Name: production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Akış sitometrisi verileriyle ilgili teknik yardım için Sayın Grégory Schneiter'e teşekkür ederiz; Profesör Muriel Cuendet (Farmakognozi Laboratuvarı, Farmasötik Bilimler Fakültesi ve Cenevre Üniversitesi), Attune akış sitometresinin ve Cytation 3 yüksek verimli mikroskobun kullanımına izin verdiği için; Profesör Brigitte Pittet bilimsel tavsiyeler için.

Çalışma protokolü Helsinki Deklarasyonu'na uyuyordu ve tüm hastalar çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Cenevre Üniversitesi Hastaneleri (Cenevre, İsviçre) Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Bölümü'nde abdominoplasti uygulanan sağlıklı kadınlardan deri örnekleri alınmaktadır. Prosedür, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygundur ve yerel kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol #3126).
1. PRP hazırlanması</p...

<ol>
	<li>Kumar, S., Mahajan, B. B., Kaur, S., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+therapies+in+dermatology.">Autologous therapies in dermatology.</a> The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 7 (12), 38-45 (2014).</li><li>Martin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survey+on+cellular+and+engineered+tissue+therapies+in+Europe+in+2009.">The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2009.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2221-2230 (2011).</li><li>Stunova, A., Vistejnova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+fibroblasts-A+heterogeneous+population+with+regulatory+function+in+wound+healing.">Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 39, 137-150 (2018).</li><li>Thangapazham, R. L., Darling, T. N., Meyerle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+skin+properties+with+autologous+dermal+fibroblasts.">Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (5), 8407-8427 (2014).</li><li>Costa-Almeida, R., Soares, R., Granja, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+maestros+orchestrating+tissue+regeneration.">Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 240-251 (2018).</li><li>Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+cell+therapy:+will+it+replace+dermal+fillers.">Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 21 (2), 299-304 (2013).</li><li>Ichim, T. E., O'Heeron, P., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+as+a+practical+alternative+to+mesenchymal+stem+cells.">Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 212 (2018).</li><li>Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+the+use+of+fetal+bovine+serum:+serum-free+cell+culture.">Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.</a> ALTEX. 20 (4), 275-281 (2003).</li><li>Karnieli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+introduction+to+serum+replacements+and+serum-free+media+for+cellular+therapies.">A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies.</a> Cytotherapy. 19 (2), 155-169 (2017).</li><li>van der Valk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS):+Past+-+Present+-+Future.">Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present - Future.</a> ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).</li><li>Cavallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma:+The+Choice+of+Activation+Method+Affects+the+Release+of+Bioactive+Molecules.">Platelet-Rich Plasma: The Choice of Activation Method Affects the Release of Bioactive Molecules.</a> BioMed Research International. 2016, 6591717 (2016).</li><li>Peng, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+for+Skin+Rejuvenation:+Facts,+Fiction,+and+Pearls+for+Practice.">Platelet-Rich Plasma for Skin Rejuvenation: Facts, Fiction, and Pearls for Practice.</a> Facial Plastic Surgery Clinics of North America. 27 (3), 405-411 (2019).</li><li>Fadadu, P. P., Mazzola, A. J., Hunter, C. W., Davis, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+concentration+yields+in+commercially+available+platelet-rich+plasma+(PRP)+systems:+a+call+for+PRP+standardization.">Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization.</a> Regional Anesthesia and Pain Medicine. 44, 652-659 (2019).</li><li>Berndt, S., Turzi, A., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Platelet-Rich+Plasma+(CuteCell+PRP)+Safely+Boosts+In+Vitro+Human+Fibroblast+Expansion.">Autologous Platelet-Rich Plasma (CuteCell PRP) Safely Boosts In Vitro Human Fibroblast Expansion.</a> Tissue Engineering. Part A. 25 (21-22), 1550-1563 (2019).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+studies+on+autologous+cultured+human+skin+fibroblast+transplantation.">Preclinical safety studies on autologous cultured human skin fibroblast transplantation.</a> Cell Transplantation. 23 (1), 39-49 (2014).</li><li>Lee, E. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Autologous+Cultured+Fibroblast+Cells+as+a+Treatment+for+Patients+with+Facial+Contour+Defects:+A+Clinical+Replication+Study.">Efficacy of Autologous Cultured Fibroblast Cells as a Treatment for Patients with Facial Contour Defects: A Clinical Replication Study.</a> Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications. 7, 306-317 (2017).</li><li>Eca, L. P., Pinto, D. G., de Pinho, A. M., Mazzetti, M. P., Odo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+culture+in+the+repair+of+aging+skin.">Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin.</a> Dermatologic Surgery. 38 (2), 180-184 (2012).</li><li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+fibroblast+suspension+for+the+treatment+of+refractory+diabetic+foot+ulcer.">Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer.</a> Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 82 (1), 105-106 (2016).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Platelet+Lysate+as+a+Functional+Substitute+for+Fetal+Bovine+Serum+in+the+Culture+of+Human+Adipose+Derived+Stromal/Stem+Cells.">Human Platelet Lysate as a Functional Substitute for Fetal Bovine Serum in the Culture of Human Adipose Derived Stromal/Stem Cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Atashi, F., Jaconi, M. E., Pittet-Cuenod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma:+a+biological+supplement+to+enhance+adipose-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 253-262 (2015).</li><li>Martinez-Zapata, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+platelet-rich+plasma+for+treating+chronic+wounds.">Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. (5), (2016).</li><li>Cervelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+platelet-rich+plasma+and+hyaluronic+acid+in+the+loss+of+substance+with+bone+exposure.">Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure.</a> Advances in Skin &amp; Wound Care. 24 (4), 176-181 (2011).</li><li>Nicoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hidradenitis+suppurativa+treatment+using+platelet-rich+plasma+gel+and+Hyalomatrix.">Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix.</a> International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).</li><li>Gentile, P., Bottini, D. J., Spallone, D., Curcio, B. C., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+platelet-rich+plasma+in+maxillofacial+surgery:+clinical+evaluation.">Application of platelet-rich plasma in maxillofacial surgery: clinical evaluation.</a> The Journal of Craniofacial Surgery. 21 (3), 900-904 (2010).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjunctive+Platelet-Rich+Plasma+(PRP)+in+Infrabony+Regenerative+Treatment:+A+Systematic+Review+and+RCT's+Meta-Analysis.">Adjunctive Platelet-Rich Plasma (PRP) in Infrabony Regenerative Treatment: A Systematic Review and RCT's Meta-Analysis.</a> Stem Cells International. 2018, 9594235 (2018).</li><li>Everts, P. A., Pinto, P. C., Girao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+pure+platelet-rich+plasma+injections+for+facial+skin+rejuvenation:+Biometric+instrumental+evaluations+and+patient-reported+outcomes+to+support+antiaging+effects.">Autologous pure platelet-rich plasma injections for facial skin rejuvenation: Biometric instrumental evaluations and patient-reported outcomes to support antiaging effects.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 18 (4), 985-995 (2019).</li><li>Fiaschetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+and+ultrasound+evaluation+after+breast+autologous+fat+grafting+combined+with+platelet-rich+plasma.">Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 498-509 (2013).</li><li>Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Reconstruction+with+Enhanced+Stromal+Vascular+Fraction+Fat+Grafting:+What+Is+the+Best+Method.">Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 3 (6), 406 (2015).</li><li>Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platlet+Rich+Plasma+(PRP)+Improves+Fat+Grafting+Outcomes.">Platlet Rich Plasma (PRP) Improves Fat Grafting Outcomes.</a> World Journal of Plastic Surgery. 2 (1), 6-13 (2013).</li><li>Muraglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+Supplements+Derived+from+Human+Platelet+and+Plasma:+Cell+Commitment+and+Proliferation+Support.">Culture Medium Supplements Derived from Human Platelet and Plasma: Cell Commitment and Proliferation Support.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 66 (2017).</li><li>Ferrao, A. V., Mason, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+heparin+on+cell+proliferation+and+type-I+collagen+synthesis+by+adult+human+dermal+fibroblasts.">The effect of heparin on cell proliferation and type-I collagen synthesis by adult human dermal fibroblasts.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1180 (3), 225-230 (1993).</li><li>Gonzalez-Delgado, P., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitivity+reactions+to+heparins.">Hypersensitivity reactions to heparins.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (4), 315-322 (2016).</li><li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cu&#233;nod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways.">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (8), (2015).</li></ol>

Otolog fibroblastların yara hücresi tedavisinde diğer dolgu maddelerine kıyasla doğal bir alternatif olarak kullanılmasının avantajları arasında iyi biyouyumluluk, minimal yan etkiler ve hasat ve kullanım kolaylığı sayılabilir. Bununla birlikte, bu terapötikleri günlük klinik ortamda kullanmadan önce, büyüme özelliklerini tanımlamak ve transplantasyondan önce ve sonra izole fibroblastların biyolojik fonksiyonunu ve güvenliğini değerlendirmek için uygun klinik öncesi çalışmalar gereklidir....

Rejeneratif tıp, yaş, hastalık veya travma nedeniyle hasar gören doku ve organları iyileştirmeyi veya değiştirmeyi ve konjenital kusurları düzeltmeyi amaçlar. Otolog tedavide, hücreler veya dokular bir hastadan çekilir, genişletilir veya değiştirilir, daha sonra donöre yeniden verilir. Bu terapötik form, dermatoloji alanında geniş bir potansiyele sahiptir1. Otolog fibroblast tedavisinde, bir hastanın fibroblastları kırışıklıkları, ritidleri veya akne izlerini tedavi etmek için kültürlenir ve yeniden enjekte edilir. Fibroblastlar dermisteki ana fonksiyonel hücreler olduğundan, otolog fibroblastların enjeksiyonu yüz gençleştirmede diğer tedavilerden daha faydalı olabilir2.
Deride, fibroblastlar hücre dışı proteinlerin (yani kollajen, elastin, hyaluronik asit ve glikozaminoglikanlar) sentezinden ve salgılanmasından sorumludur. Ayrıca normal cilt homeostazında ve yara iyileşmesinde hücre fonksiyonunu, göçünü ve hücre-matriks/hücre-hücre etkileşimlerini düzenleyen büyüme faktörlerini serbest bırakırlar3. Dermal fibroblastlar, estetik ve plastik cerrahi prosedürlerinde cilt yara iyileşmesi4, doku rejenerasyonu5 veya dermal dolgu maddeleri için potansiyel bir klinik hücre tedavisi olarak tanıtılmıştır6. Bazı çalışmalar, rejeneratif tıp bağlamında, fibroblastların mezenkimal kök hücrelerden daha pratik ve etkili bir hücre tedavisi olabileceğini düşündürmektedir7.
Klinik uygulamalar için yeterli sayıda fibroblast elde etmek için, hücre genişlemesi genellikle zorunludur. Ex vivo / in vitro hücre kültürü, hücre yapışmasını ve çoğalmasını desteklemek için büyüme faktörleri, proteinler ve enzimlerle desteklenmiş bazal ortam gerektirir. Fetal sığır serumu (FBS), hücre kültürü ortamı için yaygın bir takviyedir, çünkü fetal kan 1) yetişkin kanına kıyasla büyüme faktörleri bakımından zengindir ve 2) düşük antikor içeriği sunar8. Hücre tedavisi ilerledikçe, FBS'nin kültür ortamına eklendiği klasik hücre kültürü koşullarının güvenliği konusunda endişeler vardır. Ayrıca, şimdi FBS'yi alternatif9 ile değiştirme eğilimi var. Birkaç FBS yedeği umut verici sonuçlar göstermiştir10.
Burada trombositten zengin plazma (PRP) alternatifi seçildi ve PRP'nin CuteCell-PRP adlı standart bir preparatını üretmek için tıbbi bir cihaz geliştirdik. Bu cihazın kullanım amacı, GMP koşulları altında otolog hücrelerin in vitro genişlemesi için bir kültür ortamı takviyesi olarak kullanılmak üzere otolog PRP'nin hazırlanmasıdır.
PRP, plazmada konsantre trombosit süspansiyonu olarak tanımlanır. 1) ihtiyaç duyulan kan miktarı, 2) kullanılan cihaz türleri ve 3) santrifüjleme protokolünde farklılık gösteren çok sayıda hazırlık protokolü olduğundan, ortaya çıkan trombosit konsantrasyonları kan bazal değerinin biraz üstünden 10 katından fazlasına kadar değişir. Ek olarak, PRP preparatları değişken seviyelerde kırmızı ve beyaz kan hücresi kontaminasyonu içerir. Bu nedenle "PRP" terminolojisi, biyolojik bileşimlerinde ve potansiyel terapötik etkilerinde büyük farklılıklar gösteren ürünleri tanımlamak için kullanılır.
Çoğu çalışmada, FBS ikamesi, aktive edilen farklı PRP konsantrasyonları kullanılarak (trombin veya kalsiyum ile) elde edilir. Bu yapay aktivasyon, trombosit büyüme faktörlerinin 15 dakikadan 24 saate kadar11 saate kadar derhal ve önemli bir şekilde salınmasına neden olur. Bu nedenle, trombosit aktivasyonunun, kademeli trombosit degranülasyonundan büyüme faktörlerinin yavaş salınımının gerekli olduğu hücre kültürlerindeki uygulamalar için istenmeyen bir durum olduğuna inanılmaktadır.
PRP tedavisi, konsantre plazma12'de otolog trombositlerin hazırlanmasını içerir. Optimal trombosit konsantrasyonu belirsizdir ve PRP13'ü hazırlamak için çok çeşitli ticari cihazlar mevcuttur. Bu standardizasyon eksikliği, çalışmalar arasındaki tutarsızlıktan kaynaklanmaktadır ve enjeksiyonun dozu ve zamanlaması ile ilgili bir kara kutuya yol açmıştır. Bu protokol, %100 otolog ex vivo kültür modelinde cilt fibroblastlarını genişletmek için bu özel PRP cihazını kullanarak otolog PRP elde etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well black clear flat bottom</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>32/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell trace Violet Dye</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td>180 assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuteCell PRP</td>
			<td>Regen Lab SA</td>
			<td>CC-PRP-3T</td>
			<td>3 tubes per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Counter</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>KK-21N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000E Liquemine</td>
			<td>Drossapharm AG</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>2x 5 mg per package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Pyruvate 1mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
			<td>300 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1x 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of autologous platelet-rich plasma for boosting in vitro human fibroblast expansion

Günümüzde otolog fibroblastların cilt onarımı için kullanımına büyük klinik ilgi vardır. Çoğu durumda, in vitro cilt hücrelerinin kültürü gereklidir. Bununla birlikte, ksenojenik veya allojenik kültür ortamını kullanan hücre kültürünün bazı dezavantajları vardır (yani, enfeksiyöz ajan iletimi veya yavaş hücre genişlemesi riski). Burada, bir hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması (PRP) kullanılarak insan derisi fibroblast hücrelerinin in vitro genişlemesi için otolog bir kültür sistemi geliştirilmiştir. İnsan dermal fibroblastları abdominoplasti yapılırken hastadan izole edilir. Kültürler, fetal sığır serumu (FBS) veya PRP ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak 7 güne kadar takip edilir. PRP preparatlarında kan hücresi içeriği, proliferasyonu ve fibroblast farklılaşması değerlendirilir. Bu protokol, özel bir tıbbi cihaz kullanarak standartlaştırılmış, aktive edilmemiş bir PRP preparatı elde etme yöntemini açıklamaktadır. Hazırlık sadece bir tıbbi cihaz (CuteCell-PRP) ve santrifüj gerektirir. Bu cihaz, yeterli tıbbi uygulama koşulları altında uygundur ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'lık tek, yumuşak bir spin santrifüjleme gerektiren tek adımlı, aprilojenik ve steril bir kapalı sistemdir. Santrifüjlemeden sonra, kan bileşenleri ayrılır ve trombosit bakımından zengin plazma kolayca toplanır. Bu cihaz, insan hücrelerinin in vitro genişlemesi için bir hücre kültürü takviyesi olarak kullanılabilecek hızlı, tutarlı ve standartlaştırılmış bir PRP preparatına izin verir. Burada elde edilen PRP, kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin tercihli olarak uzaklaştırılmasıyla, birlikte tam kana kıyasla 1.5 kat trombosit konsantrasyonu içerir. PRP'nin FBS'ye (7.7x) kıyasla hücre proliferasyonunda artırıcı bir etki gösterdiği ve PRP tedavisi üzerine fibroblastların aktive olduğu gösterilmiştir.

Bu patentli teknoloji, standartlaştırılmış PRP preparatları üretmek için kullanılan basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir tıbbi cihazdır. 1.500 x g'de 5 dakikalık santrifüjlemeden sonra (ayırıcı jel teknolojisi nedeniyle) PRP'nin venöz tam kandan hazırlanmasını sağlayan tek adımlı, tamamen kapalı bir sistemdir. Santrifüjleme sonrası elde edilen PRP, jelin altına oturan kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden temizlenir. Birkaç tüp inversiyonundan sonra jelin üstünde bulunan trombosi...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion at JoVE.com

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Bu protokol, %100 otolog fibroblast kültür sisteminde hücrelerin in vitro genişlemesini artırmak için PRP üreten bir cihaz sunar.

In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Bu protokol, hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması ve beş dakika boyunca standartlaştırılmış bir preparat ile insan fibroblast kültürü için otolog bir sistemdir. PRP, kültürde fibroblastın büyük bir hücre genişlemesini teşvik eder. Otolog hücre tedavileri için masif dere ve güvenli hücre genişlemesine ihtiyaç duyduğunuzda PRP'yi hücre takviyesi olarak kullanarak bu yöntemi kullanmanızı tavsiye ederim.Bu protokolü denediğinizde PRP bütünlüğünü kontrol etmenizi tavsiye ederim. Plazmanız, kırmızı kan hücrelerinin yokluğunda çok temiz olmalıdır. Aktardığınızda, çok dikkatli bir şekilde yapmanız gerekir.Ve dokunuzun sindirimi ile ilgili olarak, devam etmeden önce çok temiz olması gerekir. Başlamak için, kanı antikoagülanla karıştırmak için kanla dolu trombosit bakımından zengin plazma veya PRP tüplerini dikkatlice üç kez baş aşağı çevirin. Kan örneklerini sabit 45 derecelik açılı bir rotorda beş dakika boyunca 1500g'de santrifüj edin ve tüpleri dengeleyin.Santrifüjlemeden sonra, fraksiyone edilmiş kan, jelin yüzeyindeki ayırıcı jel ve trombositlerin altında sıkışmış kırmızı ve beyaz kan hücrelerine sahiptir. Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kez yavaşça ters çevirin. Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından ve plazmanın berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmesinden emin olun.10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı bir transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten toplayın. Cilt örneklerini PBS ile 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe yerleştirin ve tüpü yavaşça sallayın. Cilt örneği nispeten büyükse, epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde 150 santimetrekarelik bir doku kültürü kabının kapağına yerleştirin.Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın. Yağ alımı tamamlandığında, cilt örneklerini yaklaşık 0,5 x 1,5 santimetre şeritler halinde kesmek için bir neşter kullanın.Daha sonra, steril 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre Kollajenaz / Dispase karışımı ekleyin. Kesilen dokuyu tüpe aktarın. Doku parçalarının çözeltiye batırıldığından emin olun ve tüpü güvenli bir şekilde kapatın.Tüpleri 150 dakika boyunca orbital sallanarak 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine taşıyın. 100 milimetrelik steril bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin.Doku süspansiyonunu sıçramadan 100 milimetrelik kültür kabının altına aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, parçaları kültür kabının altına aktarmak için steril bir mililitrelik pipet veya steril forseps kullanın. Epidermis yukarı bakacak şekilde, dermisi bir çift forseps ile tutun.Epidermisin kenarını başka bir forseps çifti ile kavrayın ve dermis ile epidermisi birbirinden ayırın. Ayrılan parçaları aynı kapakta tutarak, dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 milimetrelik kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları üç mililitre% 0.3 Tripsin PBS içeren 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın.Tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek içeriği her iki ila üç dakikada bir karıştırın. 10 ila 20 dakika sonra, üç ila beş mililitre buz gibi soğuk tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin.Fibroblastları içeren süspansiyonu 85 mikronluk bir naylon ağdan 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Fibroblast çözeltisini 150 g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücre peletini 100 ila 200 mikrolitre tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.Hücreleri 25 santimetrekarelik bir doku kültürü şişesinde kaplayın. Ardından, şişeyi 37 santigrat derecede inkübe edin. Yapışkan olmayan hücreleri içeren ortamı ertesi gün ve yine her üç ila dört günde bir değiştirin.Fibroblastlar% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, PBS ile yıkayın ve Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika inkübe ettikten sonra, üç ila beş mililitre sıcak tam büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 200 g'da santrifüj edin.Süpernatantı aspirasyonla çıkarın. PRP ortamında fibroblastları kültürleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Önerilen minimum hücre yoğunluğu, santimetre kare başına 4.000 canlı hücredir.10 farklı hastadan tam kan işlenerek PRP üretmek için özel bir tıbbi cihaz kullanıldı. Cihaz, kırmızı kan hücrelerinin ve beyaz kan hücrelerinin çoğunu çıkardı. PRP'deki ortalama trombosit konsantrasyonu, tam kandaki trombosit konsantrasyonundan yaklaşık %50 daha yüksekti.Otolog fibroblastlar% 10 FBS ile ortamda veya% bir ila% 50 arasında değişen PRP konsantrasyonlarına sahip ortamlarda yetiştirildiYedi günlük kültürden sonra, ortamı değiştirmeden,% 20 PRP ile hazırlanan kültürler daha fazla sayıda canlı fibroblast sergiledi. PRP, FBS'ye kıyasla 7.7 kata kadar proliferasyon arttırıcı olarak güçlü etkilere sahipti. Phalloidin boyaması, PRP aktivasyonu üzerine gözlenen morfolojik değişikliğin, fibroblast aktivasyonunun bir imzası olan F-aktin reorganizasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir.Hızlı hücre genişlemesinin önemli bir endişesi, genomik modifikasyon riskidir. Bunu değerlendirmek için, hücrelerinizin genomik stabilitesini değerlendirmek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon testi yapabilirsiniz. Bu tekniğin temel avantajı, FBS'yi daha güçlü bir otolog biyolojik takviye olan bir PRP ile değiştirmektir.Bununla, araştırmacı herhangi bir ksenojenik madde ilavesi olmadan daha hızlı hücre büyütebilir. Bu tekniği klinik uygulamadan önce ex vivo genişlemeye ihtiyaç duyan diğer hücre tipleri için de kullanabiliriz, örneğin keratinosit veya mezenkimal kök hücre.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em&gt; In vitro</em&gt; Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Lökosit-trombosit Zengin Fibrin, Yeni Bir Biyomateryalinin Karakterizasyonu

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mezenkimal Stromal Otolog Koşullarında Hücre Kültürü ve Teslimat: Ortopedik Uygulamalar için Akıllı Yaklaşım

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...