Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. anerkender taknemmeligt den finansielle støtte fra La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), især et ph.d.-stipendium til TV Vi anerkender også Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrig) for hans dyrebare tekniske råd.

1. Syntese af ULA: propargyl-lysin (PrK)
<ol><li>Syntese afN α-Boc-propargyl-lysin18<ol>
<li>500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) opløses i en blanding af vandige 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monteres kolben med et siliciumskvæg.</li>
		<li>Kolben afkøles i et isbad, og der tilsættes derefter 158 μL propargylchloroformat (1,62 mmol) dråbevis (over en periode på 2-3 minutter) ved hjælp af en mikrosyring under omrøring.</li>
		<li>Reaktionsblandingen opvarme...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Site-rettet mutagenesis er en enkel strategi for at indarbejde specifikke aminosyrer på en defineret position af et protein, som stadig næppe anvendes med det formål at forberede glycoconjuga vacciner7,8,14. Klassisk mutagenese baseret på 20 naturlige aminosyrer tilgang er yderst effektiv, da ingen ændring af oversættelsen maskiner er påkrævet. Cysteine mutationer er normalt målrettet til yderligere at udforske den unik...

Glycoconjuga vacciner er væsentlige elementer i vaccinen arsenal til rådighed for profylaktisk behandling af smitsomme sygdomme. De er sikre, veltolererede og effektive i en bred aldersgruppe, herunder små børn. De giver det optimale forsvar mod infektioner forårsaget af kapsulerede bakterier som meningococcus, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b1. Glycoconjuga vacciner er lavet af renset bakterielle polysaccharider, der danner kapsler af bakterier eller syntetiske oligosaccharider, der efterligner disse overflade-udtrykt polysaccharider2, som er kovalent knyttet til et luftfartsselskab protein. Tilstedeværelsen af et bærerprotein er afgørende for at fremme beskyttende humoral immunrespons rettet mod den antigene determinant udtrykt af kulhydratantigener3. Bortset fra en omhyggelig udvælgelse og produktion af kulhydratantigenet er de funktioner, der vides at påvirke effekten af en glycoconjuga-vaccine: luftfartsselskabets proteins art, bøjningskemien (herunder linkerens art og længde, hvis den anvendes), eller saccharid/proteinforhold3. Det er klart, at de positioner, hvor saccharid er konjugeret til proteinet samt antallet af forbindelsespunkter, er relevante for immunogenicitet. Til dato er disse to parametre næppe blevet undersøgt, fordi præparatet af glykokonjugates stadig i vid udstrækning er empirisk. Deres syntese normalt er afhængig af brugen af amin eller carboxylsyre funktioner af henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekæde rester til stede på luftfartsselskabet protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding af glycoconjugates.
Afspilning på reaktivitet, tilgængelighed eller fordeling af aminosyrerester i proteinet giver anledning til mere definerede glycoconjugates, der er mere pålidelige til at dokumentere effekten af saccharid/proteinforbindelse4. Et skridt fremad mod dette mål kan opnås ved at anvende protein glycan kobling teknologi, en rekombinant proces, der gør det muligt at producere kontrollerede glycoconjuga vacciner i celle fabrikker5,6. Glycosylationen finder dog udelukkende sted ved en asparagin rest i D/EXNYS/T sequons (hvor X er en ud af de 20 naturlige aminosyrer), ikke naturligt forekommer på bæreproteinerne.
Selektiv mutagenese på stedet og navnlig inkorporering af cystein for at udnytte deres stærkt og selektive reaktivitet fremstår som et alternativ7,8. Produktion af bæreproteiner, der inkorporerer UAA'er i deres rækkefølge, kan give endnu mere fleksibilitet til homogent glykokonjugatvaccinepræparat. Der er udviklet og inkorporeret mere end 100 AUA'er i forskellige proteiner9,10. Mange af dem indeholder bioorthogonale funktioner, der normalt anvendes til at udføre post translationellemodifikationer 11 eller til at pode biofysiskesonder 12 eller narkotika13, men som er ideelle håndtag til yderligere bøjning med kulhydratantigener. Vellykkede eksempler er blevet hævdet af Biotech14 ved hjælp af celle-fri proteinsyntese15, men forberedelse af glycoconjuga vacciner i henhold til denne strategi stadig venter på at blive populariseret.
Anvendelse af in vivo-strategien for produktion af muteret bæreprotein kræver en modificeret translationel maskine, der omfatter en specifik codon, et tRNA, der anerkender codon og en aminoacyl-tRNA-syntetase (aaRS), som specifikt katalyser overførsel af ULA på tRNA (Figur 1)16. Den pyrrolysin rav stop codon undertrykkelse er en af de mest udbredte metoder til at indarbejde ULA, især propargyl-lysin (PrK)17. Sidstnævnte kan til gengæld reagere med azido-funktionaliserede kulhydrat haptens at give fuldt definerede, homogene glycoconjugates. I det foreliggende manuskript beskriver vi, hvordan vi syntetiserer propargyl-L-lysin, en UAA med et alkynehåndtag, hvordan det indarbejdes i et målprotein under oversættelsen i en bakterie, og endelig hvordan man udfører bøjning mellem det modificerede protein og en hapten, der bærer en azide-funktion ved hjælp af klikkemi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

Genetisk kode ekspansion er et kraftfuldt værktøj til at indføre unaturlige aminosyrer (UAAs) i proteiner til at ændre deres egenskaber, til at studere eller skabe nye protein funktioner eller at få adgang til protein konjugater. Stop codon undertrykkelse, især rav codon undertrykkelse, har vist sig som den mest populære metode til genetisk indføre UAAs på definerede positioner. Denne metode anvendes heri til fremstilling af et bærerprotein, der indeholder et ULA, der huser en bioorthogonal funktionel gruppe. Dette reaktive håndtag kan derefter bruges til specifikt og effektivt at pode en syntetisk oligosaccharid hapten at give en homogen glycoconjuga vaccine. Protokollen er begrænset til syntesen af glycoconjugates i en 1:1 kulhydrat hapten / luftfartsselskab protein forhold, men modtagelig for mange par biorthogonal funktionelle grupper. Glycoconjugate vaccine homogenitet er et vigtigt kriterium for at sikre fuldstændig fysisk-kemisk karakterisering, og dermed opfylder flere og mere krævende narkotika regulering agentur anbefalinger, et kriterium, som er uopfyldt af klassiske bøjning strategier. Desuden gør denne protokol det muligt at finjustere strukturen af den faktiske konjugatvaccine, hvilket giver anledning til værktøjer til at løse struktur-immunogenicitet relationer.

I dette projekt blev der fremstillet en homogen glykokonjugavaccine ved hjælp af den gule codon-undertrykkelsesstrategi for at indføre en ULA på et defineret sted (figur 1). Pneumoccocal overflade adhæsin A blev valgt som bærer protein moiety. Dette protein er stærkt bevaret og udtrykt af alle stammer af Streptococcus pneumoniae22. Det er meget immunogent og tidligere anvendt som bærer i pneumokokvaccineformuleringer<su...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetisk kode ekspansion anvendes til indførelse af en unaturlig aminosyre forsynet med en biorthogonal funktionel gruppe på et bæreprotein på et defineret sted. Den biorthogonale funktion anvendes yderligere til den stedselektive kobling af et kulhydratantigen for at give en homogen glykokonjugavaccine.

Homogen glycoconjugate produceret af kombineret unaturlig aminosyre inkorporering og klikkemi til vaccineformål

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Det overordnede mål med denne procedure er at producere en homogen glycoconjuga vaccine ved at kombinere ikke-kanoniske aminosyre inkorporering og klik-kemi. Genetisk kode ekspansion er et kraftfuldt værktøj til at indarbejde unaturlige aminosyrer i proteiner til at ændre deres egenskaber, til at studere eller skabe nye protein funktioner, eller at have adgang til protein konjugatter. En codon undertrykkelse metode har vist sig som den mest populære metode til at indarbejde unaturlige aminosyrer på forskellige positioner.Denne metode vil her blive anvendt til produktion af et proteinbærer, der indeholder en unaturlig aminosyre, der huser en bioorthogonal funktionel gruppe. Dette reaktive håndtag kan derefter bruges til specifikt og effektivt at pode en syntetisk oligosaccharid hapten at give en homogen glycoconjuga vaccine. Den propargyl-lysin, PrK, er syntetiseret i to trin fra kommercielle Boc-lysin.I det første trin, den ubeskyttede amino gruppe af Boc-lysin konverteres til propargyl chloroformate. I et andet trin, alfa amino gruppe er de-beskyttet. At syntetisere N (alpha)Boc-propargyl-lysin, først opløse 500 milligram Boc-lysin i blandingen af fem milliliter vandige en kindtand NaOH og fem milliliter THF i en kolbe og passer kolben med en silicium septum.Kolben afkøles i et isbad, og vent på, at pulveret opløses. Derefter tilsættes propargyl chloroformate drop-wise over en to til tre minutters periode under omrøring. Reaktionsblandingen opvarmes ved stuetemperatur, og omrøringen fortsættes i 10 timer.Nedkøl opløsninger af diethylether, vandig en molar saltsyre, og ethylacetat. Køl den rå reaktionsblanding ned i et isbad. Hæld blandingen i en skilletragt.Der udvindes en blanding med halvtreds milliliter diethylether. Ekstraktion kan resultere i en ophobning af tryk, sørg for at frigive enhver trykoprustning ofte. Opsaml den vandige fase, og kassér det organiske lag.Tilsæt forsigtigt, halvtreds milliliter af en molar saltsyre til den vandige fase i skilletragten. Derefter udtrækkes det vandige lag to gange ved hjælp af tredive milliliter ethylacetat. Saml den organiske fase, Kontroller tilstedeværelsen af din sammensatte ved TLC.På dette stadium, bør det være i den organiske fase. Tør de kombinerede organiske lag over magnesiumsulfat. Filtrer den faste fase af.Og koncentrere filtrate under reduceret tryk på en roterende fordamper. Prøven af den rå olieholdige N(alpha)Boc-propargyl-lysin opløses i deutereret chloroform og kontrollere dens identitet ved NMR. At syntetisere propargyl-L-lysin, indføre N (alpha)Boc-propargyl-lysin i en rund knap kolbe udstyret med en skillevæg.Der tilsættes fire milliliter vandfri dichlormethan i kolben under argon. Tilsæt dråbemæssigt, fire milliliter trifluoretsyre under omrøring. Udskift silicium septum for et glas låg for at undgå TFA fra beskadige silicium septum.Rør reaktionsblandingen i en time ved stuetemperatur. Kontroller afbeskyttelsen af Boc-PrK med TLC. Reaktionsblandingen koncentreres under reduceret tryk.Der tilsættes diethylether til råresterne. Propargyl-L-lysin filtreres i form af et hvidt fast stof på et fritted glas. Opløs en aliquot af propargyl-L-lysin i deuteriumoxid, derefter udføre NMR analyse for at kontrollere dens identitet og renhed.Propargyl-L-lysin opløses derefter i destilleret vand ved den endelige koncentration på hundrede millimolar og opbevares ved minus 20 grader i en milliliter aliquots. At co-omdanne plasmider i udtrykket stamme, tø hundrede mikroliter aliquot af kemisk kompetente E.Coli BL21 på is i løbet af fem minutter. Tilføj en mikroliter af hver plasmid eller halvtreds til hundrede nanogram af hver i cellerne og inkubere dem i 30 minutter på is.Inkuber de kompetente celler ved 42 grader i løbet af 45 sekunder. Læg dem derefter tilbage på is i to minutter. Tilføj ni hundrede mikroliter af LB medium og inkubere under rystelser i en time ved 37 grader for at tillade antibiotika udtryk.Derefter plade de transformerede bakterier på LB agar med antibiotika. Tillad bakterier til at vokse natten over ved 37 grader. At udtrykke proteiner modificeret med PrK, vaccinere en enkelt co-transformeret koloni i fem milliliter LB medium med antibiotika.Inkuber natten over ved 37 grader med omrystning. Den næste dag, fortyndes med de fem milliliter af primær kultur i fem hundrede milliliter auto-induktion medium, der indeholder antibiotika, 0,02% af L-arabinose, og en millimolar prk og inkubere ved 37 grader i 24 timer under rystelser. Medtag en negativ kontrol ved at udføre kulturen uden PrK og den positive kontrol ved at udføre kulturen i en klon, der indeholder det vilde proteingen.Høst celler fra natten kultur ved centrifugering på 5, 000 x g i løbet af 10 minutter. Kassér supernatanten og frys pellet ved minus 20 grader. Til rensning af proteinet ved tyngdekraft flow-bænk affinitetkromatografi, resuspenderet celle pellets i tyve milliliter lysis buffer.Tilsæt DNase I og lysozym, og tillad lysis ved at inkubere suspensionen ved 37 grader i løbet af 30 minutter. Sonikere cellerne i is i løbet af fem minutter, derefter fjerne cellerester ved centrifugering ved 20, 000 x g i løbet af 30 minutter. Filtrat lysatet med 0,45 mikrometerfilter Tilsæt Ni-NTA harpiks til suspensionen.Blandes forsigtigt ved fire grader i en time. Hæld suspensionen i en polypropylen kolonne og indsamle den ubundne fraktion. Harpiksen vaskes med ti milliliter og derefter fem milliliter vaskepude.Saml vaskefraktionerne. Elute den His-mærkede protein med en millimeter af eluering buffer og gentag dette trin fire gange og indsamle alle de ekstra fraktioner. Kombiner fraktioner, der indeholder rene histidin-mærkede proteiner og dialysere det i en liter TEV protease buffer natten over ved hjælp af dialyse membran.Proteinprøven opsamls i et 50 milliliterrør, og TEV-bufferen tilsættes for at opnå en endelig koncentration på to milligram pr. milliliter i et endeligt volumen på en milliliter. Tilføj hundrede mikroliter af TEV protease. Der tilsættes 50 mikroliter på 0,1 molar DTT.Komplet med TEV buffer op til fem milliliter. Inkuber natten over ved fire grader, med langsom rysten. For at fjerne EDTA, dialyze proteinet ved fire grader natten ved hjælp af dialyse membran og fosfat buffer med fem millimolar imidazol.For at eliminere TEV protease og ufordøjede proteiner, inkubere blandingen med Ni-NTA perler og bland forsigtigt i en time ved fire grader. Hæld suspensionen i en polypropylen kolonne. Indsamlede den ubundne brøk.TEV protease og ufordøjede proteiner forbliver bundet til perlerne og det fordøjede protein eluted. Vask kolonnen med fem milliliter vaskepude, og opsaml også vaskefraktionerne. Dialysere det fordøjede protein mod en liter klikbuffer ved fire grader natten over med dialysemembran for at fjerne imidazol samt for at udskifte bufferen.Og måle koncentrationen af proteinet ved 280 nanometer. At konjugere mPsaA med 6-hexachlor-fluorescein-azide, eller en modgift-funktionaliseret kulhydrat antigen, sætte PrK muteret protein i en koncentration på 57,8 mikromolar i en to milliliter mikrorør. Tilsæt 10 mikroliter af fem millimolar azide sammensatte, tilsæt derefter en pre-blanding af kobbersulfat opløsning og THPTA.Tilsæt aminoguanidin hydrochlorid. Tilsæt extemporaneously forberedt vandig opløsning af natrium ascorbat. Luk røret, blandes ved at vende flere gange og inkubere ved stuetemperatur i to timer.Stop reaktionen ved at tilføje EDTA. Tjek bøjningen på SDS-siden. Efter migration, visualisere gelen på UV-lys på 312 nanometer til konjugat med fluorescein.Eller plette gelen med Coomassie Blue for at visualisere konjugaten med kulhydratantigenet. Som tilsætning af hapten bør fremkalde en ændring af molekylvægt. Rengør glycoconjugaten ved at anvende den på en gelfiltreringssøjle, der er ligevægtet med PBS.Opsaml de brøker, der indeholder glycoconjugates. Til længerevarende opbevaring skal glykokonjugaten dialykoges mod det destilleret vand fryses og glykokonjugaten opbevares på minus 80 grader. PrK er blevet indført på position 32 i erstatning af en lysin nær N-endestationen af PsaA.Effekten af mPsaA produktion er blevet kontrolleret af SDS side og vestlige blot analyse ved hjælp af anti-Histidin tag antistof. Tilstedeværelsen af et protein i fuld længde indikerer stærkt en vellykket inkorporering af prk. Intensiteten er dog lavere end den, der er observeret for vildtype parPsaA.Den mPsaA (K32PrK) er blevet renset på Ni-NTA perler. Med et typisk udbytte på otte mg og inkorporering af PrK-restproduktet blev endeligt bekræftet ved massespektrometri. Den Histidine tag blev fjernet på proteolytisk spaltning ved hjælp af TEV protease.Under mPsaA (K32PrK) blev alkynens reaktivitet vurderet ved hjælp af et azido-funktionaliseret fluorescein og yderligere anvendt til at konjugere et syntetisk oligosaccharidantigen. Eksperimenter blev udført i sammenligning med vilde-type parPsaA som en kontrol. Endelig blev glycoconjugaten renset ved gelfiltrering og dens identitet bekræftet af massespektrometri.I dette projekt er homogene glykokonjugavacciner blevet udarbejdet ved hjælp af den gule stopcodon suppression teknologi til at indarbejde en unaturlig aminosyre under definerede steder. Glycoconjugate vaccine homogenitet er et vigtigt kriterium for at sikre fuldstændig fysisk-kemisk karakterisering. Og dermed tilfredsstillende flere og mere krævende narkotika agentur anbefalinger.Dette kriterium er ikke opfyldt ved hjælp af den klassiske renkonjugationsmetode. Desuden gør denne protokol det muligt at finjustere strukturen af glycoconjuga vaccinen. Hvilket giver anledning til et hidtil uset redskab til at undersøge forholdet mellem homogeniteten og strukturen af en glycoconjugate.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatovering som en ny tilgang til DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Udarbejdelse af Light-responsive Membraner med et samlet overfladeareal Pode og Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fremstilling af en funktionaliseret Magnetic Bakteriel Nanocellulose med Iron Oxide Nanopartikler

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Udvikling af en flercellet Tre-dimensionel organotypisk Model af menneskelige tarmslimhinden Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Site-Directed immobilisering af ben morfogenetiske proteiner 2 til faste overflader af klik kemi

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Gyldne' fluorescens af selektiv pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer og proteinanalyse af massespektrometri og fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection af primær Renal væv segmenter og iblandingen med romanen stillads-fri konstruktion teknologi

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobielle peptider produceret af selektiv pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...