Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. מודה בהכרת תודה על התמיכה הכספית של La Région Pays de la Loire (תוכנית פארי Scientifique "BioSynProt"), במיוחד מלגת דוקטורט ל-T.V. אנו גם מכירים ד"ר רוברט B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, טולוז, צרפת) עבור ייעוץ טכני יקר שלו.

1. סינתזה של UAA: פרופארג'י-לייסין (PrK)
<ol><li>סינתזה של Nα-Boc-propargyl-ליסין18<ol>
<li>להמיס 500 מ"ג של Boc-L-Lys-OH (2.03 mmol) בתערובת של מים 1 M NaOH (5 מ"ל) ו THF (5 מ"ל) במבחנות ולה להתאים את הבקבוקון עם מחיצה סיליקון.</li>
		<li>מצננים את הבקבוקון באמבט קרח ולאחר מכן מוסיפים 158 μL של פרופארג'י כלורופורם (1...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Mutagenesis באתר היא אסטרטגיה פשוטה לשלב חומצות אמינו ספציפיות בעמדה מוגדרת של חלבון אשר נשאר בקושי בשימוש במטרה להכין חיסונים גליקונג'וגייט7,8,14. מוטגנזה קלאסית המבוססת על 20 גישת חומצות אמינו טבעיות יעילה מאוד מאחר שלא נדרש שינוי במכונות התרג...

חיסוני גליקוקו-קו-גייט הם מרכיבים חיוניים של ארסנל החיסון הזמין לטיפול מונע במחלות זיהומיות. הם בטוחים, נסבלים היטב ויעילים בקבוצת גיל רחבה כולל תינוקות צעירים. הם מספקים את ההגנה האופטימלית מפני זיהומים הנגרמת על ידי חיידקים ממוססים כמו מנינגוקוקוס, פנאומוקקוס או שפעת המופילוס סוג b1. חיסוני גליקוקוקוג'וג'גייט עשויים מפוליסכרידים חיידקיים מטוהרים הקוביות של חיידקים או אוליגוסכרידים סינתטיים המחקים את הפוליסכרידיםהמבוטאים עלפני השטח 2 , המקושרים באופן קובלנטי לחלבון מוביל. הנוכחות של חלבון נשא חיוני כדי לקדם תגובות חיסוניות הומוריסטיות מגן מכוון נגד הקובע האנטיגני שהביע אנטיגנים פחמימות3. מלבד בחירה קפדנית וייצור של אנטיגן פחמימות, התכונות ידועות להפעיל השפעה על היעילות של חיסון גליקוקונג'וגייט הם: טבעו של חלבון המוביל, הכימיה ההתייחדות (כולל אופי ואורך המקשר אם נעשה שימוש), או יחס saccharide / חלבון3. מן הסתם, התנוחות שבהן ה-saccharide מודבק לחלבון, כמו גם מספר נקודות הקישוריות רלוונטיות לחיסונים. עד כה, שני פרמטרים אלה כמעט ולא נחקרו כי הכנת גליקוקוגייטים נשאר בעיקר אמפירי. הסינתזה שלהם מסתמכת בדרך כלל על השימוש בפונקציות חומצה קרבוקסילית או קארבוקסילית של, בהתאמה, ליזאין או אספרטית / גלוטמית חומצה בצד שרשרת שאריות הנוכחי על רצף חלבון המוביל. זה מוביל לא לתערובת הטרוגנית של גליקוקו-ג'וגייט.
משחק על תגובתיות, נגישות או התפלגות של שאריות חומצת אמינו בחלבון יוצר גליקוקוגטים מוגדרים יותר כי הם אמינים יותר לתעד את ההשפעה של קישוריות saccharide / חלבון4. צעד קדימה לקראת מטרה זו ניתן להשיג על ידי יישום טכנולוגיית צימוד גליקן חלבון, תהליך רקומביננטי המאפשר ייצור של חיסונים גליקוגט מבוקר במפעלי תאים5,6. עם זאת, גליקוסילציה מתרחשת באופן בלעדי במשקעים אספראג'ין בתוך D / EXNYS / T sequons (לפיה X הוא כל מתוך 20 חומצות אמינו טבעיות), לא קיים באופן טבעי על חלבוני המוביל.
אתר מוטגנזה סלקטיבית ובמיוחד התאגדות של ציסטאין כדי לנצל את תגובתיותם מאוד סלקטיבית מופיעהכאלטרנטיבה 7,8. ייצור חלבוני נשא המשלבים כטב"מים ברצף שלהם יכול להציע גמישות רבה עוד יותר להכנת חיסון גליקו-conjugate הומוגני. יותר מ 100 כטב"מים פותחו ושילבו עוד יותר חלבוניםשונים 9,10. רבים מהם מכילים פונקציות bioorthogonal משמש בדרך כלל לבצע שינוייםתרגום פוסט 11 או להשתיל בדיקותביופיזיות 12 או תרופות 13 אבל שהם ידיות אידיאליות להתייחדות נוספת עם אנטיגנים פחמימות. דוגמאות מוצלחות כבר טענו על ידי ביוטכנולוגיה14 באמצעות סינתזת חלבון ללאתאים 15 אבל הכנת חיסונים גליקוגייט על פי אסטרטגיה זו עדיין מחכה להיות פופולרי.
יישום של אסטרטגיית vivo לייצור של חלבון נשא מוטציה צריך מכונות תרגום שונה הכולל codon ספציפי, tRNA זיהוי קודון סינתזה אמינואציל-tRNA (aaRS) אשר במיוחד מקטע את העברת UAA על tRNA (איור 1)16. דיכוי הענבר pyrrolysine להפסיק קודון היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשלב UAA, במיוחד propargyl-ליסין (PrK)17. האחרון יכול בתורו להגיב עם הפטנים פחמימות פונקציונליאזידו לספק מוגדר באופן מלא, גליקוגטים הומוגניים. בכתב היד הנוכחי אנו מתארים כיצד לסנתז את propargyl-L-ליסין, UAA נושא ידית alkyne, איך לשלב אותו לתוך חלבון היעד במהלך התרגום שלה בחיידק ולבסוף איך לבצע התייחדות בין החלבון שונה hapten נושא פונקציה אזיד באמצעות כימיה לחץ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה כדי להכניס חומצות אמינו לא טבעיות (כטב"מים) לתוך חלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות או יש גישה ליחידות חלבון. להפסיק דיכוי קודון, במיוחד דיכוי codon ענבר, התגלה כשיטה הפופולרית ביותר להציג גנטית UAAs בעמדות מוגדרות. מתודולוגיה זו מיושמת בזאת על הכנת חלבון נשא המכיל UAA מחסה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. ידית תגובתית זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי להשתיל באופן ספציפי ויעיל אוליגוסכריד hapten סינתטי כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'גייט הומוגני. הפרוטוקול מוגבל לסינתזה של גליקוקוגייטים ביחס חלבון 1:1 פחמימות/נשא, אך ניתן לחוות זוגות רבים של קבוצות תפקודיות ביו-לוגוניות. הומוגניות חיסון Glycocococonjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא, ובכך, סיפוק יותר ויותר תובעני יותר המלצות הסוכנות הרגולטורית סמים, קריטריון אשר לא נענה על ידי אסטרטגיות התייחדות קלאסיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את המבנה של החיסון ההתייחדות בפועל, מה שמוליך כלים לטיפול ביחסים בין מבנה לחיסונים.

בפרויקט זה, הוכנה חיסון הומוגני גליקוקונג'וג'גייט באמצעות אסטרטגיית דיכוי הענבר להפסיק codon כדי להציג UAA באתר מוגדר (איור 1). דבק פני השטח Pneumoccocal A נבחר כחלבון המוביל moiety. חלבון זה הוא מאוד שמר ומובע על ידי כל הזנים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס22.</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר חיסון גליקונקונג'גייט הומוגני על ידי שילוב של שילוב חומצות אמינו לא קנוניות וכימיה של קליק. הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בחלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות, או לקבל גישה מצומד חלבון. שיטת דיכוי קודון התפתחה כשיטה הפופולרית ביותר לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בעמדות שונות.מתודולוגיה זו תחול כאן על ייצור נשא חלבון המכיל חומצת אמינו לא טבעית המטפחת קבוצה תפקודית ביו-רוטוגונלית. ידית תגובתי זה יכול לשמש באופן ספציפי וביעילות השתלת אויגוסכריד הפטן סינתטי כדי לספק חיסון glycoconjugate הומוגני. הפרוגרג'יל-לי לסין, PrK, מסונתז בשני צעדים מבוק-לייסין מסחרי.בשלב הראשון, קבוצת האמינו הלא מוגנת של הבוק-ליזין מומרת לפרופרג'יל כלורופורמט. בשלב השני, קבוצת האמינו אלפא היא דה מוגן. כדי לסנתז את N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין, הראשון להמיס 500 מיליגרם של Boc-ליסין בתערובת של חמישה מיליליטר של אחד מימית molar NaOH וחמישה מיליליטר של THF בבקבוק ומתאימים את הבקבוק עם מחיצת סיליקון.מקררים את הבקבוק באמבט קרח ומחכים להמסת האבקה. לאחר מכן מוסיפים את הפרוגרג'יל כלורופורמט טיפה חכם על פני תקופה של שתיים עד שלוש דקות תחת ערבוב. מחממים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר וממשיכים את ה ערבוב במשך 10 שעות.לקרר פתרונות של אתר diethyl, חומצה הידרוכלורית אחת קווירית, ואתיל אצטט. מצננים את תערובת התגובה הגולמית באמבט קרח. יוצקים את התערובת במשפך מפריד.מוציאים תערובת עם חמישים מיליליטר של אתר דיתיל. החילוץ עלול לגרום הצטברות של לחץ, הקפד לשחרר כל הצטברות לחץ לעתים קרובות. אוספים את השלב הממימי ומשליכים את השכבה האורגנית.מוסיפים בזהירות, חמישים מיליליטר של חומצה הידרוכלורית אחת לחומצה הממית במשפך המפריד. לאחר מכן, לחלץ את השכבה המים פעמיים באמצעות שלושים מיליליטר של אתיל אצטט. לאסוף את השלב האורגני, לאמת את נוכחותו של המתחם שלך על ידי TLC.בשלב זה, זה צריך להיות בשלב האורגני. יבש את השכבות האורגניות המשולבות על מגנזיום גופרתי. סנן את השלב המוצק.ולרכז את הסינון תחת לחץ מופחת על אידוי סיבובי. להמיס מדגם של N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין גולמי בכלורופורם deuterated ולשלוט בזהותו על ידי NMR. לסנתז את propargyl-L-ליזין, להציג את N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין בבקבוק כפתור עגול מצויד מחיצה.הוסף ארבעה מיליליטר של דיכלורומטן נטול מים לתוך הבקבוק מתחת לארגון. הוסף טיפה חכם, ארבעה מיליליטר של חומצה trifluoroacetic תחת ערבוב. החלף את מחיצת הסיליקון למכסה זכוכית כדי למנוע מ- TFA לפגוע במ מחיצת הסיליקון.מערבבים את תערובת התגובה במשך שעה בטמפרטורת החדר. ודא את ביטול ההגנה של ה- Boc-PrK על-ידי TLC. לרכז את תערובת התגובה תחת לחץ מופחת.תוסיף אתר דיתיל לשאריות הגולמיות. סנן את הפרוגרג'יל-ל-ליסטין בצורה של מוצק לבן על זכוכית קפואה. להמיס aliquot של propargyl-L-ליזין תחמוצת דיטריום, ולאחר מכן לבצע ניתוח NMR כדי לשלוט בזהותו וטוהר.Propargyl-L-ליצין מומס אז במים מזוקקים בריכוז הסופי של מאה מילימולרים ומאוחסן במינוס 20 מעלות ב aliquots מיליליטר אחד. כדי להפוך פלסמידים במשותף לזן הביטוי, להפשיר מאה microliters aliquot של E.Coli BL21 מוסמך כימית על קרח במהלך חמש דקות. מוסיפים מיקרוליטר אחד של כל פלסמיד או חמישים עד מאה ננוגרם של כל אחד לתוך התאים ו דגירה אותם במשך 30 דקות על קרח.דגירה התאים המוסמכים ב 42 מעלות, במהלך 45 שניות. ואז, לשים אותם בחזרה על קרח במשך שתי דקות. מוסיפים 900 מיקרוליטרים של LB בינוני דגירה תחת רועד במשך שעה אחת ב 37 מעלות כדי לאפשר ביטוי אנטיביוטיקה.ואז צלחת חיידקים שהשתנו על אגר LB עם אנטיביוטיקה. אפשר לחיידקים לגדול בן לילה ב-37 מעלות. כדי לבטא חלבונים ששונו עם PrK, יש לחסן מושבה אחת שהשתנתה במשותף בחמישה מיליליטר של מדיום LB עם אנטיביוטיקה.דגירה לילה ב 37 מעלות עם רעידות. למחרת, לדלל עם חמשת המיליליטרים של התרבות העיקרית בחמש מאות מיליליטר של מדיום אינדוקציה אוטומטי המכיל אנטיביוטיקה, 0.02% של L-arabinose, ומילימולר אחד של PrK ודגירה ב 37 מעלות במשך 24 שעות תחת רעידות. כלול שליטה שלילית על-ידי ביצוע התרבות ללא PrK והשליטה החיובית על-ידי ביצוע התרבות של שיבוט המכיל את גן החלבון מסוג הבר.קציר תאים מתרבות הלילה על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 x גרם במהלך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והקפיאו את גלולת המינוס 20 מעלות. לטיהור החלבון על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לספסל הזרימה של כוח הכבידה, יש למגר את כדורי התא לעשרים מיליליטר של מאגר תיזה.מוסיפים DNase I ו lysozyme, ולאפשר תזה על ידי דגירה ההשעיה ב 37 מעלות במהלך 30 דקות. Sonicate התאים בקרח במהלך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 x g במהלך 30 דקות. סינון lysate עם מסנן מיקרומטר 0.45 הוסף שרף Ni-NTA להשעיה.מערבבים בעדינות בארבע מעלות במשך שעה. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן ולאסוף את השבר מאוגד. לשטוף את שהף עם עשרה מיליליטר ולאחר מכן חמישה מיליליטר של חיץ כביסה.לאסוף את שברי לשטוף. אלוט חלבון מתויג שלו עם מילימטר אחד של חיץ אלוטיון ולחזור על שלב זה ארבע פעמים ולאסוף את כל השברים הנוספים. ערבבו את השברים המכילים חלבונים מתויגים בהיסטידין טהור והתוגנו אותו לליטר אחד של חיץ פרוטאז TEV בן לילה באמצעות קרום דיאליזה.לאסוף את דגימת החלבון לתוך צינור 50 מיליליטר ולהוסיף חיץ TEV כדי לקבל ריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר בנפח סופי של מיליליטר אחד. הוסף מאה מיקרוליטרים של פרוטאז TEV. הוסף 50 מיקרוליטרים של DTT טוחן 0.1.להשלים עם חיץ TEV עד חמישה מיליליטר. דגירה לילה בארבע מעלות, עם רעידות איטיות. כדי להסיר EDTA, דיאליזה החלבון בארבע מעלות לילה באמצעות קרום דיאליזה חיץ פוספט עם חמישה מילימולרים imidazole.כדי לחסל פרוטאז TEV וחלבונים לא מעוכלים, הדגירה את התערובת עם חטיף Ni-NTA ומערבבים בעדינות במשך שעה אחת בארבע מעלות. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן. אסף את השבר הלא מאוגד.פרוטאז TEV וחלבונים מעוכלים נשארים קשורים לחרוזים והחלבון המתעכל הוא אלוט. לשטוף את העמוד עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה ולאסוף את שברי לשטוף גם כן. דיאליזה החלבון מתעכל נגד ליטר אחד של חיץ לחץ בארבע מעלות לילה עם קרום דיאליזה כדי להסיר imidazole, כמו גם להחליף את החיץ.ולמדוד את ריכוז החלבון ב 280 ננומטר. כדי להצטייד mPsaA עם 6-hexachloro-פלואורסצין-אזיד, או אנטיגן פחמימות פונקציונלי נוגדן, לשים את החלבון מוטציה PrK בריכוז של 57.8 micromolar לתוך צינור מיקרו שני מיליליטר. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של תרכובת אזיד מילימולרית, ולאחר מכן מוסיפים תערובת מוקדמת של תותבת נחושת גופרתית ו- THPTA.מוסיפים אמינוגואנידין הידרוכלוריד. הוסף פתרון מים שהוכן באופן מאולתר של אסקורבאט נתרן. סוגרים את הצינור, מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.הפסק את התגובה על-ידי הוספת EDTA. בדוק את ההתרברבות בדף SDS. לאחר הנדידה, לדמיין את הג'ל על אור UV ב 312 ננומטר עבור משותף עם פלואורסאצין.או להכתים את הג'ל עם כחול קומאסי כדי לדמיין את הצ'ינס עם אנטיגן פחמימות. כמו תוספת של hapten צריך לגרום לשינוי של משקל מולקולרי. לטהר את glycoconjugate על ידי החלת אותו על עמודת סינון ג'ל שיווי משקל עם PBS.לאסוף את השברים המכילים את glycoconjugates. לאחסון ממושך, יש להצטייד בגליקונקונג'גייט כנגד המים המזוקקים, ואז להקפיא-יבש ולאחסן את הגליקונקונג'גייט במינוס 80 מעלות. PrK כבר הציג בעמדה 32 בהחלפת ליסינוס ליד N-terminus של PsaA.היעילות של ייצור mPsaA נבדקה על ידי דף SDS וניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן תג אנטי היסטידין. נוכחותו של חלבון באורך מלא מצביעה בחוזקה על שילוב מוצלח של PrK. האינטנסיביות היא, עם זאת, נמוכה יותר מזה שנצפה עבור mPsaA מסוג פראי.MPsaA(K32PrK)כבר מטוהרים על חנוזי Ni-NTA. עם תשואה אופיינית של שמונה מיליגרם ואת שילוב של שאריות PrK אושרה לבסוף על ידי ספקטרומטריית מסה. תג היסטידין הוסר על מחשוף פרוטאוליטי באמצעות פרוטאז TEV.לאחר mPsaA(K32PrK)תגובתיות של אלקין הוערך באמצעות פלואורסין פונקציונלי אזידו ו משמש עוד יותר כדי להצטייד אנטיגן אוליגוסכריד סינתטי. ניסויים נעשו בהשוואה ל- MPsaA מסוג פראי כפקד. לבסוף, הגליקונקונג'גייט טוהר על ידי סינון ג'ל וזהותו אושרה על ידי ספקטרומטריית מסה.בפרויקט זה, חיסונים הומוגניים glycoconjugate הוכנו באמצעות טכנולוגיית דיכוי קודון עצירת ענבר לשלב חומצת אמינו לא טבעית תחת אתרים מוגדרים. הומוגניות חיסון Glycoconjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא. ובכך, מספק יותר ויותר המלצות סוכנות סמים תובעניות.קריטריון זה אינו מסופק על ידי שימוש בשיטת ההתייחדות הטהורה הקלאסית. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את מבנה החיסון glycoconjugate. מעורר כלי חסר תקדים ללמוד את הקשר בין ההומוגניות לבין המבנה של גליקונקוג'גייט.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

הכנה של ממברנות אור תגובה על ידי הארכת משטח משולבת ותהליך Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...