Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
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E.Cは、ラ・レジオン・ペイ・ド・ラ・ロワール(パリ・サイエンティフィック・プログラム「BioSynProt」)、特にT.V.への博士課程のフェローシップからの財政的支援を感謝して認めています。我々はまた、ロバート・B・クアト(INRA UMR0792、CNRS UMR5504、LISBP、トゥールーズ、フランス)の貴重な技術的アドバイスを認めます。

1. UAAの合成:プロパジルリジン(PrK)
<ol><li>N αの合成 -ボック-プロピルジル-リジン18<ol>
<li>水性1M NaOH(5mL)とTHF(5mL)をフラスコに混合して500mgのボック-L-Lys-OH(2.03ミリモル)を溶かし、フラスコにシリコン中隔を合わせます。</li>
		<li>氷浴でフラスコを冷やし、攪拌しながらマイクロシリンジを使用して158 μLのプロパーギルクロロホルメート(1.62 mmol)ドロップワイズ(...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. 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B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

部位特異的変異誘発は、グリココンジュゲートワクチン7、8、14を調製することを目的としてほとんど使用されていないタンパク質の定義された位置に特定のアミノ酸を組み込むための簡単な戦略である。20の天然アミノ酸アプローチに基づく古典的な変異生成は翻訳機械の変更が要求されないので非常に効率的である。シ...

グリココンジュゲートワクチンは、感染症の予防治療に利用できるワクチンの必要不可欠な要素です。彼らは、若い幼児を含む広範な年齢層で安全で、十分に許容され、効率的です。それらは、髄膜炎球菌、肺炎球菌またはインフルエンザ菌b型のようなカプチオ細菌によって引き起こされる感染症に対する最適な防御を提供する。グリココンジュゲートワクチンは、これらの表面発現多糖を模倣する細菌または合成オリゴ糖のカプセルを形成する精製された細菌多糖類から作られており、これはキャリアタンパク質に共有結合しています。キャリアタンパク質の存在は、炭水化物抗原3によって発現される抗原決定基に対する保護的な体液性免疫応答を促進するために不可欠である。糖質抗原の慎重な選択および産生とは別に、糖コンジュゲートワクチンの有効性に影響を及ぼすのが知られている特徴は、キャリアタンパク質の性質、結合化学(使用する場合はリンカーの性質および長さを含む)、または糖類/タンパク質比3である。明らかに、糖類がタンパク質に結合する位置と接続ポイントの数は免疫原性に関連しています。現在までに、これらの2つのパラメータは、グリココンジュゲートの調製が主に経験的なままであるため、ほとんど研究されていません。これらの合成は、通常、それぞれ、リジンまたはアスパラギン酸/グルタミン酸の機能の使用に依存する、キャリアタンパク質配列上に存在する。これは単一ではなく、グリココンジュゲートの異種混合物につながります。
タンパク質中のアミノ酸残基の反応性、入手可能性または分布に関する遊びは、糖類/タンパク質結合性の効果を文書化するためにより信頼性の高い、より定義された糖コンジュゲートを生じさせる4。この目標に向けた一歩は、細胞工場5,6における制御されたグリコジュゲートワクチンの製造を可能にする組換えプロセスであるタンパク質グリカンカップリング技術を適用することによって達成することができる。しかし、グリコシル化は、D/EXNYS/Tセクオン内のアスパラギン残基(Xは20種類の天然アミノ酸のうち任意である)でのみ行われ、キャリアタンパク質には自然に存在しません。
選択的突然変異誘発、特にシステインを組み込んで高度かつ選択的な反応性を利用する部位は、代替7,8として出現する。UAAを配列に組み込んだキャリアタンパク質の製造は、均質なグリココンジュゲートワクチン調製に対してさらに柔軟性を提供することができます。100以上のUAAが開発され、さらに様々なタンパク質9、10に組み込まれています。それらの多くは、翻訳後修飾11を行うために通常使用される生体直交機能を含むか、生物物理学的プローブ12または薬物13を移植するが、炭水化物抗原とのさらなる結合のための理想的なハンドルである。成功例は、無細胞タンパク質合成15を用いてBiotech14によって主張されているが、この戦略に従うグリココンジュゲートワクチンの調製は依然として普及するのを待っている。
変異キャリアタンパク質の産生のためのin vivo戦略の適用には、特定のコドン、コドンを認識するtRNA、およびtRNA上のUAAの伝達を特異的に触媒するアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)を含む改変翻訳機械が必要である(図1)16。ピロリシンアンバーストップコドン抑制は、UAA、特にプロピルジルリジン(PrK)17を組み込むために最も広く使用される方法の一つである。後者は、アジド機能化炭水化物ハプテンと反応して、完全に定義された均質なグリココンジュゲートを提供することができます。本稿では、アルキンハンドルを持つUAAであるプロパルギルL-リジンを合成する方法、細菌中での翻訳中に標的タンパク質に組み込む方法、そして最後に、修飾タンパク質と、クリックケミストリーを用いたアジド関数を担うハプテンとの結合を行う方法について述べています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

遺伝子コードの拡張は、非天然アミノ酸(UAA)をタンパク質に導入してその特性を改変したり、新しいタンパク質機能を研究または作成したり、タンパク質コンジュゲートにアクセスしたりするための強力なツールです。停止コドン抑制、特にアンバーコドン抑制は、定義された位置でUAAを遺伝的に導入する最も一般的な方法として出現した。この方法論は、本明細書において、生体直交性官能基を収容するUAAを含む担体タンパク質の調製に適用される。この反応性ハンドルは、次に、合成オリゴ糖ハプテンを特異的かつ効率的に移植し、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために使用することができる。このプロトコルは、1:1炭水化物ハプテン/キャリアタンパク質比におけるグリココンジュゲートの合成に限定されるが、多数の二元性官能基のペアに適している。グリココンジュゲートワクチンの均質性は、完全な物理化学的特徴付けを確実にする重要な基準であり、それにより、より厳しい薬物規制機関の勧告を満たし、古典的な共役戦略によって満たされていない基準である。さらに、このプロトコルは、実際のコンジュゲートワクチンの構造を細かく調整することを可能にし、構造と免疫原性の関係に対処するためのツールを生み出す。

本プロジェクトでは、アンバーストップコドン抑制戦略を用いて均質なグリコジュゲートワクチンを作成し、定義された部位でUAAを導入した(図1)。気球状表面接着Aは、キャリアタンパク質部分として選択した。このタンパク質は高度に保存され、肺炎球菌22のすべての株によって発現される。それは免疫原性が高く、以?...

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Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

遺伝的コード拡張は、定義された部位のキャリアタンパク質に対角関数群を持つ非天然アミノ酸の導入に適用される。この二元性機能は、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために、炭水化物抗原の部位選択的結合に対してさらに使用される。

ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

この手順の全体的な目標は、非正規アミノ酸の組み込みとクリック化学を組み合わせることによって均質なグリココンジュゲートワクチンを製造することです。遺伝子コードの拡張は、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込み、その特性を改変したり、新しいタンパク質機能を研究または作成したり、タンパク質コンジュゲートにアクセスしたりするための強力なツールです。コドン抑制法は、異なる位置に非天然アミノ酸を組み込むための最も一般的な方法として登場しています。この方法論は、生体直交性官能基を抱える非天然アミノ酸を含むタンパク質担体の生産に適用される。この反応性ハンドルは、次に、合成オリゴ糖ハプテンを特異的かつ効率的に移植し、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために使用することができる。プロパギルリジン,PrK,市販のボックリジンから2段階で合成される。第1のステップでは、ボックリジンの無保護アミノ基がクロロホルメートのプロバルギルに変換される。第2のステップでは、αアミノ基は非保護される。N(α)ボク・プロパーギル・リジンを合成するには、まず5ミリリットルの水性1モルNaOHと5ミリリットルのTHFをフラスコに混合して500ミリグラムのボックリジンをフラスコに溶解し、フラスコをシリコン中隔でフィットさせます。氷浴でフラスコを冷やし、粉末が溶けるのを待ちます。次に、プロバルギルクロロホルメートを攪拌下で2〜3分間にわたって滴下して加えます。反応混合物を室温で温め、10時間撹拌を続ける。ジエチルエーテル、水性モル塩酸、酢酸エチルの冷却液。粗反応混合物を氷浴で冷まします。分離漏斗で混合物を注ぎます。50ミリリットルのジエチルエーテルと混合物を抽出します。抽出は圧力の蓄積をもたらし、圧力の蓄積を頻繁に解放することを確認してください。水相を回収し、有機層を廃棄する。慎重に追加, 分離漏斗の水相に1モル塩酸の50ミリリットル.次いで、酢酸エチルの30ミリリットルを用いて水層を2回抽出する。有機相を収集し、TLCによって化合物の存在を確認します。この段階では、有機相にあるべきである。結合した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させます。固相をフィルタオフします。そして、ロータリーエバポレーターに減圧下で濾液を濃縮します。粗油性N(α)の試料を重水素化クロロホルムに溶解し、NMRによってその同一性を制御する。プロパーギルL-リジンを合成するには、中隔を備えた丸いボタンフラスコにN(α)Boc-propargyl-リジンを導入する。アルゴンの下のフラスコに4ミリリットルの無水ジクロロメタンを加えます。攪拌下でトリフルオロ酢酸の滴方向、4ミリリットルを追加します。TFAがシリコン中隔を損傷するのを防ぐために、ガラス蓋用のシリコン中隔を交換してください。反応混合物を室温で1時間かき混ぜます。TLC による Boc-PrK の保護解除を確認します。反応混合物を減圧下で濃縮する。粗残渣にジエチルエーテルを加えます。フリットガラス上の白色固体の形でプロパーギル-L-リジンをフィルターします。プロパーギルL-リジンのアリコートを重水素酸化物に溶解し、そのアイデンティティと純度を制御するためにNMR分析を行う。プロパーギルL-リジンは、100ミリモルの最終濃度で蒸留水に溶解し、1ミリリットルのアリコートでマイナス20度で保存されます。プラスミドを発現株に同時変換するには、5分間に氷上で化学的に有能な大腸菌BL21の100マイクロリットルのアリコートを解凍する。各プラスミドの1マイクロリットルまたはそれぞれ100〜100ナノグラムを細胞に加え、氷の上で30分間インキュベートします。45秒間、42度で有能な細胞をインキュベートします。その後、2分間氷の上に戻します。900マイクロリットルのLB培地を加え、37度で1時間揺れ下でインキュベートし、抗生物質の発現を可能にする。その後、抗生物質でLB寒天に変換された細菌をプレートします。細菌は37度で一晩成長することができます。PrKで修飾されたタンパク質を発現させるために、抗生物質を用いてLB培地の5ミリリットルで単一の共形化コロニーを接種する。揺れで37度で一晩インキュベート。翌日、抗生物質を含む自動誘導培地の500ミリリットル、Lアラビノースの0.02%、PrKの1ミリモルで一次培養の5ミリリットルで希釈し、揺れの下で24時間37度でインキュベートする。野生型タンパク質遺伝子を含むクローンの培養を行うことによりPrKを行わずに培養を行い、陽性対照を行うことにより陰性対照を挙げられる。10分間に5,000xgで遠心分離により一晩培養から細胞を収穫する。上清を捨て、ペレットをマイナス20度で凍らせます。重力フローベンチアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製のために、細胞ペレットを20ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁させる。DNase Iとリソザイムを加え、30分間に37度で懸濁液をインキュベートしてリシスを可能にする。5分間に氷中の細胞を超音波処理し、30分間に20,000 x gで遠心分離によって細胞の破片を取り除きます。0.45マイクロメートルフィルターで溶精液を濾過Ni-NTA樹脂をサスペンションに加えます。4度で1時間やさしく混ぜます。ポリプロピレンカラムに懸濁液を注ぎ、非結合分画を収集します。樹脂を10ミリリットルで洗い、次に5ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。洗浄画分を収集します。1ミリメートルの溶出バッファーでHisタグ付きタンパク質をエルテし、このステップを4回繰り返し、すべての追加分画を収集します。純粋なヒスチジンタグ付きタンパク質を含む分数を組み合わせ、透析膜を使用して一晩TEVプロテアーゼバッファーの1リットルにそれを透析します。タンパク質サンプルを50ミリリットルチューブに集め、TEVバッファーを加えて、1ミリリットルの最終体積で1ミリリットル当たり2ミリグラムの最終濃度を得る。TEVプロテアーゼを100マイクロリットル加えます。0.1モルDTTの50マイクロリットルを加えます。最大5ミリリットルのTEVバッファーを完備。ゆっくりと揺れで、4度で一晩インキュベートします。EDTAを除去するために、透析膜および5ミリモルイミダゾールのリン酸緩衝液を使用して、タンパク質を一晩4度で透析する。TEVプロテアーゼと未消化タンパク質を排除するには、Ni-NTAビーズと混合をインキュベートし、4度で1時間穏やかに混ぜます。懸濁液をポリプロピレンカラムに注ぎます。非連結分数を収集しました。TEVプロテアーゼおよび未消化タンパク質はビーズに結合したままであり、消化されたタンパク質は溶出する。5ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗い、同様に洗浄分数を収集します。消化されたタンパク質を透析膜で一晩4度で1リットルのクリックバッファに対して透析し、イミダゾールを除去し、バッファーを交換します。そして280ナノメートルでタンパク質の濃度を測定する。6-六クロロ-フルオレセインアジド、または解毒剤機能化炭水化物抗原と共役するために、PrK変異タンパク質を57.8マイクロモルの濃度で2ミリリットルマイクロチューブに入れる。5ミリモルアジド化合物の10マイクロリットルを追加し、その後、硫酸銅溶液とTHPTAのプレミックスを追加します。塩酸塩のアミノグアニジンを追加します。.アスコルビン酸ナトリウムの水溶液を即日調製した添加物。チューブを閉じ、数回反転して混ぜ、室温で2時間インキュベートします。EDTAを添加して反応を停止する。SDS ページの結合を確認してください。移動後、312ナノメートルのUV光のゲルを蛍光体と共役に視覚化します。クーマシーブルーでゲルを染色するか、糖質抗原と共役を可視化する。ハプテンの添加としては、分子量の変化を誘発すべきである。糖コンジュゲートをPBSと平衡させたゲル濾過カラムに塗布して精製します。グリココンジュゲートを含む分画を収集します。長期保存のために、蒸留水に対してグリココンジュゲートを透析し、次に凍結乾燥し、マイナス80度でグリココンジュゲートを保存します。PrKはPsaAのN末語の近くでリジンの置換で位置32で導入された。mPsaA産生の有効性は、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたSDSページおよびウェスタンブロット分析によって確認された。完全長タンパク質の存在は、PrKの正常な組み込みを強く示す。しかし、強度は野生型のmpPsaAに対して観察された強度よりも低い。mPsaA(K32PrK)はニ・ンタビーズで精製されています。典型的な収量8ミリグラムとPrK残渣の組み込みにより、最終的に質量分析法によって確認された。ヒスチジンタグを、TEVプロテアーゼを用いたタンパク質分解切断時に除去した。mpPsaA(K32PrK)を有するアルキンの反応性をアジド機能フルオレセインを用いて評価し、さらに合成オリゴ糖抗原を共役させるために使用した。実験は、コントロールとして野生型のmpPsaAと比較して行われました。最後に、グリココンジュゲートをゲル濾過により精製し、その同一性を質量分析法により確認した。本プロジェクトでは、アンバーストップコドン抑制技術を用いて、定義された部位下に不天然アミノ酸を組み込む均質なグリコジュエン酸ワクチンを調製した。グリココンジュゲートワクチンの均質性は、完全な物理化学的特徴付けを確実にする重要な基準です。そして、それによって、ますます要求の厳しい薬物機関の勧告を満たす。この基準は、古典的な純粋結合法を用いて満たされない。また、このプロトコルは、グリココンジュゲートワクチンの構造を細かく調整することを可能にする。グリココンジュゲートの均質性と構造の関係を研究する前例のないツールを生み出す。

Research

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