tubo utilizando un dispositivo de transferencia conectado a una jeringa de 10 mililitros. Coloque las muestras de piel en un tubo de polipropileno de 50 mililitros con PBS y agite el tubo suavemente. Si la muestra de piel es relativamente grande, colóquela en la tapa de un plato de cultivo de tejido de 150 centímetros cuadrados con el lado epidérmico hacia abajo.Retire el tejido graso subcutáneo con un par de fórceps y tijeras. Para evitar que el tejido se seque, enjuague el tejido cada pocos minutos en PBS. Cuando se complete la eliminación de grasa, use un bisturí para cortar las muestras de piel en tiras, aproximadamente 0.5 por 1.5 centímetros.A continuación, agregue cinco mililitros de mezcla de colagenasa / dispasa a un tubo estéril de 15 mililitros. Transfiera el tejido cortado al tubo. Asegúrese de que las piezas de tejido estén sumergidas en la solución y tape el tubo de forma segura.Coloque los tubos en una incubadora a 37 grados centígrados con agitación orbital durante 150 minutos. Después de la incubación, mueva el tubo que contiene el tejido al gabinete de bioseguridad. Coloque la tapa de un plato de cultivo estéril de 100 milímetros boca abajo en el gabinete de bioseguridad.Transfiera la suspensión de tejido al fondo de la placa de cultivo de 100 milímetros sin salpicaduras. Si quedan pedazos de tejido en el tubo, use una pipeta estéril de un mililitro o pinzas estériles para transferir las piezas al fondo de la placa de cultivo. Con la epidermis hacia arriba, sostenga la dermis con un par de fórceps.Agarre el borde de la epidermis con otro par de fórceps y separe la dermis y la epidermis. Manteniendo las piezas separadas en la misma tapa, coloque las piezas dérmicas en un nuevo plato de cultivo de 100 milímetros que contenga PBS. A continuación, utilizando pinzas de laboratorio, transfiera las piezas dérmicas a un tubo de polipropileno de 15 mililitros que contenga tres mililitros de Tripsina PBS al 0,3%.Incubar el tubo en un baño de agua de 37 grados centígrados y mezclar el contenido cada dos o tres minutos invirtiendo el tubo varias veces. Después de 10 a 20 minutos, detenga la reacción agregando de tres a cinco mililitros de medio de crecimiento completo helado. Vortex el tubo vigorosamente varias veces.Filtre la suspensión, que contiene los fibroblastos, a través de una malla de nylon de 85 micras en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar la solución de fibroblastos a 150 g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 100 a 200 microlitros de medio de crecimiento completo para el recuento celular.Colocar las células en un matraz de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados. A continuación, incubar el matraz a 37 grados centígrados. Cambie el medio que contiene células no adherentes al día siguiente, y nuevamente, cada tres o cuatro días.Cuando los fibroblastos alcancen 70 a 80% de confluencia, lávelos con PBS y agregue solución de tripsina-EDTA. Después de incubar el matraz durante tres minutos a 37 grados centígrados, detenga la reacción agregando de tres a cinco mililitros de medio de crecimiento completo caliente. Luego, centrifugar la suspensión celular a 200 g durante cinco minutos.Retire el sobrenadante por aspiración. Cultivar los fibroblastos en medio PRP e incubar a 37 grados centígrados. La densidad celular mínima recomendada es de 4.000 células viables por centímetro cuadrado.Se utilizó un dispositivo médico dedicado para producir PRP procesando sangre total de 10 pacientes diferentes. El dispositivo eliminó la mayoría de los glóbulos rojos y glóbulos blancos. La concentración media de plaquetas en el PRP fue aproximadamente un 50% más alta que la concentración de plaquetas en sangre total.Los fibroblastos autólogos se cultivaron en medio con 10% de FBS o en medios con concentraciones de PRP que variaron de uno a 50%Después de siete días de cultivo, sin cambiar el medio, los cultivos cebados con 20% de PRP exhibieron un mayor número de fibroblastos viables. El PRP tuvo efectos potentes como un refuerzo de la proliferación hasta 7.7 veces en comparación con FBS. La tinción con faloidina mostró que el cambio morfológico observado tras la activación del PRP estaba relacionado con la reorganización de la actina F, que es una firma de la activación de fibroblastos.Una preocupación importante de la rápida expansión celular es el riesgo de modificación genómica. Para evaluar esto, puede realizar un ensayo de hibridación genómica comparativa para evaluar la estabilidad genómica de sus células. La principal ventaja de esta técnica es reemplazar FBS por un PRP, que es un suplemento biológico autólogo más potente.Con esto, el investigador puede crecer más células más rápido sin ninguna adición de sustancias xenogénicas. Podemos utilizar esta técnica para otros tipos de células que necesitan expansión ex vivo antes de la aplicación clínica, por ejemplo, queratinocitos o células madre mesenquimales.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

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Recuperación Quirúrgica, aislamiento y<em&gt; In vitro</em&gt; Ampliación del cruzado anterior humana derivados de las células del ligamento para aplicaciones de ingeniería de tejidos

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Investigación

Bioingeniería

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