Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. remercie le soutien financier de La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program « BioSynProt »), en particulier une bourse doctorale à T.V. Nous reconnaissons également le Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, France) pour ses précieux conseils techniques.

1. Synthèse de l’UAA : propargyl-lysine (PrK)
<ol><li>Synthèse de Nα-Boc-propargyl-lysine18<ol>
<li>Dissoudre 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) dans un mélange d’aqueuse 1 M NaOH (5 mL) et THF (5 mL) dans un flacon et adapter le flacon avec un septum de silicium.</li>
		<li>Refroidir le flacon dans un bain de glace, puis ajouter 158 μL de chloroformate propargyl (1,62 mmol) dans le sens de la goutte (sur une période de 2 à 3 minutes) à l’aide d’une microsyrin...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

La mutagenèse dirigée par le site est une stratégie simple visant à incorporer des acides aminés spécifiques à une position définie d’une protéine qui reste à peine utilisée dans le but de préparer des vaccins glycoconjugate7,8,14. La mutagenèse classique basée sur l’approche des 20 acides aminés naturels est très efficace puisqu’aucune modification des machines de traduction n’est nécessaire. Les mutati...

Les vaccins glycoconjugates sont des éléments essentiels de l’arsenal vaccinal disponible pour le traitement prophylactique des maladies infectieuses. Ils sont sûrs, bien tolérés et efficaces dans un large groupe d’âge, y compris les jeunes nourrissons. Ils fournissent la défense optimale contre les infections causées par des bactéries capsulées comme le méningocoque, le pneumocoque ou Haemophilus influenzae de type b1. Les vaccins glycococonjugates sont faits de polysaccharides bactériens purifiés qui forment les capsules de bactéries ou d’oligosaccharides synthétiques qui imitent ces polysaccharides exprimés en surface2, qui sont covalents liés à une protéine porteuse. La présence d’une protéine porteuse est essentielle pour favoriser les réponses immunitaires humoristiques protectrices dirigées contre le déterminant antigénique exprimé par les antigènes de hydrate decarbone 3. Outre une sélection et une production minutieuses de l’antigène médicide, les caractéristiques connues pour exercer une influence sur l’efficacité d’un vaccin glycoconjugate sont les suivantes : la nature de la protéine porteuse, la chimie de conjugaison (y compris la nature et la longueur du lien s’il est utilisé), ou le rapport saccharide/protéine3. De toute évidence, les positions auxquelles le saccharide est conjugué à la protéine ainsi que le nombre de points de connectivité sont pertinents pour l’immunogénicité. À ce jour, ces deux paramètres n’ont guère été étudiés parce que la préparation des glycoconjugates reste largement empirique. Leur synthèse repose habituellement sur l’utilisation de fonctions d’acide amine ou carboxylique de lysine ou de résidus de chaîne latérale aspartique/glutamique présents sur la séquence des protéines porte-avions. Cela conduit non pas à un seul, mais à un mélange hétérogène de glycoconjugates.
Jouer sur la réactivité, l’accessibilité ou la distribution des résidus d’acides aminés dans la protéine donne lieu à des glycoconjugates plus définis qui sont plus fiables pour documenter l’effet de la connectivité saccharide/protéine4. Un pas en avant vers cet objectif peut être atteint en appliquant la technologie de couplage glycan de protéine, un processus recombinant qui permet la production des vaccins contrôlés de glycoconjugate dans les usines cellulaires5,6. Cependant, la glycosylation a lieu exclusivement à un résidu d’asparagine dans les séquons D/EXNYS/T (auquel cas X est l’un des 20 acides aminés naturels), non naturellement présents sur les protéines porteuses.
La mutagenèse sélective du site et en particulier l’incorporation de cystéines pour exploiter leur réactivité hautement et sélective apparaît comme une alternative7,8. La production de protéines porteuse intégrant des UUA dans leur séquence peut offrir encore plus de souplesse pour la préparation homogène du vaccin glycoconjugate. Plus de 100 AUA ont été développés et incorporés dans diverses protéines9,10. Beaucoup d’entre eux contiennent des fonctions bioorthogonales habituellement utilisées pour effectuer des modifications post-translationnelles11 ou pour greffer des sondes biophysiques12 oudes médicaments 13, mais qui sont des poignées idéales pour une conjugaison plus approfondie avec les antigènes glucides. Des exemples réussis ont été revendiqués par Biotech14 en utilisant la synthèse des protéines sans cellules15, mais la préparation des vaccins glycoconjugate selon cette stratégie attend toujours d’être popularisée.
L’application de la stratégie in vivo pour la production de protéines porteuse mutées nécessite une machine translationnelle modifiée qui comprend un codon spécifique, un ARN reconnaissant le codon et une synthétase aminoacyl-tRNA (aaRS) qui catalyse spécifiquement le transfert de l’UAA sur l’ARN t (Figure 1)16. La suppression de codon d’arrêt d’ambre de pyrrolysine est l’une des méthodes les plus employées pour incorporer UAA, en particulier le propargyl-lysine (PrK)17. Ce dernier peut à son tour réagir avec des haptens de glucides fonctionnalisés à l’azido pour fournir des glycococonjugates entièrement définis et homogènes. Dans le présent manuscrit, nous décrivons comment synthétiser le propargyl-L-lysine, un UAA portant une poignée d’alkyne, comment l’incorporer dans une protéine cible lors de sa traduction dans une bactérie et enfin comment effectuer la conjugaison entre la protéine modifiée et un hapten portant une fonction d’azide à l’aide de la chimie du clic.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

L’expansion du code génétique est un outil puissant pour introduire des acides aminés contre nature (UUA) dans les protéines afin de modifier leurs caractéristiques, d’étudier ou de créer de nouvelles fonctions protéiques ou d’avoir accès à des conjugués protéiques. Arrêter la suppression du codon, en particulier la suppression du codon ambré, est apparue comme la méthode la plus populaire pour introduire génétiquement des AUA à des positions définies. Cette méthodologie est appliquée à la préparation d’une protéine porteuse contenant un UAA hébergeant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Cette poignée réactive peut ensuite être utilisée pour greffer spécifiquement et efficacement un hapten oligosaccharide synthétique pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène. Le protocole est limité à la synthèse des glycoconjugates dans un rapport 1:1 de protéine de hydrate de carbone/porteur mais favorable à de nombreuses paires de groupes fonctionnels biorthogonal. L’homogénéité vaccinale du glycococonjugate est un critère important pour assurer une caractérisation physico-chimique complète, satisfaisant ainsi des recommandations de plus en plus exigeantes des organismes de réglementation des médicaments, un critère qui n’est pas satisfait par les stratégies classiques de conjugaison. En outre, ce protocole permet d’affiner finement la structure du vaccin conjugué réel, donnant lieu à des outils pour traiter les relations structure-immunogénicité.

Dans le cadre de ce projet, un vaccin homogène contre la glycoconjugate a été préparé à l’aide de la stratégie de suppression du codon d’arrêt ambré pour introduire un UAA à un site défini (figure 1). L’adhésine de surface pneumoccocale A a été choisie comme protéine porteuse moiety. Cette protéine est fortement conservée et exprimée par toutes les souches de Streptococcus pneumoniae22. Il est hautement...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

L’expansion du code génétique est appliquée pour l’introduction d’un acide aminé contre nature portant un groupe fonctionnel biorthogonal sur une protéine porteuse à un site défini. La fonction biorthogonale est également utilisée pour le couplage sélectif d’un antigène carbohydrate pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène.

Glycoconjugate homogène produit par combined unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glyc

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

L’objectif global de cette procédure est de produire un vaccin glycoconjugate homogène en combinant l’incorporation non canonique d’acides aminés et la cliquez-chimie. L’expansion du code génétique est un outil puissant pour incorporer des acides aminés contre nature dans les protéines afin de modifier leurs caractéristiques, d’étudier ou de créer de nouvelles fonctions protéiques, ou d’avoir accès à des conjugués protéiques. Une méthode de suppression du codon est apparue comme la méthode la plus populaire pour incorporer des acides aminés contre nature à différentes positions.Cette méthodologie sera ici appliquée à la production d’un porteur de protéines contenant un acide aminé contre nature abritant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Cette poignée réactive peut ensuite être utilisée pour greffer spécifiquement et efficacement un hapten oligosaccharide synthétique pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène. La propargyl-lysine, PrK, est synthétisée en deux étapes à partir de boc-lysine commerciale.Dans un premier temps, le groupe aminé non protégé du Boc-lysine est converti en chloroformate propargyl. Dans un deuxième temps, le groupe alpha amino est dé-protégé. Pour synthétiser le N(alpha)Boc-propargyl-lysine, dissoudre d’abord 500 milligrammes de Boc-lysine dans le mélange de cinq millilitres d’une molaire aqueuse NaOH et cinq millilitres de THF dans un flacon et adapter le flacon avec un septum de silicium.Refroidir le flacon dans un bain de glace et attendre que la poudre soit dissoute. Ajouter ensuite le chloroformate propargyl sur une période de deux à trois minutes en remuant. Réchauffer le mélange de réaction à température ambiante et poursuivre l’agitation pendant 10 heures.Refroidir les solutions d’éther diététhyle, d’acide chlorhydrique aqueux et d’acétate éthylique. Refroidir le mélange de réaction brute dans un bain de glace. Verser le mélange dans un entonnoir séparant.Extraire un mélange avec cinquante millilitres d’éther de diététhyle. L’extraction peut entraîner une accumulation de pression, assurez-vous de libérer toute accumulation de pression fréquemment. Recueillir la phase aqueuse et jeter la couche organique.Ajouter prudemment cinquante millilitres d’un acide chlorhydrique molaire à la phase aqueuse de l’entonnoir séparant. Puis, extraire la couche aqueuse deux fois à l’aide de trente millilitres d’acétate d’éthyle. Recueillir la phase organique, vérifier la présence de votre composé par TLC.À ce stade, il devrait être dans la phase organique. Sécher les couches organiques combinées sur le sulfate de magnésium. Filtrer la phase solide.Et concentrez le filtrate sous pression réduite sur un évaporateur rotatif. Dissoudre l’échantillon du pétrole brut N(alpha)Boc-propargyl-lysine dans le chloroforme stérilisé et contrôler son identité par NMR. Pour synthétiser le propargyl-L-lysine, introduisez le N(alpha)Boc-propargyl-lysine dans un flacon de bouton rond équipé d’un septum.Ajouter quatre millilitres de dichloromethane anhydre dans le flacon sous argon. Ajouter quatre millilitres d’acide trifluoroacétique en remuant. Remplacez le septum de silicium pour un couvercle en verre pour éviter que tfa n’endommage le septum de silicium.Remuer le mélange de réaction pendant une heure à température ambiante. Vérifiez la déprotection du Boc-PrK par TLC. Concentrez le mélange de réaction sous pression réduite.Ajouter l’éther de déthyle aux résidus bruts. Filtrer le propargyl-L-lysine sous la forme d’un solide blanc sur un verre fritté. Dissoudre un aliquot du propargyl-L-lysine dans l’oxyde de deutérium, puis effectuer une analyse NMR pour contrôler son identité et sa pureté.Propargyl-L-lysine est ensuite dissous dans de l’eau distillée à la concentration finale de cent millimollaires et stockés à moins 20 degrés en un millilitre aliquots. Pour co-transformer les plasmides en souche d’expression, décongelez une centaine de microlitres aliquot d’E.Coli BL21 chimiquement compétent sur la glace pendant cinq minutes. Ajouter un microlitre de chaque plasmide ou cinquante à cent nanogrammes de chacun dans les cellules et les incuber pendant 30 minutes sur la glace.Incuber les cellules compétentes à 42 degrés, pendant 45 secondes. Ensuite, remets-les sur la glace pendant deux minutes. Ajouter neuf cents microlitres de LB moyen et incuber sous secouant pendant une heure à 37 degrés pour permettre l’expression des antibiotiques.Ensuite, plaquez les bactéries transformées sur l’agar LB avec des antibiotiques. Laissez les bactéries se développer pendant la nuit à 37 degrés. Pour exprimer les protéines modifiées avec prk, inoculer une seule colonie co-transformée en cinq millilitres de milieu LB avec des antibiotiques.Incuber toute la nuit à 37 degrés avec des secousses. Le lendemain, diluer avec les cinq millilitres de la culture primaire en cinq cents millilitres de milieu d’auto-induction contenant des antibiotiques, 0,02% de L-arabinose, et un millimolaire de PrK et d’incuber à 37 degrés pendant 24 heures sous secousses. Inclure un contrôle négatif en effectuant la culture sans PrK et le contrôle positif en effectuant la culture d’un clone contenant le gène de protéines de type sauvage.Récolter les cellules de la culture nocturne par centrifugation à 5000 x g pendant 10 minutes. Jeter le surnatant et congeler la pastille à moins 20 degrés. Pour la purification de la protéine par chromatographie d’affinité d’écoulement de gravité-banc, résuspendez les granules de cellules dans vingt millilitres de tampon de lyse.Ajouter le DNase I et le lysozyme, et permettre la lyse en incubant la suspension à 37 degrés pendant 30 minutes. Sonicate les cellules dans la glace pendant cinq minutes, puis enlever les débris cellulaires par centrifugation à 20.000 x g pendant 30 minutes. Filtrate le lysate avec filtre de 0,45 micromètre Ajouter de la résine Ni-NTA à la suspension.Mélangé doucement à quatre degrés pendant une heure. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène et recueillir la fraction non lié. Laver la résine avec dix millilitres, puis cinq millilitres de tampon de lavage.Recueillir les fractions de lavage. Elutez la protéine saguée avec un millimètre de tampon d’élitution et répétez cette étape quatre fois et recueillez toutes les fractions supplémentaires. Combinez les fractions contenant des protéines pures étiquetées histidine et dialyz-les dans un litre de tampon de protéase TEV pendant la nuit en utilisant la membrane de dialyse.Recueillir l’échantillon de protéines dans un tube de 50 millilitres et ajouter le tampon TEV pour obtenir une concentration finale de deux milligrammes par millilitre dans un volume final d’un millilitre. Ajouter une centaine de microlitres de protéase TEV. Ajouter 50 microlitres de 0,1 molaire DTT.Complet avec tampon TEV jusqu’à cinq millilitres. Incuber toute la nuit à quatre degrés, avec des secousses lentes. Pour éliminer l’EDTA, dialysez la protéine à quatre degrés pendant la nuit en utilisant la membrane de dialyse et le tampon de phosphate avec l’imidazole millimolaire de cinq millimolar.Pour éliminer la protéase TEV et les protéines non digérées, incubez le mélange avec des perles Ni-NTA et mélangez doucement pendant une heure à quatre degrés. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène. Recueilli la fraction non lié.La protéase TEV et les protéines non digérées restent liées aux perles et la protéine digérée est éludée. Lavez la colonne avec cinq millilitres de tampon de lavage et de recueillir les fractions de lavage ainsi. Dialyz la protéine digérée contre un litre de tampon de clic à quatre degrés pendant la nuit avec la membrane de dialyse pour enlever l’imidazole aussi bien que pour échanger le tampon.Et mesurer la concentration de la protéine à 280 nanomètres. Pour conjuguer le mPsaA avec 6-hexachloro-fluorescéine-azide, ou un antigène de hydrate de carbone antidote-fonctionnalisé, mettez la protéine mutée de PrK à une concentration de 57.8 micromolar dans un micro tube de deux millilitres. Ajouter 10 microlitres de composé d’azide de cinq millimolaires, puis ajouter un pré-mélange de solution de sulfate de cuivre et THPTA.Ajouter l’hydrochlorure d’aminoguanidine. Ajouter la solution aqueuse extemporanéée de l’ascorbate de sodium. Fermer le tube, mélanger en inversant plusieurs fois et incuber à température ambiante pendant deux heures.Arrêtez la réaction en ajoutant EDTA. Vérifiez la conjugaison sur la page SDS. Après la migration, visualiser le gel sur la lumière UV à 312 nanomètres pour le conjugué avec la fluorescéine.Ou tacher le gel avec Coomassie Blue pour visualiser le conjugué avec l’antigène de glucides. Comme l’ajout de l’hapten devrait induire un changement de poids moléculaire. Purifier le glycoconjugate en l’appliquant sur une colonne gel-filtration équilibrée avec PBS.Recueillir les fractions contenant les glycoconjugates. Pour un stockage prolongé, dialyser le glycoconjugate contre l’eau distillée, puis congeler-sécher et stocker le glycoconjugate à moins 80 degrés. Le PrK a été introduit à la position 32 en remplacement d’une lysine près du N-terminus de la PsaA.L’efficacité de la production de mPsaA a été vérifiée par la page SDS et l’analyse de tache occidentale utilisant l’anticorps d’étiquette d’anti-Histidine. La présence d’une protéine pleine longueur indique fortement l’incorporation réussie de la PrK. L’intensité est toutefois inférieure à celle observée pour les mPsaA de type sauvage.Le mPsaA (K32PrK) a été purifié sur des perles Ni-NTA. Avec un rendement typique de huit milligrammes et l’incorporation du résidu de PrK a finalement été confirmé par spectrométrie de masse. L’étiquette d’Histidine a été enlevée sur le clivage protéolytique utilisant la protéase de TEV.Ayant le mPsaA (K32PrK)la réactivité de l’alkyne a été évaluée utilisant une fluorescéine azido-fonctionnalisée et plus loin employée pour conjuguer un antigène synthétique d’oligosaccharide. Des expériences ont été faites en comparaison avec des mPsaA de type sauvage comme un contrôle. Enfin, le glycoconjugate a été purifié par filtration de gel et son identité confirmée par spectrométrie de masse.Dans le cadre de ce projet, des vaccins homogènes contre la glycoconjugate ont été préparés à l’aide de la technologie de suppression du codon d’arrêt de l’ambre pour incorporer un acide aminé contre nature sous des sites définis. L’homogénéité du vaccin glycoconjugate est un critère important pour assurer une caractérisation physico-chimique complète. Et donc, satisfaire de plus en plus exigeantes recommandations de l’agence du médicament.Ce critère n’est pas satisfait en utilisant la méthode classique de pure conjugaison. De plus, ce protocole permet d’affiner finement la structure du vaccin glycoconjugate. Donnant lieu à un outil sans précédent pour étudier la relation entre l’homogénéité et la structure d’un glycoconjugate.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Peau tatouage comme une nouvelle approche pour la livraison des vaccins ADN

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Recherche

Bio-ingénierie

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Préparation des membranes sensibles à la lumière par une greffe de surface combiné et processus Modification ultérieure

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabrication d&#39;un fonctionnalisés magnétique bactérienne nanocellulose avec oxyde de fer Nanoparticules

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection de tissu rénal primaire Segments et intégration avec la technologie de nouvelle construction exempte d’échafaudage

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Peptides antimicrobiens produites par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...