Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
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E.C. agradece el apoyo financiero de La Région Pays de la Loire (Programa Pari Scientifique "BioSynProt"), en particular una beca doctoral para T.V. También reconocemos al Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Francia) por sus valiosos consejos técnicos.

1. Síntesis de la UAA: propargil-lisina (PrK)
<ol><li>Síntesis de N α-Boc-propargyl-lisina18<ol>
<li>Disolver 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) en una mezcla de 1 M NaOH (5 ml) y THF (5 ml) en un matraz y colocar el matraz con un tabique de silicio.</li>
		<li>Enfríe el matraz en un baño de hielo y luego agregue 158 l de cloroformato propargilo (1,62 mmol) por gota (durante un período de 2-3 minutos) utilizando una microsyringe durante la agitación.</li>
		<li>Calenta...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

La mutagénesis dirigida por el sitio es una estrategia sencilla para incorporar aminoácidos específicos en una posición definida de una proteína que apenas se utiliza con el objetivo de preparar vacunas de glicoconjugado7,8,14. La mutagénesis clásica basada en el enfoque de 20 aminoácidos naturales es altamente eficiente ya que no se requiere ninguna modificación de la maquinaria de traducción. Las mutaciones de la cis...

Las vacunas contra el glicoconjugado son elementos esenciales del arsenal de vacunas disponible para el tratamiento profiláctico de enfermedades infecciosas. Son seguros, bien tolerados y eficientes en un amplio grupo de edad, incluidos los bebés pequeños. Proporcionan la defensa óptima contra las infecciones causadas por bacterias capsuladas como meningococo, neumococo o Haemophilus influenzae tipo b1. Las vacunas glucococonjugate están hechas de polisacáridos bacterianos purificados que forman las cápsulas de bacterias o oligosacáridos sintéticos que imitan estos polisacáridos expresados en superficie2,que están covalentemente vinculados a una proteína portadora. La presencia de una proteína portadora es esencial para promover respuestas inmunitarias humorales protectoras dirigidas contra el determinante antigénico expresado por los antígenos de carbohidratos3. Aparte de una cuidadosa selección y producción del antígeno de carbohidratos, las características que se sabe que ejercen una influencia en la eficacia de una vacuna glucoconjugada son: la naturaleza de la proteína portadora, la química de conjugación (incluyendo la naturaleza y la longitud del vinculador si se utiliza), o la relación sacárido/proteína3. Obviamente, las posiciones en las que el sacárido se conjuga con la proteína, así como el número de puntos de conectividad son relevantes para la inmunogenicidad. Hasta la fecha, estos dos parámetros apenas se han estudiado porque la preparación de los glicoconjugados sigue siendo en gran medida empírica. Su síntesis generalmente se basa en el uso de funciones de amina o ácido carboxílico de, respectivamente, residuos de cadena lateral de lisina o ácido aspártico/glutámico presentes en la secuencia de proteína portadora. Esto no conduce a una sola sino a una mezcla heterogénea de glicoconjugados.
Jugar con la reactividad, accesibilidad o distribución de los residuos de aminoácidos en la proteína da lugar a glucoconjugados más definidos que son más fiables para documentar el efecto de la conectividad de sacárido/proteína4. Un paso adelante hacia este objetivo se puede lograr mediante la aplicación de la tecnología de acoplamiento de glicano proteico, un proceso recombinante que permite la producción de vacunas de glucoconjugado controlado en fábricas celulares5,6. Sin embargo, la glicosilación tiene lugar exclusivamente en un residuo de asparagina dentro de las secuoyas D/EXNYS/T (en la que X es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales), no presente naturalmente en las proteínas portadoras.
La mutagénesis selectiva del sitio y, enparticular,la incorporación de cisteínas para explotar su alta y selectiva reactividad aparece como alternativa7,8. La producción de proteínas portadoras que incorporan UAAs en su secuencia puede ofrecer aún más flexibilidad para la preparación homogénea de vacunas con glucoconjugado. Más de 100 UAAs han sido desarrolladas e incorporadas en diversas proteínas9,10. Muchos de ellos contienen funciones bioortohogonales generalmente utilizadas para llevar a cabo modificaciones posteriores a la traducción11 o para injertar sondas biofísicas12 o fármacos13 pero que son mangos ideales para una conjugación adicional con antígenos de carbohidratos. Biotech14 ha reclamado ejemplos exitosos utilizando la síntesis de proteínas libres de células15, pero la preparación de vacunas de glucoconjugado de acuerdo con esta estrategia todavía espera a popularizarse.
La aplicación de la estrategia in vivo para la producción de proteína portadora mutada necesita una maquinaria traslacional modificada que incluya un codón específico, un ARN que reconozca el codón y un aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) que cataliza específicamente la transferencia de la UAA en el ARN (Figura 1)16. La supresión del codón de detención de ámbar pirro lisina es uno de los métodos más utilizados para incorporar UAA, en particular la propargyl-lisina (PrK)17. Este último a su vez puede reaccionar con haptens de carbohidratos azido-funcionalizados para proporcionar glucococonjugados homogéneos y totalmente definidos. En el presente manuscrito describimos cómo sintetizar el propargyl-L-lisina, un UAA que lleva un mango de alquina, cómo incorporarlo a una proteína diana durante su traducción en una bacteria y finalmente cómo realizar la conjugación entre la proteína modificada y un hapten que lleva una función de azide utilizando la química de clics.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

La expansión del código genético es una poderosa herramienta para introducir aminoácidos antinaturales (UAAs) en proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas o tener acceso a conjugados proteicos. Detener la supresión del codón, en particular la supresión del codón de ámbar, ha surgido como el método más popular para introducir genéticamente uaas en posiciones definidas. Esta metodología se aplica en este documento a la preparación de una proteína portadora que contiene una UAA que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. El protocolo se limita a la síntesis de glucoconjugados en una proporción de proteína de hapten/portador de carbohidratos 1:1, pero susceptible a numerosos pares de grupos funcionales biorthogonales. La homogeneidad de la vacuna glucococonjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa, satisfaciendo así las recomendaciones cada vez más exigentes de los organismos reguladores de medicamentos, un criterio que no se cumple con las estrategias clásicas de conjugación. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna conjugada real, dando lugar a herramientas para abordar las relaciones estructura-inmunogenicidad.

En este proyecto, se preparó una vacuna homogénea de glucoconjugado utilizando la estrategia de supresión de codón de parada de ámbar para introducir una UAA en un sitio definido (Figura 1). La adhesina de superficie neumocoica A fue seleccionada como la mitad de la proteína portadora. Esta proteína es altamente conservada y expresada por todas las cepas de Streptococcus pneumoniae22. Es altamente inmunogénico y anteri...

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Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

La expansión del código genético se aplica para la introducción de un aminoácido antinatural que lleva un grupo funcional biorthogonal en una proteína portadora en un sitio definido. La función biorthogonal se utiliza además para el acoplamiento selectivo del sitio de un antígeno de carbohidratos para proporcionar una vacuna de glucoconjugado homogénea.

Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

El objetivo general de este procedimiento es producir una vacuna de glicoconjugado homogénea mediante la combinación de la incorporación de aminoácidos no canónicos y la química de clics. La expansión del código genético es una poderosa herramienta para incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas, o tener acceso a conjugados proteicos. Un método de supresión de codón ha surgido como el método más popular para incorporar aminoácidos antinaturales en diferentes posiciones.Esta metodología se aplicará aquí a la producción de un portador de proteínas que contenga un aminoácido antinatural que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. La propargil-lisina, PrK, se sintetiza en dos pasos de Boc-lisina comercial.En el primer paso, el grupo amino desprotegido de la Boc-lisina se convierte en cloroformato propargyl. En un segundo paso, el grupo de aminoácidos alfa está desprotegidos. Para sintetizar el N(alfa)Boc-propargyl-lisine, primero disolver 500 miligramos de boc-lisina en la mezcla de cinco mililitros de un molar acuoso NaOH y cinco mililitros de THF en un matraz y encajar el matraz con un tabique de silicio.Enfríe el matraz en un baño de hielo y espere a que se disuelva el polvo. A continuación, agregue el propargyl chloroformate drop-wise durante un período de dos a tres minutos bajo agitación. Caliente la mezcla de reacción a temperatura ambiente y continúe revolviendo durante 10 horas.Enfriar las soluciones de éter dietílico, ácido clorhídrico molar acuoso y acetato de etilo. Enfríe la mezcla de reacción bruta en un baño de hielo. Vierta la mezcla en un embudo separador.Extraiga una mezcla con cincuenta mililitros de éter dietílico. La extracción puede resultar en una acumulación de presión, asegúrese de liberar cualquier acumulación de presión con frecuencia. Recoger la fase acuosa y descartar la capa orgánica.Añadir con cautela, cincuenta mililitros de un ácido clorhídrico molar a la fase acuosa en el embudo separador. Luego, extrae la capa acuosa dos veces usando treinta mililitros de acetato de etilo. Recoger la fase orgánica, Verificar la presencia de su compuesto por TLC.En esta etapa, debe estar en la fase orgánica. Seque las capas orgánicas combinadas sobre el sulfato de magnesio. Filtrar la fase sólida.Y concentrar el filtrado bajo presión reducida en un evaporador rotatorio. Disolver la muestra del N(alfa)Boc-propargyl-lisina aceiteh crudo en cloroformo deuterated y controlar su identidad por RMN. Para sintetizar el propargyl-L-lisine, introducir el N(alpha)Boc-propargyl-lisine en un matraz de botón redondo equipado con un tabique.Añadir cuatro mililitros de diclorometano anhidro en el matraz bajo el argón. Agregue cuatro mililitros de ácido trifluoroacético en la agitación. Reemplace el tabique de silicio por una tapa de vidrio para evitar que TFA dañe el tabique de silicio.Revuelva la mezcla de reacción durante una hora a temperatura ambiente. Verifique la desprotección del Boc-PrK por TLC. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida.Añadir éter de dietil al residuo crudo. Filtrar el propargyl-L-lisina en forma de un sólido blanco sobre un vidrio frito. Disolver una alícuota de la propargyl-L-lisina en óxido de deuterio, luego llevar a cabo el análisis de RMN para controlar su identidad y pureza.Propargyl-L-lisina se disuelve en agua destilada a la concentración final de cien mililitros y se almacena a menos 20 grados en alícuotas de un mililitro. Para co-transformar plásmidos en la cepa de expresión, descongele un centenar de microlitros alícuotas de E. coli BL21 químicamente competente sobre hielo durante cinco minutos. Añadir un microlitro de cada plásmido o cincuenta a cien nanogramos de cada uno en las células e incubarlos durante 30 minutos en hielo.Incubar las células competentes a 42 grados, durante 45 segundos. Luego, ponlos de nuevo en hielo durante dos minutos. Añadir novecientos microlitros de LB medio e incubar bajo agitación durante una hora a 37 grados para permitir la expresión de antibióticos.A continuación, placar las bacterias transformadas en el agar LB con antibióticos. Permita que las bacterias crezcan durante la noche a 37 grados. Para expresar proteínas modificadas con PrK, inocular una sola colonia co-transformada en cinco mililitros de medio LB con antibióticos.Incubar durante la noche a 37 grados con temblores. Al día siguiente, diluir con los cinco mililitros de cultivo primario en quinientos mililitros de medio de auto-inducción que contienen antibióticos, 0.02% de L-arabinosa, y un milimolar de PrK e incubar a 37 grados durante 24 horas bajo temblor. Incluir un control negativo mediante la realización de la cultura sin PrK y el control positivo mediante la realización de la cultura de un clon que contiene el gen proteico de tipo salvaje.Cosecha las células del cultivo nocturno por centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a menos 20 grados. Para la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad de banco de flujo de gravedad, resuspendir los gránulos celulares en veinte mililitros de tampón de lelisis.Añadir DNase I y la lesozima, y permitir la lelisis incubando la suspensión a 37 grados durante 30 minutos. Sonicar las células en hielo durante cinco minutos, luego retirar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos. Filtrar el izado con filtro de 0,45 micrómetros Añadir resina Ni-NTA a la suspensión.Se mezcla suavemente a cuatro grados durante una hora. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno y recoja la fracción sin enlazar. Lavar la resina con diez mililitros y luego cinco mililitros de tampón de lavado.Recoger las fracciones de lavado. Eluir la proteína su-etiquetada con un milímetro de tampón de elución y repetir este paso cuatro veces y recoger todas las fracciones adicionales. Combine las fracciones que contienen proteínas puras etiquetadas con histidina y dialícela en un litro de tampón de proteasa TEV durante la noche mediante el uso de membrana de diálisis.Recoger la muestra de proteína en un tubo de 50 mililitros y añadir tampón TEV para obtener una concentración final de dos miligramos por mililitro en un volumen final de un mililitro. Añadir cien microlitros de TEV proteasa. Añadir 50 microlitros de 0,1 TDT molar.Completo con búfer TEV de hasta cinco mililitros. Incubar durante la noche a cuatro grados, con temblor lento. Para eliminar el EDTA, dializar la proteína a cuatro grados durante la noche mediante el uso de membrana de diálisis y tampón de fosfato con cinco imidazol mililolar.Para eliminar la proteasa del TEV y las proteínas no digeridos, incubar la mezcla con cuentas de Ni-NTA y mezclar suavemente durante una hora a cuatro grados. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Recolectó la fracción sin enlazar.La proteasa del TEV y las proteínas no digeridas permanecen unidas a las cuentas y la proteína digerida se elue. Lave la columna con cinco mililitros de tampón de lavado y recoja también las fracciones de lavado. Dialyze la proteína digerida contra un litro de tampón de clic a cuatro grados durante la noche con membrana de diálisis para eliminar el imidazol, así como para intercambiar el tampón.Y medir la concentración de la proteína a 280 nanómetros. Para conjugar el mPsaA con 6-hexacloro-fluoresceína-azida, o un antígeno de carbohidratos funcionalizado por antídoto, ponga la proteína mutada PrK a una concentración de 57,8 micromolares en un micro tube de dos mililitros. Añadir 10 microlitros de cinco compuestos de azida milimolar, luego añadir una premezcla de solución de sulfato de cobre y THPTA.Añadir clorhidrato de aminoguanidina. Añadir solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.Detenga la reacción añadiendo EDTA. Compruebe la conjugación en la página SDS. Después de la migración, visualice el gel sobre la luz UV a 312 nanómetros para el conjugado con fluoresceína.O tiñe el gel con Coomassie Blue para visualizar el conjugado con el antígeno de carbohidratos. Como adición del hapten debe inducir un cambio de peso molecular. Purificar el glucoconjugado aplicándolo en una columna de filtración de gel equilibrada con PBS.Recoger las fracciones que contienen los glucoconjugados. Para un almacenamiento prolongado, dializa el glucoconjugado contra el agua destilada, luego se seca y almacena el glucoconjugado a menos 80 grados. El PrK se ha introducido en la posición 32 en sustitución de una lisina cerca de la N-terminus de la PsaA.La eficacia de la producción de mPsaA ha sido comprobada por la página SDS y el análisis de Western blot utilizando anticuerpos antihistidina. La presencia de una proteína de longitud completa indica fuertemente la incorporación exitosa del PrK. La intensidad es, sin embargo, menor que la observada para mPsaA de tipo salvaje.El mPsaA(K32PrK) ha sido purificado en cuentas Ni-NTA. Con un rendimiento típico de ocho miligramos y la incorporación del residuo PrK fue finalmente confirmada por espectrometría de masas. La etiqueta de histidina se eliminó al escote proteolítico usando la proteasa TEV.Tener el mPsaA(K32PrK)la reactividad de la alquina se evaluó utilizando una fluoresceína azido-funcionalizada y se utilizó además para conjugar un antígeno sintético de oligosacárido. Los experimentos se realizaron en comparación con mPsaA de tipo salvaje como control. Finalmente, el glucoconjugate fue purificado por filtración de gel y su identidad confirmada por espectrometría de masas.En este proyecto, se han preparado vacunas homogéneas de glucoconjugado utilizando la tecnología de supresión de codón de parada de ámbar para incorporar un aminoácido no natural bajo sitios definidos. La homogeneidad de la vacuna glucoconjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa. Y así, satisfacer las recomendaciones cada vez más exigentes de las agencias de drogas.Este criterio no se cumple utilizando el método clásico de conjugación pura. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna contra el glucoconjugado. Dando lugar a una herramienta sin precedentes para estudiar la relación entre la homogeneidad y la estructura de un glucoconjugado.

Research

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