Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. 감사라 레지온 지불 드 라 루아르 (Pari Scientifique 프로그램 "BioSynProt"), 특히 T.V.에 박사 펠로우십에서 재정 지원을 인정합니다. 우리는 또한 그의 소중한 기술 적 조언에 대한 박사 로버트 B. 쿼스트 (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, 툴루즈, 프랑스)를 인정합니다.

1. UAA의 합성 : propargyl-리신 (PrK)
<ol><li>N α합성 -Boc-propargyl-리신18<ol>
<li>500 mg의 Boc-L-Lys-OH(2.03 mmol)를 플라스크에 수성 1 M NaOH(5mL) 및 THF(5mL)를 혼합하여 블래스크에 넣고 플라스크에 실리콘 중격을 맞춥니다.</li>
		<li>얼음 욕조에서 플라스크를 식힌 다음 교반하는 동안 미세한 고리를 사용하여 158 μL의 프로파일 클로로포메이트(1.62mmol)를 드롭와이즈(2-3분 동안)를 넣?...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

현장 지향 돌연변이 발생은 글리코콘주게이트 백신7,8,14를준비하는 것을 목표로 거의 사용되지 않는 단백질의 정의된 위치에 특정 아미노산을 통합하는 간단한 전략이다. 20가지 천연 아미노산 접근법에 기초한 고전적인 돌연변이 발생은 번역 기계의 수정이 필요하지 않으므로 매우 효율적입니다. 시스테인 돌연변이는 일반?...

글리코콘주게이트 백신은 전염병의 예방 치료에 사용할 수 있는 백신 무기고의 필수 요소입니다. 그들은 젊은 유아를 포함하여 광범위한 연령 집단에서 안전하고, 잘 용납되고 능률적입니다. 그들은 수막구균, 폐렴구균 또는 혈우병 인플루엔자 형 b1과같은 캡슐화된 박테리아에 의한 감염에 대한 최적의 방어를 제공한다. 글리코코콘주게이트 백신은 담체 단백질에 공동으로 연결되는 이러한 표면 발현 다당류2를모방한 박테리아 또는 합성 올리고당류의 캡슐을 형성하는 정제된 세균다당류로 만들어집니다. 담체 단백질의 존재는 탄수화물 항원3에의해 표현된 항원 결정제에 대하여 지시된 보호적인 유머 면역 반응을 승진시키기 위하여 필수적이다 3. 탄수화물 항원의 신중한 선택 및 생산 외에도, 글리코콘주게이트 백신의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려진 특징은 담체 단백질의 성질, 융합 화학(사용되는 경우 링커의 성질 및 길이 포함), 또는 당캐라이드/단백질 비3이다. 명백하게, 사카라이드가 단백질에 접합되는 위치뿐만 아니라 연결점의 수는 면역원성에 관련이 있습니다. 현재까지, 이 두 매개 변수는 글리코콘주게이트의 준비가 주로 경험적으로 남아 있기 때문에 거의 연구되지 않았습니다. 그들의 합성은 일반적으로 담체 단백질 서열에 존재하는 리신 또는 아스파르트/글루타믹 산 측 사슬 잔류물의 아민 또는 카복실산 기능의 사용에 의존한다. 이것은 단일하지만 글리코콘주게이트의 이질적인 혼합물로 이어집니다.
단백질내 아미노산 잔류물의 반응성, 접근성 또는 분포에 재생하면 saccharide/protein 연결4의효과를 문서화하는 데 더 신뢰할 수 있는 보다 정의된 글리코콘주게이트가 발생합니다. 이러한 목표를 향한 한 걸음 앞으로 단백질 글리칸 커플링 기술, 세포 공장에서 제어글리코콘주게이트 백신의 생산을 허용하는 재조합 공정5,6. 그러나, 글리코실레이션은 전적으로 D/EXNYS/T 세쿤 내의 아스파라진 잔류물에서 일어난다(X는 20가지 천연 아미노산 중 하나임), 담체 단백질에 자연적으로 존재하지 않는다.
사이트 선택적 돌연변이 발생 및 특히 시스테인의 편입이 고도로 선택적 반응성을 악용하는 대안7,8로나타난다. 그들의 순서에 UAA를 통합하는 담체 단백질의 생산은 균일한 글리코콘주게이트 백신 준비를 위한 더 많은 융통성을 제공할 수 있습니다. 100개 이상의 UAA가 개발되어 다양한 단백질9,10에추가로 통합되었다. 그들 중 많은 사람들이 일반적으로 포스트 번역 수정을 수행하거나 생체 물리학 프로브(12 또는 약13)를 이식하는 데 사용되는 생물 ororthogonal 기능을 포함하지만 탄수화물 항원과의 추가 연상을위한 이상적인 핸들입니다. 성공적인 예는 세포 없는 단백질 합성을 사용하여 생명공학14에 의해 주장되었습니다15 그러나 이 전략에 따라 글리코콘주게이트 백신의 준비는 아직도 대중화되기를 기다립니다.
돌연변이 된 담체 단백질의 생산을 위한 생체 내 전략의 적용은 tRNA(도 1)16에 UAA의 전송을 구체적으로 촉매하는 특정 코돈, 코돈 및 아미노 아필 -tRNA 신디사이저 (aaRS)를 인식하는 tRNA를 포함하는 변형 된 번역 기계를 필요로한다( 도1) 16. pyrrolysine 앰버 스톱 코돈 억제는 UAA, 특히 propargyl-lysine (PrK)17을통합하는 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 후자는 아지도 기능성 탄수화물 햅텐과 반응하여 완전히 정의된 균일한 글리코코콘쥬게이트를 제공할 수 있습니다. 본 원고에서는 알킨 핸들을 운반하는 UAA인 propargyl-L-lysine을 합성하는 방법, 박테리아에서 번역하는 동안 표적 단백질에 통합하는 방법, 마지막으로 수정된 단백질과 클릭 화학을 사용하여 아지드 기능을 운반하는 햅텐 사이의 연상을 수행하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산 (UAA)을 단백질에 도입하여 특성을 수정하거나 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나 단백질 컨쥬게이트에 액세스 할 수있는 강력한 도구입니다. 스톱 코돈 억제, 특히 앰버 코돈 억제는 정의된 위치에서 UAA를 유전적으로 도입하는 가장 인기있는 방법으로 부상했습니다. 본명에서 생물요르토곤 기능성 군을 수용하는 UAA를 함유하는 담체 단백질의 제조에 적용된다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 1:1 탄수화물 hapten/반송파 단백질 비율에서 글리코콘주게이트의 합성으로 제한되지만 수많은 바이오트호고날 기능성 군으로 만만치 않습니다. 글리코코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하기 위한 중요한 기준이며, 이로 인해 점점 더 까다로운 약물 규제 기관의 권고, 고전적인 융합 전략에 의해 충족되지 않은 기준을 충족시다. 더욱이, 이 프로토콜은 실제 컨쥬게이트 백신의 구조를 미세하게 조정하여 구조-면역원성 관계를 해결하는 도구를 제공할 수 있게 한다.

이 프로젝트에서, 균일한 글리코콘주게이트 백신은 정의된부위(도 1)에서UAA를 도입하기 위한 호박스톱 코돈 억제 전략을 사용하여 제조하였다. 폐렴구균 표면 접착제 A는 담체 단백질 모이티로 선택되었다. 이 단백질은 염충균 폐렴22의모든 변종에 의해 높게 보존되고 표현된다. 그것은 고액 면역원성 및 이전에 폐렴구균 백?...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

이 절차의 전반적인 목표는 비 정황 아미노산 의 통합 및 클릭 화학을 결합하여 균일 한 글리코콘 주게이트 백신을 생산하는 것입니다. 유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산을 단백질에 통합하여 특성을 수정하거나, 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나, 단백질 컨쥬게이트에 접근할 수 있는 강력한 도구입니다. 코돈 억제 방법은 다른 위치에 부자연스러운 아미노산을 통합하는 가장 인기있는 방법으로 등장했다.이러한 방법론은 생물요르토곤 기능군을 수용하는 부자연스러운 아미노산을 함유한 단백질 담체의 생산에 적용될 것이다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. propargyl-lysine, PrK, 상업 Boc-lysine에서 두 단계로 합성 됩니다.첫 번째 단계에서, Boc-lysine의 보호되지 않은 아미노 그룹은 프로파질 클로로포메이트로 변환됩니다. 두 번째 단계에서, 알파 아미노 군은 보호 해제된다. N(알파)의 합성을 위해, 먼저 5밀리그램의 Boc-lysine을 수성 한 어금니 NaOH와 5밀리리터의 플라스크에 넣고 실리콘 중격으로 플라스크에 맞춥니다.얼음 욕조에서 플라스크를 식히고 분말이 녹을 때까지 기다립니다. 그런 다음 교반 하에서 2~3분 동안 프로파르질 클로로포메이트 드롭와이즈를 추가합니다. 반응 혼합물을 실온에서 따뜻하게 하고 10시간 동안 교반을 계속합니다.다이틸 에테르, 수성 1개의 어금니 염산 및 에틸 아세테이트의 냉각 솔루션을 식힙니다. 얼음 욕조에서 조잡한 반응 혼합물을 식힙니다. 분리 깔때기에 혼합물을 붓습니다.다이틸 에테르의 50 밀리리터와 혼합물을 추출합니다. 추출은 압력이 축적되어 압력 축적을 자주 방출해야 할 수 있습니다. 수성 위상을 수집하고 유기 층을 폐기하십시오.조심스럽게, 분리 깔때기의 수성 상에 하나의 어금니 염산의 50 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 에틸 아세테이트의 30 밀리리터를 사용하여 수성 층을 두 번 추출한다. 유기 단계를 수집, TLC에 의해 화합물의 존재를 확인합니다.이 단계에서는 유기 단계에 있어야합니다. 결합된 유기층을 황산마그네슘 위에 건조시다. 솔리드 위상을 필터링합니다.그리고 회전 증발기에 대한 압력 감소하에 여과를 농축한다. 유정 N(알파)의 황량한 염화물 리신 샘플을 유정 클로로포형태로 용해하고 NMR에 의해 그 정체성을 제어한다. 프로파질-L-리신을 합성하려면 중격이 장착된 둥근 버튼 플라스크에 N(알파)의 Boc-propargyl-lysine을 소개합니다.아곤 아래 플라스크에 아하이드루스 디클로로메탄 4밀리리터를 넣습니다. 교반 밑에 트리플루오로아세산4밀리리터를 넣으세요. TFA가 실리콘 중격을 손상시키지 않도록 유리 뚜껑에 실리콘 중격을 교체하십시오.반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. TLC에 의해 Boc-PrK의 보호 해제를 확인합니다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축합니다.다이틸 에테르를 조잡한 잔류에 넣습니다. 프릿드 유리에 흰색 고체의 형태로 propargyl-L-lysine을 필터링합니다. 중수소 산화물에서 propargyl-L-lysine의 알리쿼트를 녹인 다음 NMR 분석을 수행하여 정체성과 순도를 제어합니다.Propargyl-L-lysine은 100 밀리머의 최종 농도에서 증류수에 용해되고 1 밀리리터 알리쿼트에서 영하 20도에 저장됩니다. 플라스미드를 발현 변형으로 공동 변환하려면 5분 동안 화학적으로 유능한 E.Coli BL21의 100마이크로리터 알리쿼트를 얼음위에 담급드시킵니다. 각 플라스미드 또는 50~100나노그램의 마이크로리터를 세포에 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다.유능한 세포를 42도에서 45초 동안 배양합니다. 그런 다음 2 분 동안 얼음에 다시 넣습니다. LB 배지의 900 마이크로리터를 추가하고 항생제 발현을 허용하기 위해 37도에서 1 시간 동안 흔들어서 배양하십시오.그런 다음 항생제로 LB 한천에 변형 된 박테리아를 접시. 박테리아가 37도에서 하룻밤 사이에 자라도록 허용하십시오. PrK로 변형된 단백질을 표현하기 위해, 항생제를 가진 LB 배지의 5밀리리터에 단일 공동 변환된 식민지를 접종하십시오.흔들림으로 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 항생제를 함유한 자동 유도 배지 500밀리리터, L-아라비노스0.02%, PrK 1밀리머 1개, 24시간 동안 37도에서 배양하여 희석한다. 야생형 단백질 유전자를 함유하는 클론의 배양을 수행함으로써 PrK 및 양성 대조군 없이 배양을 수행함으로써 음성 조절을 포함한다.10 분 동안 5, 000 x g에서 원심 분리에 의해 하룻밤 배양에서 세포를 수확하십시오. 상체를 버리고 펠릿을 영하 20도에서 동결하십시오. 중력 흐름 벤치 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질의 정제를 위해 세포 펠릿을 용해 완충제의 20 밀리리터로 재보선다.DNase I와 lysozyme를 추가하고 30 분 동안 37도에서 서스펜션을 배양하여 lysis를 허용하십시오. 5 분 동안 얼음에서 세포를 초음파 처리 한 다음 30 분 동안 20, 000 x g에서 원심 분리로 세포 파편을 제거합니다. 0.45 마이크로미터 필터로 용액을 여과하여 서스펜션에 Ni-NTA 수지 추가합니다.1 시간 동안 4도에서 부드럽게 섞습니다. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓고 언바운드 분수를 수집합니다. 수지 10밀리리터와 5밀리리터의 세척 버퍼로 씻어내라.세척 분획을 수집합니다. 1밀리미터의 용출 완충액으로 그의 태그가 지정된 단백질을 엘테우우고 이 단계를 네 번 반복하고 모든 추가 분수를 수집합니다. 순수 히스티딘 태그 단백질을 함유한 분획을 결합하고 투석 막을 사용하여 하룻밤 사이에 TEV 프로테아제 버퍼 1리터로 투석합니다.단백질 샘플을 50 밀리리터 튜브로 수집하고 TEV 버퍼를 추가하여 밀리리터당 최종 농도를 1밀리리터로 얻습니다. TEV 프로테아제 100마이크로리터를 추가합니다. 0.1 어금니 DTT의 마이크로리터 50기를 추가합니다.최대 5밀리리터의 TEV 버퍼로 완성됩니다. 천천히 흔들리면서 하룻밤 동안 4도에서 배양하십시오. EDTA를 제거하려면 투석 막및 인산염 완충제가 5밀리머 이미다졸로 사용하여 하룻밤 사이에 단백질을 4도에서 투석합니다.TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질을 제거하려면 Ni-NTA 구슬과 혼합을 배양하고 4도에서 1시간 동안 부드럽게 섞습니다. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓습니다. 언바운드 분수를 수집했습니다.TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질은 구슬에 묶여 있고 소화된 단백질은 용출됩니다. 5밀리리터의 세정 완충제로 컬럼을 씻고 세척 분획도 수집합니다. 소화된 단백질을 투석막으로 하룻밤 4도에서 1리터의 클릭 버퍼에 대해 투석을 하여 이미다졸을 제거하고 완충액을 교환합니다.그리고 280 나노미터에서 단백질의 농도를 측정한다. 6헥사클로로-플루오레세인 아지드 또는 해독제 기능성 탄수화물 항원으로 MVPaA를 결합하기 위해 PrK 돌연변이 단백질을 57.8 마이크로몰라 농도의 농도로 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 5 밀리머 아지드 화합물의 10 마이크로 리터를 추가 한 다음 구리 황산염 용액과 THPTA의 사전 혼합을 추가합니다.아미노구아니딘 염산염을 추가합니다. 아스코바테 나트륨의 현세적으로 준비된 수성 용액을 추가합니다. 튜브를 닫고 여러 번 반전하여 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.EDTA를 추가하여 반응을 중지합니다. SDS 페이지에서 컨쥬게이션을 확인합니다. 이동 후, 플루오레세인이 있는 컨쥬게이트를 위해 312 나노미터에서 UV 광에 겔을 시각화한다.또는 쿠마시 블루로 젤을 얼룩지게 하여 탄수화물 항원과의 컨쥬게이트를 시각화합니다. 햅텐을 첨가하면 분자량의 변화를 유도해야 한다. PBS와 함께 상형화된 젤 여과 컬럼에 적용하여 글리코콘주게이트를 정화합니다.글리코콘주게이트를 포함하는 분획을 수집합니다. 장시간 보관을 위해 글리코콘주게이트를 증류수에 투석한 다음 동결 건조한 다음 글리코콘주게이트를 영하 80도에 보관합니다. PrK는 PsaA의 N 종자 근처 리신의 교체에 위치 32에 도입되었습니다.MPaA 생산의 효능은 안티 히스티딘 태그 항체를 사용하여 SDS 페이지 및 서양 블롯 분석에 의해 검사되었습니다. 전체 길이 단백질의 존재는 강하게 PrK의 성공적인 통합을 나타냅니다. 강도는, 그러나, 야생 형 의원에 대 한 관찰 보다 낮은.국회의원(K32PrK)은 니-NTA 구슬에 정제되었다. 8 밀리그램의 전형적인 수율과 PrK 잔류물의 통합으로 마침내 대량 분석법에 의해 확인되었다. 히스티딘 태그는 TEV 프로테아제를 사용하여 프로테오리틱 분열 시 제거되었습니다.mpPsaA(K32PrK)를 갖는 알키인의 반응성은 아지도 기능성 형광제신을 이용하여 평가되었고 합성 올리고당항소를 수렴하는 데 더 사용되었다. 실험은 대조군으로 야생 형 mpaA에 비해 수행되었다. 마지막으로, 글리코콘주게이트는 젤 여과와 질량 분석법에 의해 확인된 그 정체성에 의해 정제되었다.이 프로젝트에서, 균일한 글리코콘주게이트 백신은 정의된 부위 하에서 부자연스러운 아미노산을 통합하기 위해 호박스톱 코돈 억제 기술을 사용하여 제조되었다. 글리코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하는 중요한 기준입니다. 그리고, 점점 더 까다로운 마약 기관 권고를 만족.이 기준은 고전적인 순수 컨쥬게이션 방법을 사용하여 만족하지 않습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 글리코콘주게이트 백신의 구조를 미세하게 조정할 수 있게 한다. 균일성과 글리코콘주게이트의 구조 사이의 관계를 연구하는 전례없는 도구를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

연구

생체공학

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

결합 표면의 접목 및 Postmodification 과정에 의한 빛의 응답 멤브레인의 제조

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...