Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
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E.C. riconosce con gratitudine il sostegno finanziario di La Région Pays de la Loire (Programma Pari Scientifique "BioSynProt"), in particolare una borsa di dottorato a T.V. Riconosciamo anche il Dott. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Tolosa, Francia) per i suoi preziosi consigli tecnici.

1. Sintesi della UAA: propargil-llysina (PrK)
<ol><li>Sintesi di Nα-Boc-propargil-llysina18<ol>
<li>Sciogliere 500 mg di Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in una miscela acquosa 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.</li>
		<li>Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e quindi aggiungere 158 μL di propargil cloroformato (1,62 mmol) dropwise (per un periodo di 2-3 minuti) utilizzando una microsiringa durante l'agitazione.</li>
	...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

La mutagenesi site-directed è una strategia semplice per incorporare aminoacidi specifici in una posizione definita di una proteina che rimane a malapena utilizzata con l'obiettivo di preparare vaccini glicoconi coniugati7,8,14. La mutagenesi classica basata sull'approccio dei 20 amminoacidi naturali è altamente efficiente poiché non è richiesta alcuna modifica della macchina di traslazione. Le mutazioni della cisteina sono ...

I vaccini glicoconi coniugati sono elementi essenziali dell'arsenale vaccinale disponibile per il trattamento profilattico delle malattie infettive. Sono sicuri, ben tollerati ed efficienti in un'ampia fascia d'età, compresi i bambini piccoli. Forniscono la difesa ottimale contro le infezioni causate da batteri capsulati come meningococco, pneumococco o Haemophilus influenzae di tipo b1. I vaccini glicoconi coniugati sono fatti di polisaccaridi batterici purificati che formano le capsule di batteri o oligosaccaridi sintetici che imitano questi polisaccaridi espressi insuperficie 2, che sono covalentemente collegati a una proteina portante. La presenza di una proteina portante è essenziale per promuovere risposte immunitarie umoriche protettive dirette contro il determinante antigenico espresso dagli antigeni dei carboidrati3. Oltre a un'attenta selezione e produzione dell'antigene dei carboidrati, le caratteristiche note per esercitare un'influenza sull'efficacia di un vaccino glicoconi coniugato sono: la natura della proteina portante, la chimica coniugazione (compresa la natura e la lunghezza del linker se usato), o il rapporto saccaride / proteina3. Ovviamente, le posizioni in cui il saccaride è coniugato alla proteina e il numero di punti di connettività sono rilevanti per l'immunogenicità. Ad oggi, questi due parametri sono stati appena studiati perché la preparazione dei glicoconi coniugati rimane in gran parte empirica. La loro sintesi di solito si basa sull'uso di funzioni di ammina o acido carbossilico rispettivamente di lysine o residui della catena laterale dell'acido aspartico / glutammico presenti sulla sequenza proteica portante. Questo porta non a un singolo ma a una miscela eterogenea di glicoconi coniugati.
Giocare sulla reattività, l'accessibilità o la distribuzione dei residui di amminoacidi nella proteina dà origine a glicoconi coniugati più definiti che sono più affidabili per documentare l'effetto della connettività saccharide /proteina 4. Un passo avanti verso questo obiettivo può essere raggiunto applicando la tecnologia di accoppiamento del glico proteico, un processo ricombinante che consente la produzione di vaccini glicoconi coniugati controllati nelle fabbriche dicellule 5,6. Tuttavia, la glicosilazione avviene esclusivamente con un residuo di asparagina all'interno dei sequoni D/EXNYS/T (per cui X è uno dei 20 amminoacidi naturali), non naturalmente presente sulle proteine portanti.
La mutagenesi selettiva del sito e in particolare l'incorporazione delle cisteine per sfruttarne la reattività altamente e selettiva appare comealternativa 7,8. La produzione di proteine portanti che incorporano UAA nella loro sequenza può offrire ancora più flessibilità per la preparazione omogenea del vaccino glicoconi coniugato. Più di 100 UAA sono stati sviluppati e ulteriormente incorporati in varie proteine9,10. Molti di essi contengono funzioni bioorthogonali solitamente utilizzate per effettuare modifiche post trasizionali11 o per innestare sonde biofisiche12 o farmaci13, ma che sono maniglie ideali per un'ulteriore coniugazione con antigeni di carboidrati. Esempi di successo sono stati rivendicati da Biotech14 utilizzando la sintesi proteica priva di cellule15, ma la preparazione di vaccini glicoconi coniugati secondo questa strategia aspetta ancora di diventare popolare.
L'applicazione della strategia in vivo per la produzione di proteine portanti mutate necessita di un macchinario traslazionale modificato che includa un codone specifico, un tRNA che riconosca il codone e un amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) che catalizza specificamente il trasferimento dell'UAA sul tRNA (Figura 1)16. La soppressione del codone di arresto dell'ambra pirrolisina è uno dei metodi più utilizzati per incorporare la UAA, in particolare la propargil-llysina (PrK)17. Quest'ultimo può a sua volta reagire con haptens di carboidrati funzionalizzati all'azido per fornire glicoconi coniugati completamente definiti e omogenei. Nel presente manoscritto descriviamo come sintetizzare la propargyl-L-lisina, una UAA che porta una maniglia di alchine, come incorporarla in una proteina bersaglio durante la sua traduzione in un batterio e infine come eseguire la coniugazione tra la proteina modificata e un hapten che porta una funzione di azide usando la chimica dei clic.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

L'espansione del codice genetico è un potente strumento per introdurre amminoacidi innaturali (UAA) nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Fermare la soppressione del codone, in particolare la soppressione del codone ambrato, è emerso come il metodo più popolare per introdurre geneticamente gli UAA in posizioni definite. Questa metodologia è applicata alla preparazione di una proteina portante contenente una UAA che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. Il protocollo è limitato alla sintesi dei glicoconi coniugati in un rapporto 1:1 di carboidrati hapten/proteina portante ma suscettibile a numerose coppie di gruppi funzionali biorthogonali. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa, soddisfacendo così sempre più esigenti le raccomandazioni delle agenzie di regolamentazione dei farmaci, un criterio che non è soddisfatto dalle classiche strategie di coniugazione. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura dell'attuale vaccino coniugato, dando origine a strumenti per affrontare le relazioni struttura-immunogenicità.

In questo progetto è stato preparato un vaccino omogeneo glicoconi coniugato utilizzando la strategia di soppressione del codone amber stop per introdurre un UAA in un sito definito (Figura 1). L'adessina superficiale pneumoccocale A è stata selezionata come proteina portante. Questa proteina è altamente conservata ed espressa da tutti i ceppi di Streptococcus pneumoniae22. È altamente immunogenico e precedentemente utiliz...

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Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

L'espansione del codice genetico viene applicata per l'introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l'accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un vaccino glicoconi coniugato omogeneo combinando l'incorporazione di amminoacidi non canonici e la click-chemistry. L'espansione del codice genetico è un potente strumento per incorporare amminoacidi innaturali nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Un metodo di soppressione del codone è emerso come il metodo più popolare per incorporare amminoacidi innaturali in diverse posizioni.Questa metodologia sarà qui applicata alla produzione di un portatore proteico contenente un amminoacido innaturale che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. La propargil-llysina, PrK, è sintetizzata in due fasi dalla Boc-llysina commerciale.Nel primo passo, l'amminogruppo non protetto della Boc-lisina viene convertito in propargyl cloroformato. In un secondo passaggio, l'amminogruppo alfa è de-protetto. Per sintetizzare la N(alfa)Boc-propargil-lisina, sciogliere prima 500 milligrammi di Boc-lisina nella miscela di cinque millilitri di acquoso naoh molare e cinque millilitri di THF in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e attendere che la polvere venga sciolta. Quindi aggiungere il propargyl cloroformato drop-wise per un periodo di due o tre minuti sotto agitazione. Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare l'agitazione per 10 ore.Raffreddare le soluzioni di etere dietile, acquoso acido cloridrico molare e acetato di etile. Raffreddare la miscela di reazione grezza in un bagno di ghiaccio. Versare il composto in un imbuto di separazione.Estrarre una miscela con cinquanta millilitri di etere dietile. L'estrazione può comportare un accumulo di pressione, assicurarsi di rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione. Raccogliere la fase acquosa e scartare lo strato organico.Aggiungere con cautela, cinquanta millilitri di un acido cloridrico molare alla fase acquosa nell'imbuto di separazione. Quindi, estrarre lo strato acquoso due volte usando trenta millilitri di acetato di etile. Raccogli la fase organica, verifica la presenza del tuo composto da TLC.In questa fase, dovrebbe essere in fase organica. Asciugare gli strati organici combinati sul solfato di magnesio. Filtrare la fase solida.E concentrare il filtrato sotto pressione ridotta su un evaporatore rotante. Sciogliere il campione del petrolio grezzo N(alfa)Boc-propargil-lisina in cloroformio deuterato e controllarne l'identità mediante NMR. Per sintetizzare la propargil-L-lisina, introdurre la N(alfa)Boc-propargil-lisina in un pallone a bottone rotondo dotato di setto.Aggiungere quattro millilitri di diclorometano anidro nel pallone sotto argon. Aggiungere, per quanto riguarda la goccia, quattro millilitri di acido trifluoroacetico sotto agitazione. Sostituire il setto di silicio per un coperchio di vetro per evitare che il TFA danneggi il setto di silicio.Mescolare la miscela di reazione per un'ora a temperatura ambiente. Verificare la deprotezione del Boc-PrK da parte di TLC. Concentrare la miscela di reazione sotto pressione ridotta.Aggiungere l'etere dietile al residuo grezzo. Filtrare la propargil-L-lisina sotto forma di un solido bianco su un bicchiere fritte. Sciogliere un'aliquota della propargil-L-lisina nell'ossido di deuterio, quindi effettuare analisi NMR per controllarne l'identità e la purezza.La propargil-L-lisina viene quindi sciolta in acqua distillata alla concentrazione finale di cento millimolare e conservata a meno 20 gradi in aliquote millilitre. Per co-trasformare i plasmidi nel ceppo di espressione, scongelare un'aliquota di cento microlitri di E.Coli BL21 chimicamente competente sul ghiaccio per cinque minuti. Aggiungere un microlitro di ogni plasmide o da cinquanta a cento nanogrammi di ciascuno nelle cellule e incubarli per 30 minuti sul ghiaccio.Incubare le cellule competenti a 42 gradi, per 45 secondi. Quindi, rimetteteli in ghiaccio per due minuti. Aggiungere novecento microlitri di mezzo LB e incubare sotto scuotimento per un'ora a 37 gradi per consentire l'espressione degli antibiotici.Quindi placcare i batteri trasformati sull'agar LB con antibiotici. Consentire ai batteri di crescere durante la notte a 37 gradi. Per esprimere proteine modificate con PrK, inoculare una singola colonia co-trasformata in cinque millilitri di mezzo LB con antibiotici.Incubare durante la notte a 37 gradi con tremori. Il giorno dopo, diluire con i cinque millilitri della coltura primaria in cinquecento millilitri di mezzo auto-induzione contenente antibiotici, 0,02% di L-arabinosi e un millimolare di PrK e incubare a 37 gradi per 24 ore sotto scuotimento. Includere un controllo negativo eseguendo la coltura senza PrK e il controllo positivo eseguendo la coltura di un clone contenente il gene proteico di tipo selvatico.Raccogliere le cellule dalla coltura notturna per centrifugazione a 5.000 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante e congelare il pellet a meno 20 gradi. Per la purificazione della proteina mediante cromatografia di affinità del banco di flusso gravitazionale, rimescolare il pellet cellulare in venti millilitri di tampone di lysis.Aggiungere la DNasi I e il lisozima e consentire la lisi incubando la sospensione a 37 gradi per 30 minuti. Sonicare le cellule nel ghiaccio per cinque minuti, quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 minuti. Filtrate il lysate con filtro da 0,45 micrometri Aggiungere la resina Ni-NTA alla sospensione.Mescolato delicatamente a quattro gradi per un'ora. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene e raccogliere la frazione non vincolata. Lavare la resina con dieci millilitri e poi cinque millilitri di tampone di lavaggio.Raccogliere le frazioni di lavaggio. Elute la proteina His-tagged con un millimetro di tampone di eluizione e ripetere questo passaggio quattro volte e raccogliere tutte le frazioni aggiuntive. Unire le frazioni contenenti proteine pure taggate all'istidina e dializzarle in un litro di tampone di proteasi TEV durante la notte utilizzando la membrana di dialisi.Raccogliere il campione proteico in un tubo da 50 millilitri e aggiungere il tampone TEV per ottenere una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro in un volume finale di un millilitro. Aggiungere cento microlitri di proteasi TEV. Aggiungere 50 microlitri di DTT molare 0,1.Completo di tampone TEV fino a cinque millilitri. Incubare durante la notte a quattro gradi, con scuotimenti lenti. Per rimuovere l'EDTA, dializzare la proteina a quattro gradi durante la notte utilizzando membrana dialisi e tampone fosfato con cinque imidazolo millimolare.Per eliminare la proteasi TEV e le proteine non digerite, incubare il mix con perline Ni-NTA e mescolare delicatamente per un'ora a quattro gradi. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Raccolta della frazione non vincolata.La proteasi TEV e le proteine non digerite rimangono legate alle perline e la proteina digerita viene eluita. Lavare la colonna con cinque millilitri di tampone di lavaggio e raccogliere anche le frazioni di lavaggio. Dializzare la proteina digerita contro un litro di tampone click a quattro gradi durante la notte con membrana di dialisi per rimuovere l'imidazolo e scambiare il tampone.E misurare la concentrazione della proteina a 280 nanometri. Per coniugare la mPsaA con 6-esacloro-fluoresceina-azide, o un antigene di carboidrati funzionalizzato all'antidoto, mettere la proteina mutata PrK ad una concentrazione di 57,8 micromolare in un microtubo da due millilitri. Aggiungere 10 microlitri di cinque composti millimolare di azide, quindi aggiungere un pre-mix di soluzione di solfato di rame e THPTA.Aggiungere il cloridrato di aminoguanidina. Aggiungere la soluzione acquosa estemporaneamente preparata di ascorbato di sodio. Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per due ore.Interrompere la reazione aggiungendo EDTA. Controlla la coniugazione nella pagina SDS. Dopo la migrazione, visualizzare il gel sulla luce UV a 312 nanometri per il coniugato con fluoresceina.Oppure macchiare il gel con Coomassie Blue per visualizzare il coniugato con l'antigene dei carboidrati. Come aggiunta degli hapten dovrebbe indurre un cambiamento di peso molecolare. Purificare il glicoconi coniugato applicandolo a una colonna di filtrazione gel equilibrata con PBS.Raccogliere le frazioni contenenti i glicoconi coniugati. Per una conservazione prolungata, dializzare il glicoconi coniugato contro l'acqua distillata, quindi congelare e conservare il glicoconi coniugato a meno 80 gradi. Il PrK è stato introdotto nella posizione 32 in sostituzione di una lsina vicino al capolinea N del PsaA.L'efficacia della produzione di mPsaA è stata controllata dalla pagina SDS e dall'analisi western blot utilizzando anticorpi anti-istidina tag. La presenza di una proteina a figura intera indica fortemente il successo dell'incorporazione del PrK. L'intensità è tuttavia inferiore a quella osservata per i parlamentari di tipo selvaggio.Il mPsaA(K32PrK) è stato purificato sulle perline Ni-NTA. Con una resa tipica di otto milligrammi e l'incorporazione del residuo prk è stata infine confermata dalla spettrometria di massa. L'etichetta istidina è stata rimossa dopo la scissione proteolitica usando la proteasi TEV.Avendo la mPsaA(K32PrK) la reattività dell'alchine è stata valutata utilizzando una fluoresceina funzionalizzata all'azido e ulteriormente utilizzata per coniugare un antigene oligosaccaride sintetico. Gli esperimenti sono stati fatti rispetto al mPsaA di tipo selvaggio come controllo. Infine, il glicoconi coniugato è stato purificato dalla filtrazione del gel e la sua identità confermata dalla spettrometria di massa.In questo progetto, sono stati preparati vaccini omogenei per il glicoconi coniugato utilizzando la tecnologia di soppressione del codone di arresto ambrato per incorporare un amminoacido innaturale in siti definiti. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa. E così, soddisfacendo sempre più esigenti le raccomandazioni dell'agenzia del farmaco.Questo criterio non è soddisfatto utilizzando il classico metodo di coniugazione pura. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura del vaccino glicoconi coniugato. Dando origine a uno strumento senza precedenti per studiare la relazione tra l'omogeneità e la struttura di un glicoconi coniugato.

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