Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. erkent dankbaar de financiële steun van La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), in het bijzonder een doctoraatsbeurs voor T.V. We erkennen ook Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrijk) voor zijn kostbare technische adviezen.

1. Synthese van de VAA: propargyl-lysine (PrK)
<ol><li>Synthese van Nα-Boc-propargyl-lysine18<ol>
<li>Los 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) op in een mengsel van waterige 1 M NaOH (5 mL) en THF (5 mL) in een kolf en pas de kolf in met een siliciumepma.</li>
		<li>Koel de kolf in een ijsbad en voeg vervolgens 158 μL propargylchloroforme (1,62 mmol) dropwise (over een periode van 2-3 minuten) toe met behulp van een microsyring tijdens het roeren.</li>
		<li>Verwarm het reactiem...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Site-directed mutagenesis is een eenvoudige strategie om specifieke aminozuren op te nemen in een gedefinieerde positie van een eiwit dat nauwelijks wordt gebruikt met het doel om glycoconjugate vaccins7,8,14voor te bereiden . Klassieke mutagenesis op basis van de 20 natuurlijke aminozuren aanpak is zeer efficiënt, omdat er geen wijziging van de vertaalmachines nodig is. Cysteïne mutaties zijn meestal gericht op verdere verken...

Glycoconjugate vaccins zijn essentiële elementen van het vaccin arsenaal beschikbaar voor de profylactische behandeling van infectieziekten. Ze zijn veilig, goed verdragen en efficiënt in een brede leeftijdsgroep met inbegrip van jonge zuigelingen. Ze bieden de optimale afweer tegen infecties veroorzaakt door gekapseizeerde bacteriën zoals meningokokken, pneumokokken of Haemophilus influenzae type b1. Glycococonjugate vaccins zijn gemaakt van gezuiverde bacteriële polysaccharides die de capsules van bacteriën of synthetische oligosadariden die deze oppervlakte-uitgedrukte polysaccharidesnabootsen 2, die covalent zijn gekoppeld aan een drager eiwit. De aanwezigheid van een dragereiwit is essentieel om beschermende humorale immuunreacties te bevorderen gericht tegen de antigene determinant uitgedrukt door de koolhydraatantigenen3. Afgezien van een zorgvuldige selectie en productie van het koolhydraatantgeen, zijn de kenmerken waarvan bekend is dat ze een invloed uitoefenen op de werkzaamheid van een glycoconjugaatvaccin: de aard van het dragereiwit, de vervoegingschemie (inclusief de aard en de lengte van de linker indien gebruikt), of de saccharide/eiwitverhouding3. Uiteraard zijn de posities waarin de saccharide is vervoegd aan het eiwit en het aantal verbindingspunten relevant voor immunogeniciteit. Tot op heden zijn deze twee parameters nauwelijks bestudeerd omdat de voorbereiding van de glycoconjugates grotendeels empirisch blijft. Hun synthese is meestal gebaseerd op het gebruik van amine- of carboxylzuurfuncties van respectievelijk lysine of aspartic/glutaminezuurzijketenresten die op de dragereiwitsequentie aanwezig zijn. Dit leidt niet tot een enkele, maar tot een heterogeen mengsel van glycoconjugates.
Spelen op de reactiviteit, toegankelijkheid of distributie van de aminozuurresten in het eiwit geeft aanleiding tot meer gedefinieerde glycoconjucten die betrouwbaarder zijn om het effect van saccharide/eiwitconnectiviteit te documenteren4. Een stap voorwaarts in de richting van dit doel kan worden bereikt door het toepassen van eiwitglycan koppelingstechnologie, een recombinant proces dat de productie van gecontroleerde glycoconjugaatvaccins in celfabrieken5,6mogelijk maakt . De glycosylation vindt echter uitsluitend plaats bij een aspergesidu in D/EXNYS/T-sequons (waarbij X een van de 20 natuurlijke aminozuren is), die niet van nature aanwezig zijn op de dragereiwitten.
Plaats selectieve mutagenese en in het bijzonder de integratie van cysteines om hun zeer en selectieve reactiviteit te benutten lijkt een alternatief7,8. Productie van drager-eiwitten waarin UAA's in hun volgorde zijn verwerkt, kunnen nog meer flexibiliteit bieden voor homogene glycoconjugaatvaccinpreparaatatie. Meer dan 100 NAA's zijn ontwikkeld en verder opgenomen in verschillende eiwitten9,10. Velen van hen bevatten bioorthogonale functies meestal gebruikt voor het uitvoeren van post translationele wijzigingen11 of om biofysische sondes12 of drugs13 enten, maar die ideale handvatten voor verdere vervoeging met koolhydraat antigenen. Succesvolle voorbeelden zijn geclaimd door Biotech14 met behulp van cel-vrije eiwitsynthese15, maar de voorbereiding van glycoconjugaat vaccins volgens deze strategie wacht nog steeds op steeds gepopulariseerd.
De toepassing van de in vivo strategie voor de productie van gemuteerde dragereiwit vergt een gewijzigde translationele machinerie die een specifieke codon, een tRNA dat de codon erkent en een aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) die specifiek de overdracht van de UAA op tRNA(Figuur 1)16) katalyseert . De pyrrolysine amber stop codon onderdrukking is een van de meest gebruikte methoden om UAA op te nemen, met name de propargyl-lysine (PrK)17. Deze laatste kan op zijn beurt reageren met azido-gefunctionaliseerde koolhydraathaten om volledig gedefinieerde, homogene glycoconjugates te bieden. In het onderhavige manuscript beschrijven we hoe we het propargyl-L-lysine, een UAA met een alkynegreep, kunnen synthetiseren, hoe het tijdens de vertaling in een bacterie in een doeleiwit worden opgenomen en hoe je vervoeging uitvoeren tussen het gemodificeerde eiwit en een hapten die een azide-functie dragen met behulp van klikchemie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

Genetische code uitbreiding is een krachtig instrument om onnatuurlijke aminozuren (IA's) in eiwitten te introduceren om hun kenmerken te wijzigen, om nieuwe eiwitfuncties te bestuderen of te creëren of om toegang te hebben tot eiwitconjugaten. Stop codon onderdrukking, in het bijzonder amber codon onderdrukking, is naar voren gekomen als de meest populaire methode om genetisch te introduceren UAAs op gedefinieerde posities. Deze methode wordt hierin toegepast op de bereiding van een dragereiwit dat een UAA bevat die een bioorthogonale functionele groep herbergt. Deze reactieve handgreep kan vervolgens worden gebruikt om specifiek en efficiënt een synthetische oligosaccharide hapten te transplanteren om een homogeen glycoconjugaatvaccin te leveren. Het protocol is beperkt tot de synthese van glycoconjugates in een 1:1 koolhydraat hapten /drager eiwit verhouding, maar vatbaar voor tal van paren van biorthogonal functionele groepen. Glycococonjugate vaccin homogeniteit is een belangrijk criterium om volledige fysisch-chemische karakterisering te waarborgen, waardoor, voldoen aan meer en meer veeleisende drug regelgevende instantie aanbevelingen, een criterium dat wordt onvervuld door klassieke vervoeging strategieën. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om de structuur van het eigenlijke conjugaatvaccin nauwkeurig af te stemmen, wat aanleiding geeft tot instrumenten om structuur-immunogeniciteitsrelaties aan te pakken.

In dit project werd een homogeen glycoconjugaatvaccin voorbereid met behulp van de amberstopcodononderdrukkingsstrategie om een UAA in te voeren op een gedefinieerde locatie(figuur 1). Pneumokokken oppervlak adhesine A werd geselecteerd als de drager eiwit moiety. Dit eiwit wordt zeer geconserveerd en uitgedrukt door alle stammen van Streptococcus pneumoniae22. Het is zeer immunogeen en eerder gebruikt als drager in pneumokokk...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.

Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Het algemene doel van deze procedure is om een homogeen glycoconjugaatvaccin te produceren door niet-canonieke aminozuurinmening en klikchemie te combineren. Genetische code expansie is een krachtig instrument om onnatuurlijke aminozuren op te nemen in eiwitten om hun kenmerken te wijzigen, te bestuderen of nieuwe eiwitfuncties te creëren, of om toegang te hebben tot eiwitconjugaten. Een codon onderdrukking methode is naar voren gekomen als de meest populaire methode om onnatuurlijke aminozuren op verschillende posities op te nemen.Deze methode zal hier worden toegepast op de productie van een eiwitdrager die een onnatuurlijk aminozuur bevat dat een bioorthogonale functionele groep herbergt. Deze reactieve handgreep kan vervolgens worden gebruikt om specifiek en efficiënt een synthetische oligosaccharide hapten te transplanteren om een homogeen glycoconjugaatvaccin te leveren. De propargyl-lysine, PrK, wordt gesynthetiseerd in twee stappen van commerciële Boc-lysine.In de eerste stap wordt de onbeschermde aminogroep van de Boc-lysine omgezet in propargylchloroforme. In een tweede stap wordt de alfa-aminogroep de-beschermd. Om de N(alpha)Boc-propargyl-lysine te synthetiseren, los u eerst 500 milligram Boc-lysine op in het mengsel van vijf milliliter waterige een molar NaOH en vijf milliliter THF in een kolf en past u de kolf met een siliciumsepum.Koel de kolf af in een ijsbad en wacht tot het poeder is opgelost. Voeg vervolgens de propargyl chloroforme drop-wise over een periode van twee tot drie minuten onder roeren. Verwarm het reactiemengsel bij kamertemperatuur en blijf 10 uur roeren.Koel oplossingen van diethylether, waterige een molaire zoutzuur, en ethylacetaat. Koel het ruwe reactiemengsel af in een ijsbad. Giet het mengsel in een scheidingstrechter.Haal een mengsel uit met vijftig milliliter diethylether. Extractie kan leiden tot een opbouw van druk, zorg ervoor dat u elke druk opbouw vaak vrij te geven. Verzamel de waterfase en gooi de organische laag weg.Voeg voorzichtig, vijftig milliliter van een molaire zoutzuur aan de waterige fase in de scheidingstrechter. Haal vervolgens de waterige laag twee keer uit met dertig milliliter ethylacetaat. Verzamel de organische fase, Controleer de aanwezigheid van uw verbinding door TLC.In dit stadium moet het zich in de organische fase bevinden. Droog de gecombineerde organische lagen over magnesiumsulfaat. Filter de vaste fase eraf.En concentreer het filtraat onder verminderde druk op een roterende verdamper. Los het monster van de ruwe olieachtige N(alpha)Boc-propargyl-lysine op in gedepleated chloroform en controleer de identiteit ervan door NMR. Om de propargyl-L-lysine te synthetiseren, introduceert u de N(alpha)Boc-propargyl-lysine in een ronde knopkolf uitgerust met een septum.Voeg vier milliliter watervrije dichloormethaan toe in de kolf onder argon. Voeg drop-wise, vier milliliter trifluoroacetisch zuur onder roeren. Vervang het siliciumeptum voor een glazen deksel om te voorkomen dat TFA het siliciumepmum beschadigt.Roer het reactiemengsel een uur door bij kamertemperatuur. Controleer de bescherming van de Boc-PrK door TLC. Concentreer het reactiemengsel onder verminderde druk.Voeg diethylether toe aan het ruwe residu. Filter de propargyl-L-lysine in de vorm van een witte vaste stof op een gefriteerd glas. Los een aliquot van het propargyl-L-lysine op in deuteriumoxide en voer vervolgens NMR-analyse uit om de identiteit en zuiverheid ervan te controleren.Propargyl-L-lysine wordt vervolgens opgelost in gedestilleerd water bij de uiteindelijke concentratie van honderd millimolar en opgeslagen bij min 20 graden in één milliliter aliquots. Om plasmiden samen te zetten in de expressiestam, ontdooit u honderd microliters gedurende vijf minuten chemisch competente E.Coli BL21 op ijs. Voeg een microliter van elke plasmid of vijftig tot honderd nanogram van elk in de cellen en broed ze gedurende 30 minuten op ijs.Incubeer de bevoegde cellen op 42 graden, gedurende 45 seconden. Zet ze dan twee minuten terug in het ijs. Voeg negenhonderd microliter van LB medium en incubate onder schudden voor een uur op 37 graden om antibiotica expressie mogelijk te maken.Dan plaat de getransformeerde bacteriën op LB agar met antibiotica. Laat bacteriën 's nachts groeien op 37 graden. Om eiwitten die met PrK zijn gewijzigd, uit te drukken, inent een enkele co-getransformeerde kolonie in vijf milliliter LB-medium met antibiotica.Incubeer 's nachts bij 37 graden met schudden. De volgende dag, verdun met de vijf milliliter van de primaire cultuur in vijfhonderd milliliter van auto-inductie medium met antibiotica, 0,02% van L-arabinose, en een millimolar van PrK en incubate op 37 graden gedurende 24 uur onder schudden. Neem een negatieve controle door het uitvoeren van de cultuur zonder PrK en de positieve controle door het uitvoeren van de cultuur van een kloon met het wild-type eiwit gen.Oogst cellen uit de nachtcultuur door centrifugatie op 5,000 x g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en bevries de pellet op min 20 graden. Voor de zuivering van het eiwit door zwaartekracht flow-bench affiniteit chromatografie, resuspend de cel pellets in twintig milliliter lyse buffer.Voeg DNase I en lysozyme toe en laat lyse toe door de vering gedurende 30 minuten op 37 graden uit te broeden. Sonicate de cellen in ijs gedurende vijf minuten, verwijder dan de cel puin door centrifugatie op 20, 000 x g gedurende 30 minuten. Filtrate het lysaat met 0,45 micrometer filter Voeg Ni-NTA hars aan de suspensie.Een uur lang zachtjes gemengd op vier graden. Giet de suspensie in een polypropyleenkolom en verzamel de niet-gebonden fractie. Was de hars met tien milliliter en vervolgens vijf milliliter wasbuffer.Verzamel de wasfracties. Elute de Zijn-tagged eiwit met een millimeter elutie buffer en herhaal deze stap vier keer en het verzamelen van alle extra fracties. Combineer de breuken met pure histidine-tagged eiwitten en dialyze het in een liter TEV protease buffer 's nachts met behulp van dialyse membraan.Verzamel het eiwitmonster in een buis van 50 milliliter en voeg tev-buffer toe om een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter te verkrijgen in een eindvolume van één milliliter. Voeg honderd microliter tev protease toe. Voeg 50 microliter van 0,1 molaire DTT toe.Compleet met TEV buffer tot vijf milliliter. Incubeer 's nachts op vier graden, met langzaam schudden. Om EDTA te verwijderen, dialyseert het eiwit op vier graden 's nachts met behulp van dialysemembraan en fosfaatbuffer met vijf millimolar imidazool.Om TEV protease en onverteerde eiwitten te elimineren, ontcunig de mix met Ni-NTA kralen en meng zachtjes gedurende een uur op vier graden. Giet de suspensie in een polypropyleenkolom. Verzamelde de niet-gebonden fractie.De TEV protease en onverteerd eiwitten blijven gebonden aan de kralen en het verteerde eiwit wordt geëuterd. Was de kolom met vijf milliliter wasbuffer en verzamel ook de wasfracties. Dialyseer het verteerde eiwit tegen een liter klikbuffer op vier graden 's nachts met dialysemembraan om imidazool te verwijderen en de buffer uit te wisselen.En meet de concentratie van het eiwit op 280 nanometer. Om de mPsaA te vervoegen met 6-hexachlooreïne-fluoresceïne-azide, of een antidotisch gefunctionaliseerd koolhydraatantgeen, zet het PrK gemuteerde eiwit bij een concentratie van 57,8 micromolar in een twee milliliter microbuis. Voeg 10 microliter van vijf millimolar azide verbinding toe en voeg vervolgens een voormix van kopersulfaatoplossing en THPTA toe.Voeg aminoguanidine hydrochloride toe. Voeg extemporaneously voorbereide waterige oplossing van natrium ascorbaat. Sluit de buis, meng door meerdere keren om te keren en uit te broeden op kamertemperatuur gedurende twee uur.Stop de reactie door EDTA toe te voegen. Controleer de vervoeging op de SDS-pagina. Visualiseer na de migratie de gel op UV-licht op 312 nanometer voor de conjugaat met fluoresceïne.Of bevlek de gel met Coomassie Blue om de conjugaat te visualiseren met het koolhydraatantigeen. Als toevoeging van hapten zou een verandering van moleculair gewicht moeten veroorzaken. Zuiver de glycoconjugaat door het toe te passen op een gelfiltratiekolom die in evenwicht is met PBS.Verzamel de fracties met de glycoconjugates. Voor langdurige opslag dialyseert u de glycoconjugaat tegen het gedestilleerde water, vriest het droog en slaat u de glycoconjugaat op bij min 80 graden. De PrK is geïntroduceerd op positie 32 ter vervanging van een lysine in de buurt van het N-eindpunt van de PsaA.De werkzaamheid van de mPsaA productie is gecontroleerd door SDS pagina en westerse vlek analyse met behulp van anti-Histidine tag antilichaam. De aanwezigheid van een volledige lengte eiwit wijst sterk op de succesvolle integratie van PrK. De intensiteit is echter lager dan die waargenomen voor wild-type mPsaA.De mPsaA (K32PrK) is gezuiverd op Ni-NTA kralen. Met een typische opbrengst van acht milligram en de integratie van het Residu prk werd definitief bevestigd door massaspectrometrie. De Histidine tag werd verwijderd op proteolytische decolleté met behulp van de TEV protease.Na de mPsaA (K32PrK)werd de reactiviteit van de alkyne beoordeeld met behulp van een azido-gefunctionaliseerd fluoresceïne en verder gebruikt om een synthetisch oligosaccharideantgeen te conjuceren. Experimenten werden gedaan in vergelijking met wild-type mPsaA als een controle. Ten slotte werd de glycoconjugaat gezuiverd door gelfiltratie en zijn identiteit bevestigd door massaspectrometrie.In dit project zijn homogene glycoconjugaatvaccins voorbereid met behulp van de amberstop codon suppressie technologie om een onnatuurlijk aminozuur onder gedefinieerde locaties op te nemen. Glycoconjugate vaccin homogeniteit is een belangrijk criterium om volledige fysisch-chemische karakterisering te waarborgen. En daarmee, voldoen aan meer en meer veeleisende aanbevelingen van het drugagentschap.Aan dit criterium wordt niet voldaan door gebruik te maken van de klassieke zuivere vervoegingsmethode. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om de structuur van het glycoconjugaatvaccin fijn af te stemmen. Aanleiding voor een ongekend instrument om de relatie tussen de homogeniteit en de structuur van een glycoconjugaat te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Voorbereiding van de Light-responsieve membranen door een gecombineerde oppervlakte-enting en Postmodification Proces

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimicrobiële peptiden geproduceerd door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...