Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. anerkjenner takknemlig den økonomiske støtten fra La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), spesielt et doktorgradsfellesskap til T.V. Vi anerkjenner også Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrike) for hans dyrebare tekniske råd.

1. Syntese av UAA: propargyl-lysin (PrK)
<ol><li>Syntese av Nα-Boc-propargyl-lysin18<ol>
<li>Oppløs 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) i en blanding av vandig 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monter kolben med silisiumsepum.</li>
		<li>Avkjøl kolben i et isbad og tilsett deretter 158 μL propargylklorformat (1,62 mmol) dropwise (over en 2-3 min periode) ved hjelp av en mikrosyring under omrøring.</li>
		<li>Varm reaksjonsblandingen til romtemperatur og fortsett å...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Stedsrettet mutagenese er en enkel strategi for å innlemme spesifikke aminosyrer i en definert posisjon av et protein som forblir knapt brukt med sikte på å forberede glykokonjugatvaksiner7,8,14. Klassisk mutagenese basert på 20 naturlige aminosyrer tilnærming er svært effektiv siden ingen endring av oversettelse maskiner er nødvendig. Cystein mutasjoner er vanligvis rettet mot å utforske den unike tiol reaktivitet enten...

Glycoconjugate vaksiner er viktige elementer i vaksinearsenalet tilgjengelig for profylaktisk behandling av smittsomme sykdommer. De er trygge, godt tolerert og effektive i en bred aldersgruppe, inkludert små spedbarn. De gir optimalt forsvar mot infeksjoner forårsaket av kapsulerte bakterier som meningokokker, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b1. Glykokonjutere vaksiner er laget av rensede bakterielle polysakkarider som danner kapslene av bakterier eller syntetiske oligosakkarider som etterligner disse overflateutpressede polysakkarider2, som er kovalent knyttet til et bærerprotein. Tilstedeværelsen av et bærerprotein er viktig for å fremme beskyttende humorale immunresponser rettet mot den antigene determinanten uttrykt av karbohydratantigenene3. Bortsett fra et nøye utvalg og produksjon av karbohydratantigenet, er funksjonene som er kjent for å utøve innflytelse på effekten av en glykoconjugate vaksine: arten av bærerproteinet, bøyningkjemien (inkludert arten og lengden på linkeren hvis den brukes), eller sakkarid /proteinforholdet 3. Selvfølgelig er posisjonene der sakkaridet er konjugert til proteinet, samt antall tilkoblingspunkter relevante for immunogenitet. Til dags dato har disse to parametrene knapt blitt studert fordi utarbeidelsen av glykokonjugatene forblir i stor grad empiriske. Deres syntese er vanligvis avhengig av bruk av amin eller karboksylsyre funksjoner av henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekjede rester som finnes på bærer protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding av glykokonjugater.
Å spille på reaktivitet, tilgjengelighet eller distribusjon av aminosyrerester i proteinet gir opphav til mer definerte glykokonjugater som er mer pålitelige for å dokumentere effekten av sakkarid / proteintilkobling4. Et skritt fremover mot dette målet kan oppnås ved å bruke proteinglykotankoblingsteknologi, en rekombinant prosess som gjør det mulig å lage kontrollerte glykokonjuterevaksiner i cellefabrikker 5,6. Glykosyleringen foregår imidlertid utelukkende ved en asparaginrester i D/EXNYS/T-sequons (der X er noen av de 20 naturlige aminosyrene), som ikke er naturlig tilstede på bærerproteinene.
Nettstedet selektiv mutagenesis og spesielt inkorporering av cysteiner for å utnytte sin svært og selektiv reaktivitet vises som et alternativ7,8. Produksjon av bærerproteiner som omfatter UAAer i deres sekvens kan gi enda mer fleksibilitet for homogen glykokonjugering av vaksinepreparat. Mer enn 100 UAAs har blitt utviklet og videre innlemmet i ulikeproteiner 9,10. Mange av dem inneholder bioorthogonale funksjoner som vanligvis brukes til å utføre post translasjonellemodifikasjoner 11 eller for å pode biofysiske sonder12 eller narkotika13, men som er ideelle håndtak for videre bøyning med karbohydratantigener. Vellykkede eksempler har blitt hevdet av Biotech14 ved hjelp av cellefri proteinsyntese15, men utarbeidelse av glykokonjugatvaksiner i henhold til denne strategien venter fortsatt på å bli popularisert.
Anvendelse av in vivo strategi for produksjon av mutert bærer protein trenger en modifisert translasjonell maskineri som inkluderer en bestemt kodon, en tRNA gjenkjenne kodon og en aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) som spesielt katalyserer overføringen av UAA på tRNA (Figur 1)16. Pyrrolysin amber stop codon undertrykkelse er en av de mest brukte metodene for å innlemme UAA, spesielt propargyl-lysin (PrK)17. Sistnevnte kan igjen reagere med aziido-funksjonaliserte karbohydrat haptens å gi fullt definerte, homogene glykokonjugater. I det nåværende manuskriptet beskriver vi hvordan man syntetiserer propargyl-L-lysinen, en UAA som bærer et alkynehåndtak, hvordan man innlemmer det i et målprotein under oversettelsen i en bakterie og til slutt hvordan man utfører bøyning mellom det modifiserte proteinet og en hapten som bærer en azidefunksjon ved hjelp av klikkkjemi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

Genetisk kodeutvidelse er et kraftig verktøy for å introdusere unaturlige aminosyrer (UAAer) i proteiner for å endre sine egenskaper, for å studere eller skape nye proteinfunksjoner eller å ha tilgang til proteinkonjugater. Stopp codon undertrykkelse, spesielt amber codon undertrykkelse, har dukket opp som den mest populære metoden for å genetisk introdusere UAAs på definerte stillinger. Denne metodikken brukes her på utarbeidelsen av et bærerprotein som inneholder en UAA som huser en bioorthogonal funksjonell gruppe. Dette reaktive håndtaket kan deretter brukes til å spesifikt og effektivt transplantere en syntetisk oligosakkarid hapten for å gi en homogen glykoconjugate vaksine. Protokollen er begrenset til syntesen av glykokonjugater i et 1:1 karbohydrat hapten / bærer proteinforhold, men mottagelig for mange par biorthogonale funksjonelle grupper. Glykokonjutere vaksine homogenitet er et viktig kriterium for å sikre fullstendig fysikalisk-kjemisk karakterisering, og dermed tilfredsstille flere og flere krevende narkotika regulatoriske byrå anbefalinger, et kriterium som er udekket av klassiske bøyningsstrategier. Videre gjør denne protokollen det mulig å finjustere strukturen til den faktiske konjugatvaksinen, noe som gir opphav til verktøy for å håndtere struktur-immunogenitetsrelasjoner.

I dette prosjektet ble en homogen glykoconjugate vaksine utarbeidet ved hjelp av amber stop codon undertrykkelse strategi for å introdusere en UAA på et definert sted (Figur 1). Pneumoccocal overflateadhesin A ble valgt som bærer protein moiety. Dette proteinet er svært bevart og uttrykt av alle stammer av Streptococcus pneumoniae22. Det er svært immunogent og tidligere brukt som bærer i pneumokokkvaksineformuleringer<su...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetisk kodeutvidelse brukes for innføring av en unaturlig aminosyre som bærer en biorthogonal funksjonell gruppe på et bærerprotein på et definert sted. Biorthogonalfunksjonen brukes videre til den stedselektive koblingen av et karbohydratantigen for å gi en homogen glykokonjugatvaksine.

Homogen glykokonjugat produsert av kombinert unaturlig aminosyre inkorporering og klikk-kjemi for vaksineformål

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å produsere en homogen glykokonjugatvaksine ved å kombinere ikke-kanonisk aminosyreinkorporering og klikkkjemi. Genetisk kode utvidelse er et kraftig verktøy for å innlemme unaturlige aminosyrer i proteiner for å endre sine egenskaper, å studere eller skape nye proteinfunksjoner, eller å ha tilgang til protein konjugater. En kodonundertrykkelsesmetode har dukket opp som den mest populære metoden for å innlemme unaturlige aminosyrer i forskjellige posisjoner.Denne metodikken vil bli her brukt på produksjonen av en proteinbærer som inneholder en unaturlig aminosyre som huser en bioorthogonal funksjonell gruppe. Dette reaktive håndtaket kan deretter brukes til å spesifikt og effektivt transplantere en syntetisk oligosakkarid hapten for å gi en homogen glykoconjugate vaksine. Propargyllysin, PrK, syntetiseres i to trinn fra kommersiell boc-lysin.I det første trinnet konverteres den ubeskyttede aminogruppen av Boc-lysin til propargylklorformat. I et annet trinn er alfaaminogruppen de-beskyttet. For å syntetisere N(alfa)Boc-propargyl-lysin, oppløs først 500 milligram Boc-lysin i blandingen av fem milliliter av vandig en molar NaOH og fem milliliter THF i en kolbe og monter kolben med et silisiumseptum.Avkjøl kolben i et isbad og vent til pulveret skal oppløses. Tilsett deretter propargylklorformat drop-wise over en to til tre minutter periode under omrøring. Varm reaksjonsblandingen ved romtemperatur og fortsett omrøringen i 10 timer.Avkjøl løsninger av dietyleter, vandig en molarhydroklorsyre og etylacetat. Avkjøl den grove reaksjonsblandingen i et isbad. Hell blandingen i en separeringstrakt.Ekstraher en blanding med femti milliliter dietyleter. Ekstraksjon kan føre til en oppbygging av trykk, sørg for at du slipper ut trykkoppbygging ofte. Samle vandig fase og kast det organiske laget.Tilsett forsiktig, femti milliliter av en molar saltsyre til vandig fase i separeringstrakten. Deretter trekker du ut det vandige laget to ganger ved hjelp av tretti milliliter etylacetat. Samle organisk fase, Kontroller tilstedeværelsen av din sammensatte av TLC.På dette stadiet bør det være i organisk fase. Tørk de kombinerte organiske lagene over magnesiumsulfat. Filtrer av den faste fasen.Og konsentrere filtratet under redusert trykk på en roterende fordamper. Oppløs prøven av den rå fete N(alfa)Boc-propargyl-lysin i deuterated kloroform og kontrollere sin identitet av NMR. For å syntetisere propargyl-L-lysin, introdusere N(alfa)Boc-propargyl-lysin i en rund knapp kolbe utstyrt med septum.Tilsett fire milliliter vannfri diklormetan i kolben under argon. Tilsett drop-wise, fire milliliter trifluorotaketisk syre under omrøring. Bytt silisium septum for et glasslokk for å unngå TFA fra å skade silisium septum.Rør reaksjonsblandingen i en time ved romtemperatur. Kontroller de-beskyttelsen av Boc-PrK av TLC. Konsentrer reaksjonsblandingen under redusert trykk.Legg dietyleter til de rå rester. Filtrer propargyl-L-lysinen i form av et hvitt fast stoff på fritted-glass. Oppløs en aliquot av propargyl-L-lysin i deuteriumoksid, og utfør deretter NMR-analyse for å kontrollere sin identitet og renhet.Propargyl-L-lysin oppløses deretter i destillert vann ved den endelige konsentrasjonen på hundre millimolar og lagres ved minus 20 grader i en milliliter aliquots. For å forvandle plasmider til uttrykksstammen, tin hundre mikroliter aliquot av kjemisk kompetent E.Coli BL21 på is i løpet av fem minutter. Tilsett en mikroliter av hver plasmid eller femti til hundre nanogram av hver i cellene og inkuber dem i 30 minutter på is.Inkuber de kompetente cellene ved 42 grader, i løpet av 45 sekunder. Deretter legger du dem tilbake på is i to minutter. Tilsett ni hundre mikroliter lb medium og inkuber under risting i en time ved 37 grader for å tillate antibiotikauttrykk.Deretter plate de forvandlede bakteriene på LB agar med antibiotika. La bakterier vokse over natten ved 37 grader. For å uttrykke proteiner modifisert med PrK, inokulere en enkelt co-transformert koloni i fem milliliter LB medium med antibiotika.Inkuber over natten ved 37 grader med risting. Neste dag, fortynne med de fem milliliter av primærkultur i fem hundre milliliter av auto-induksjon medium som inneholder antibiotika, 0,02% av L-arabinose, og en millimolar av PrK og inkubere ved 37 grader i 24 timer under risting. Inkluder en negativ kontroll ved å utføre kulturen uten PrK og den positive kontrollen ved å utføre kulturen til en klone som inneholder det ville proteingenet.Høst celler fra nattkulturen ved sentrifugering på 5,000 x g i løpet av 10 minutter. Kast det overnaturlige og frys pelleten ved minus 20 grader. For rensing av proteinet ved tyngdekraften flow-benk affinitet kromatografi, resuspend cellen pellets i tjue milliliter lysis buffer.Tilsett DNase I og lysozyme, og la lysis ved å inkubere suspensjonen ved 37 grader i løpet av 30 minutter. Sonicate cellene i is i løpet av fem minutter, deretter fjerne celle rusk ved sentrifugering på 20, 000 x g i løpet av 30 minutter. Filtrat lysatet med 0,45 mikrometerfilter Tilsett Ni-NTA-harpiks til suspensjonen.Blandet forsiktig ved fire grader i en time. Hell suspensjonen i en polypropylenkolonne og samle den ubundne fraksjonen. Vask harpiksen med ti milliliter og deretter fem milliliter vaskebuffer.Samle vaskefraksjonene. Elute his-merket protein med en millimeter elution buffer og gjenta dette trinnet fire ganger og samle alle de ekstra brøkene. Kombiner fraksjonene som inneholder rene histidin-merkede proteiner og dialyze den i en liter TEV proteasebuffer over natten ved hjelp av dialysemembran.Samle proteinprøven i et 50 milliliter rør og tilsett TEV-buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på to milligram per milliliter i et endelig volum på en milliliter. Tilsett hundre mikroliter tev protease. Tilsett 50 mikroliter med 0,1 molar DTT.Komplett med TEV buffer opptil fem milliliter. Inkuber over natten på fire grader, med langsom risting. For å fjerne EDTA, dialyser proteinet ved fire grader over natten ved hjelp av dialysemembran og fosfatbuffer med fem millimolar imidazol.For å eliminere TEV protease og ufordøyde proteiner, inkuber blandingen med Ni-NTA perler og bland forsiktig i en time ved fire grader. Hell suspensjonen i en polypropylenkolonne. Samlet inn den ubundne fraksjonen.TEV protease og ufordøyd proteiner forblir bundet til perlene og det fordøyde proteinet er eluted. Vask kolonnen med fem milliliter vaskebuffer og samle vaskefraksjonene også. Dialyser det fordøyde proteinet mot en liter klikkbuffer ved fire grader over natten med dialysemembran for å fjerne imidazol, samt å bytte bufferen.Og mål konsentrasjonen av proteinet ved 280 nanometer. For å konjugere mPsaA med 6-heksaklor-fluorescein-azid, eller et motgiftfunksjonalisert karbohydratantigen, sett PrK mutert protein i en konsentrasjon på 57,8 mikrorør i et to milliliter mikrorør. Tilsett 10 mikroliter med fem millimolarazidforbindelse, og legg deretter til en pre-blanding av kobbersulfatløsning og THPTA.Tilsett aminoguanidhydroklorid. Tilsett ekstemporaneously forberedt vandig løsning av natriumaskorbat. Lukk røret, bland ved å invertere flere ganger og inkuber ved romtemperatur i to timer.Stopp reaksjonen ved å legge til EDTA. Sjekk bøyningen på SDS-siden. Etter migrering visualiser gelen på UV-lys ved 312 nanometer for konjugatet med fluorescein.Eller flekk gelen med Coomassie Blue for å visualisere konjugatet med karbohydratantigenet. Som tillegg av hapten bør indusere en endring av molekylvekt. Rens glykokonjugatet ved å bruke den på en gelfiltreringskolonne likevekt med PBS.Samle fraksjonene som inneholder glykokonjugatene. For langvarig lagring, dialyser glykokonjugeringen mot destillert vann, og frys deretter og lagre glykokonjugatet på minus 80 grader. PrK har blitt introdusert i posisjon 32 i erstatning av en lysin nær N-terminus av PsaA.Effekten av mPsaA produksjonen har blitt sjekket av SDS side og Western blot analyse ved hjelp av anti-Histidine tag antistoff. Tilstedeværelsen av et protein i full lengde indikerer sterkt vellykket inkorporering av PrK. Intensiteten er imidlertid lavere enn det som er observert for villtype mPsaA.MPsaA(K32PrK)har blitt renset på Ni-NTA perler. Med et typisk utbytte på åtte milligram og inkorporering av PrK-rester ble endelig bekreftet av massespektrometri. Histidin-taggen ble fjernet ved proteolytisk spalting ved hjelp av TEV-protease.Å ha mPsaA (K32PrK)reaktiviteten til alkynen ble vurdert ved hjelp av en azerofunksjonalisert fluorescein og videre brukt til å konjugere et syntetisk oligosakkaridantigen. Eksperimenter ble gjort i forhold til wild-type mPsaA som en kontroll. Til slutt ble glykokonjugatet renset av gelfiltrering og dens identitet bekreftet av massespektrometri.I dette prosjektet har homogene glykokonjugatvaksiner blitt utarbeidet ved hjelp av den gule stop codon-undertrykkingsteknologien for å innlemme en unaturlig aminosyre under definerte steder. Glykoconjugate vaksine homogenitet er et viktig kriterium for å sikre fullstendig fysikalisk-kjemisk karakterisering. Og dermed, tilfredsstille flere og flere krevende narkotika byrå anbefalinger.Dette kriteriet er ikke fornøyd ved å bruke den klassiske renbedømmingsmetoden. Videre gjør denne protokollen det mulig å finjustere strukturen til glykokonjugatvaksinen. Å gi opphav til et enestående verktøy for å studere forholdet mellom homogeniteten og strukturen til en glykokonjugat.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Skin tatovering som en ny tilnærming for DNA vaksine levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Utarbeidelse av Light-responsive Membraner av en kombinert Surface Negl og Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabrikasjon av en funksjon Magnetic Bakteriell Nanocellulose med jernoksid nanopartikler

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Sanntidsovervåking av Intracellulær gallesyre Dynamics Ved hjelp av en genetisk kodet FRET baserte gallesyre Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utvikling av en Flercellede Tredimensjonal organotypiske Model of Human tarmslimhinnen Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Nettsted rettet immobilisering av bein Morfogenetiske proteinet 2 Solid overflater av Klikk kjemi

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

'Golden' fluorescens av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer og proteiner analyse av massespektrometri og fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection av primære nyre vev segmenter og innlemmelse med romanen stillaset-fri konstruksjon teknologi

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobielle peptider produseres av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...