Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Vi tackar Grégory Schneiter för teknisk hjälp med flödescytometridata. Professor Muriel Cuendet (Laboratory of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Sciences och University of Geneva) för att tillåta användning av Attune-flödescytometern och Cytation 3-mikroskopet med hög genomströmning; Professor Brigitte Pittet för vetenskaplig rådgivning.

Studieprotokollet följde Helsingforsdeklarationen och alla patienter gav skriftligt informerat samtycke innan de deltog i studien. Hudprover tas från friska kvinnor som genomgår bukplastik på avdelningen för plastik, rekonstruktiv och estetisk kirurgi vid Genèves universitetssjukhus (Genève, Schweiz). Förfarandet överensstämmer med principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av den lokala institutionella etiska kommittén (protokoll #3126).
1. Förberedelse av grundförutsät...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Fördelarna med att använda autologa fibroblaster som ett naturligt alternativ jämfört med andra fyllnadsmaterial i sårcellsterapi inkluderar god biokompatibilitet, minimala biverkningar och enkel skörd och användning. Innan dessa terapier används i en daglig klinisk miljö krävs dock lämpliga prekliniska studier för att identifiera tillväxtegenskaperna och bedöma den biologiska funktionen och säkerheten hos isolerade fibroblaster både före och efter transplantation. Således, direkt efter isoleringsproces...

Regenerativ medicin syftar till att läka eller ersätta vävnader och organ som skadats av ålder, sjukdom eller trauma samt korrigera medfödda defekter. Vid autolog behandling dras celler eller vävnad ut från en patient, expanderas eller modifieras och återinförs sedan till donatorn. Denna form av terapi har bred potential inom dermatologi1. Vid autolog fibroblastbehandling odlas en patients fibroblaster och injiceras igen för att behandla rynkor, rimtider eller akneärr. Eftersom fibroblaster är de viktigaste funktionella cellerna i dermis kan injektion av autologa fibroblaster vara mer fördelaktig än andra terapier vid ansiktsföryngring2.
I huden är fibroblaster ansvariga för syntes och utsöndring av extracellulära proteiner (dvs kollagen, elastin, hyaluronsyra och glykosaminoglykaner). De frisätter också tillväxtfaktorer som reglerar cellfunktion, migration och cell-matrix / cell-cellinteraktioner vid normal hudhomeostas och sårläkning3. Dermala fibroblaster har redan introducerats som en potentiell klinisk cellterapi för sårläkning4, vävnadsregenerering5 eller hudfyllmedel vid estetiska och plastikkirurgiska ingrepp6. Vissa studier tyder till och med på att fibroblaster i samband med regenerativ medicin kan vara en mer praktisk och effektiv cellterapi än mesenkymala stamceller7.
För att erhålla ett tillräckligt antal fibroblaster för kliniska tillämpningar är cellexpansion vanligtvis obligatorisk. Ex vivo/in vitro cellodling kräver basalmedium kompletterat med tillväxtfaktorer, proteiner och enzymer för att stödja celladhesion och proliferation. Fetalt bovint serum (FBS) är ett vanligt tillskott för cellodlingsmedia, eftersom fosterblod 1) är rikt på tillväxtfaktorer jämfört med vuxenblod och 2) uppvisar ett lågt antikroppsinnehåll8. När cellterapi fortskrider finns det oro över säkerheten för klassiska cellodlingsförhållanden där FBS läggs till odlingsmediet. Dessutom finns det nu en tendens att ersätta FBS med alternativ9. Flera FBS-substitut har visat lovande resultat10.
Här har man valt alternativet med trombocytrik plasma (PRP) och vi har utvecklat en medicinteknisk produkt för att producera ett standardiserat preparat av PRP, kallat CuteCell-PRP. Den avsedda användningen av denna produkt är beredning av autolog PRP som ska användas som ett odlingsmedietillskott för in vitro-expansion av autologa celler under GMP-förhållanden.
PRP definieras som en koncentrerad trombocytsuspension i plasma. Eftersom det finns många beredningsprotokoll, som skiljer sig åt i 1) mängden blod som behövs, 2) typer av enheter som används och 3) centrifugeringsprotokoll, varierar de resulterande trombocytkoncentrationerna från något över till mer än 10x blodbaslinjevärdet. Dessutom innehåller PRP-preparat varierande nivåer av kontaminering av röda och vita blodkroppar. Terminologin "PRP" används således för att beskriva produkter som varierar mycket i sin biologiska sammansättning och potentiella terapeutiska effekter.
I de flesta studier uppnås FBS-substitution med olika koncentrationer av PRP som aktiveras (av trombin eller kalcium). Denna artificiella aktivering framkallar en omedelbar och viktig frisättning av trombocyttillväxtfaktorer från 15 min upp till 24 h11. Därför antas det att trombocytaktivering är oönskad för applikationer i cellkulturer, där långsam frisättning av tillväxtfaktorer från gradvis trombocytdegranulering krävs.
PRP-behandling innefattar beredning av autologa blodplättar i koncentrerad plasma12. Den optimala trombocytkoncentrationen är oklar och ett brett spektrum av kommersiella anordningar finns tillgängliga för att förbereda PRP13. Denna brist på standardisering beror på inkonsekvens mellan studier och har lett till en svart låda när det gäller dosering och tidpunkt för injektion. Detta protokoll beskriver en procedur för att erhålla autolog PRP med hjälp av denna dedikerade PRP-enhet för att expandera hudfibroblaster i en 100% autolog ex vivo-odlingsmodell.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Det finns för närvarande ett stort kliniskt intresse för användning av autologa fibroblaster för hudreparation. I de flesta fall krävs odling av hudceller in vitro. Cellodling med xenogena eller allogena odlingsmedier har dock vissa nackdelar (dvs. risk för överföring av smittämnen eller långsam cellexpansion). Här utvecklas ett autologt odlingssystem för expansion av humana hudfibroblastceller in vitro med hjälp av patientens egen trombocytrika plasma (PRP). Humana dermala fibroblaster isoleras från patienten medan de genomgår bukplastik. Kulturer följs i upp till 7 dagar med hjälp av ett medium kompletterat med antingen fetalt bovint serum (FBS) eller PRP. Blodkroppsinnehåll i PRP-preparat, proliferation och fibroblastdifferentiering bedöms. Detta protokoll beskriver metoden för att erhålla en standardiserad, icke-aktiverad beredning av PRP med hjälp av en dedikerad medicinsk utrustning. Preparatet kräver endast en medicinsk anordning (CuteCell-PRP) och centrifug. Denna enhet är lämplig under tillräckliga medicinska förhållanden och är ett enstegs, apyrogent och sterilt slutet system som kräver en enstegs, mjuk centrifugering av 1 500 x g i 5 minuter. Efter centrifugering separeras blodkomponenterna och den blodplättrika plasman samlas lätt upp. Denna enhet möjliggör en snabb, konsekvent och standardiserad beredning av PRP som kan användas som ett cellodlingstillskott för in vitro-expansion av humana celler. Den PRP som erhålls här innehåller en 1,5-faldig trombocytkoncentration jämfört med helblod tillsammans, med ett företrädesvis avlägsnande av röda och vita blodkroppar. Det visas att PRP har en boostrande effekt i cellproliferation jämfört med FBS (7,7x) och att fibroblaster aktiveras vid PRP-behandling.

Denna patenterade teknik är en enkel, snabb och reproducerbar medicinsk anordning som används för att producera standardiserade PRP-preparat. Det är ett helt slutet system i ett steg som möjliggör beredning av PRP från venöst helblod efter 5 minuters centrifugering vid 1 500 x g (tack vare separeringsgeltekniken). PRP erhållen efter centrifugering rensas från röda och vita blodkroppar, som sitter under gelén. Efter flera rörinversioner återsuspenderas blodplättarna som ligger ovanpå gelén i plas...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Detta protokoll presenterar en enhet som producerar PRP för att öka in vitro-expansionen av celler i ett 100% autologt fibroblastodlingssystem.

Produktion av autolog trombocytrik plasma för att öka in vitro human fibroblastexpansion

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Detta protokoll är det autologa systemet för human fibroblastkultur med patientens egen trombocytrika plasma och en standardiserad beredning i fem minuter. PRP främjar en massiv cellexpansion av fibroblast i odling. Jag skulle rekommendera dig att använda denna metod med PRP som ett celltillskott när du behöver massiv bäck och säker cellexpansion för autologa cellterapier.När du försöker detta protokoll rekommenderar jag att du kontrollerar PRP-integriteten. Din plasma måste vara mycket ren med frånvaro av röda blodkroppar. När du överför det måste du göra det mycket noggrant.Och när det gäller matsmältningen av din vävnad måste den vara mycket ren innan du fortsätter. För att börja, vrid försiktigt de blodfyllda blodplättrika plasma, eller PRP, rören upp och ner tre gånger för att blanda blodet med antikoagulant. Centrifugera blodproverna vid 1500 g i fem minuter i en fast 45-graders vinklad rotor och balansera rören.Efter centrifugering har det fraktionerade blodet röda och vita blodkroppar fångade under separeringsgelen och blodplättar på gelens yta. Vänd försiktigt upp och ned PRP-röret 20 gånger för att resuspendera trombocytavsättningen i plasmasupernatanten. Se till att trombocyterna är helt avskilda från gelén och att plasman ska ändras från klar och transparent till grumlig.Samla upp plasmalösningen från röret med hjälp av en överföringsanordning ansluten till en 10-ml spruta. Placera hudproverna i ett 50-milliliter polypropenrör med PBS och skaka röret försiktigt. Om hudprovet är relativt stort, placera det på locket på en 150 kvadratcentimeter vävnadsodlingsskål med epidermal sida nedåt.Ta bort den subkutana fettvävnaden med hjälp av en pincett och sax. För att förhindra att vävnaden torkar ut, skölj vävnaden med några minuters mellanrum i PBS. När fettborttagningen är klar, använd en skalpell för att skära hudproverna i remsor, cirka 0,5 x 1,5 centimeter.Tillsätt sedan fem milliliter kollagenas / dispaseblandning till ett sterilt 15-milliliter rör. Överför den skurna vävnaden till röret. Se till att vävnadsbitarna är nedsänkta i lösningen och täck röret ordentligt.Placera rören i en inkubator vid 37 grader Celsius med orbital skakning i 150 minuter. Efter inkubation, flytta röret som innehåller vävnaden till biosäkerhetsskåpet. Placera locket på en steril 100 millimeter odlingsskål upp och ner i biosäkerhetsskåpet.Överför vävnadssuspensionen till botten av odlingsskålen på 100 millimeter utan stänk. Om några vävnadsbitar finns kvar i röret, använd en steril en-milliliter pipett eller sterila pincett för att överföra bitarna till botten av odlingsskålen. Med epidermis uppåt, håll dermis med ett par pincett.Ta tag i kanten av epidermis med ett annat par pincett och skala dermis och epidermis isär. Håll de separerade bitarna på samma lock, placera dermalbitarna i en ny 100-millimeter odlingsskål som innehåller PBS. Därefter, med hjälp av laboratoriepincett, överför dermalbitarna till ett 15-milliliter polypropenrör innehållande tre milliliter 0,3% Trypsin PBS.Inkubera röret i ett 37-graders Celsius vattenbad och blanda innehållet varannan tre till tre minuter genom att invertera röret flera gånger. Efter 10 till 20 minuter, stoppa reaktionen genom att tillsätta tre till fem milliliter iskallt komplett tillväxtmedium. Vortex röret kraftigt flera gånger.Filtrera suspensionen, som innehåller fibroblasterna, genom ett 85-mikron nylonnät i ett 50-milliliter rör. Centrifugera fibroblastlösningen vid 150 g i 10 minuter. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 100 till 200 mikroliter komplett tillväxtmedium för cellantal.Platta cellerna i en 25 kvadratcentimeter vävnadsodlingskolv. Inkubera sedan kolven vid 37 grader Celsius. Byt mediet som innehåller icke-vidhäftande celler följande dag, och igen, var tredje till fjärde dag.När fibroblasterna når 70 till 80% sammanflöde, tvätta dem med PBS och tillsätt Trypsin-EDTA-lösning. Efter inkubation av kolven i tre minuter vid 37 grader Celsius, stoppa reaktionen genom att tillsätta tre till fem ml varmt komplett tillväxtmedium. Centrifugera sedan cellsuspensionen vid 200 g i fem minuter.Ta bort supernatanten genom aspiration. Odla fibroblasterna i PRP-medium och inkubera vid 37 grader Celsius. Den rekommenderade minsta celldensiteten är 4 000 livskraftiga celler per centimeter kvadrat.En särskild medicinsk utrustning användes för att producera PRP genom att bearbeta helblod från 10 olika patienter. Enheten tog bort majoriteten av de röda blodkropparna och vita blodkropparna. Den genomsnittliga trombocytkoncentrationen i PRP var cirka 50 % högre än trombocytkoncentrationen i helblod.Autologa fibroblaster odlades i medium med 10% FBS eller i media med PRP-koncentrationer från en till 50% Efter sju dagars kultur, utan att ändra mediet, uppvisade kulturerna grundade med 20% PRP ett högre antal livskraftiga fibroblaster. PRP hade potenta effekter som en proliferationsbooster upp till 7,7 gånger jämfört med FBS. Falloidinfärgning visade att den morfologiska förändringen som observerades vid PRP-aktivering var relaterad till F-aktinomorganisation, vilket är en signatur för fibroblastaktivering.Ett stort problem med snabb cellexpansion är risken för genomisk modifiering. För att bedöma detta kan du utföra jämförande genomisk hybridiseringsanalys för att bedöma dina cellers genomiska stabilitet. Den största fördelen med denna teknik är att ersätta FBS med en PRP, vilket är ett mer potent autologt biologiskt tillskott.Med detta kan forskare växa mer cell snabbare utan tillsats av xenogena ämnen. Vi kan använda denna teknik för andra celltyper som behöver ex vivo-expansion före klinisk tillämpning, till exempel keratinocyt eller mesenkymal stamcell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Utbyggnad av mänskliga Främre korsband-härledda celler för Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering av leukocyt-blodplättrik Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenkymala Stromacells- Kultur och leverans i Autologa Villkor: En smart strategi för ortopediska tillämpningar

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro-modell av humant kutan hypertrofisk ärrbildning med makromolekylär trängsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...