Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. erkänner tacksamt det ekonomiska stödet från La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique-programmet "BioSynProt"), i synnerhet ett doktorandstipendium till T.V. Vi erkänner också Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrike) för hans dyrbara tekniska råd.

1. Syntes av UAAEN: propargyl-lysin (PrK)
<ol><li>Syntes av Nα-Boc-propargyl-lysin18<ol>
<li>Lös 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) i en blandning av vattenhaltig 1 M NaOH (5 mL) och THF (5 mL) i en kolv och passa kolven med ett kiselsepum.</li>
		<li>Kyl kolven i ett isbad och tillsätt sedan 158 μL propargylkloroformat (1,62 mmol) droppvis (under en 2-3 min period) med hjälp av en mikrosyring under omrörning.</li>
		<li>Värm reaktionsblandningen till rumstemperatur och f...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Plats-riktad mutagenes är en enkel strategi för att införliva specifika aminosyror vid en definierad position av ett protein som förblir knappt används med syfte att förbereda glykokonjugat vacciner7,8,14. Klassisk mutagenes baserad på de 20 naturliga aminosyror strategi är mycket effektiv eftersom ingen ändring av översättningen maskiner krävs. Cystein mutationer är oftast riktade att ytterligare utforska den unika...

Glykokonjugatvaccin är väsentliga delar av vaccinarsenalen som finns för profylaktisk behandling av infektionssjukdomar. De är säkra, väl tolererade och effektiva i en bred åldersgrupp inklusive unga spädbarn. De ger det optimala försvaret mot infektioner orsakade av capsulated bakterier som meningokocker, pneumococcus eller Haemophilus influenzae typ b1. Glykokonjugatvaccin är tillverkade av renat bakteriella polysackarider som bildar kapslarna av bakterier eller syntetiska oligosackarider som efterliknar dessa yttexade polysackarider2, som är kovalent kopplade till ett bärarprotein. Förekomsten av ett bärare protein är avgörande för att främja skyddande humorala immunsvar riktade mot den antigena determinanten uttryckt av kolhydratanterna3. Bortsett från ett noggrant urval och produktion av kolhydratantigenen, är de funktioner som är kända för att utöva ett inflytande på effekten av ett glykopkonjugatvaccin: arten av bärarproteinet, konjugationskemin (inklusive arten och längden på länkaren om den används), eller saccharid-/proteinförhållandet3. Uppenbarligen är de positioner där sackarden är konjugerad till proteinet samt antalet anslutningspunkter relevanta för immunogenicitet. Hittills har dessa två parametrar knappast studerats eftersom beredningen av glykokonjugaterna förblir till stor del empirisk. Deras syntes bygger vanligtvis på användning av amin eller karboxylsyra funktioner av, respektive, lysin eller apartic / glutaminsyra side-chain rester som finns på bärare proteinsekvens. Detta leder inte till en enda utan till en heterogen blandning av glykokonjugat.
Att spela på reaktiviteten, tillgängligheten eller fördelningen av aminosyraresterna i proteinet ger upphov till mer definierade glykkonjugat som är mer tillförlitliga för att dokumentera effekten av saccharid/proteinanslutning4. Ett steg framåt mot detta mål kan uppnås genom att tillämpa protein glycan kopplingsteknik, en rekombinant process som möjliggör produktion av kontrollerade glykokonjugat vacciner i cell fabriker5,6. Glykosylering sker dock uteslutande vid en asparaginrester inom D/EXNYS/T sequons (varvid X är någon av de 20 naturliga aminosyrorna), inte naturligt närvarande på bärarproteinerna.
Site selektiv mutagenes och i synnerhet införlivande av cysteiner att utnyttja deras mycket och selektiv reaktivitet visas som ett alternativ7,8. Produktion av bärarproteiner som innehåller UAAs i deras sekvens kan erbjuda ännu mer flexibilitet för homogen glykolkonjugat vaccinpreparation. Mer än 100 UAAs har utvecklats och ytterligare införlivas i olika proteiner9,10. Många av dem innehåller bioorthogonal funktioner som vanligtvis används för att utföra efter translationella ändringar11 eller att ympa biofysiska sonder12 eller läkemedel13 men som är idealiska handtag för ytterligare konjugation med kolhydrater antigener. Framgångsrika exempel har hävdats av Biotech14 med hjälp av cellfriproteinsyntes 15 men beredning av glykokonjugat vacciner enligt denna strategi väntar fortfarande på att bli populariserade.
Tillämpning av in vivo-strategin för framställning av muterat bärarprotein behöver en modifierad translationell maskinpark som innefattar ett specifikt kodon, ett tRNA som känner igen kodon och en aminoacyl-tRNA-synthetase (aaRS) som specifikt katalyserar överföringen av UAA på tRNA (Figur 1)16. Den pyrrolysin bärnsten stop kodon dämpning är en av de mest använda metoderna för att införliva UAA, i synnerhet propargyl-lysin (PrK)17. Den senare kan i sin tur reagera med azido-functionalized kolhydrater haptens att ge fullt definierade, homogena glykokonjugat. I det föreliggande manuskriptet beskriver vi hur man syntetisera propargyl-L-lysin, en UAA som bär ett alkynehandtag, hur man införlivar det i ett målprotein under dess översättning i en bakterie och slutligen hur man utför konjugation mellan det modifierade proteinet och en hapten som bär en azidefunktion med hjälp av klickkemi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

Genetisk kodexpansion är ett kraftfullt verktyg för att introducera onaturliga aminosyror (UAA) i proteiner för att ändra sina egenskaper, att studera eller skapa nya proteinfunktioner eller för att få tillgång till proteinkonjuger. Stoppa kodondämpning, i synnerhet bärnstensfärgad kodondämpning, har dykt upp som den mest populära metoden för att genetiskt introducera UAAs vid definierade positioner. Denna metod är häri tillämpas på framställning av en bärare protein som innehåller en UAA hyser en bioorthogonal funktionell grupp. Detta reaktiva handtag kan nästa användas för att specifikt och effektivt ympa en syntetisk oligosackarid hapten för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin. Protokollet är begränsad till syntesen av glykokonjugat i en 1:1 kolhydrater hapten/carrier protein förhållandet men mottagliga för ett flertal par av biorthogonal funktionella grupper. Glycococonjugate vaccin homogenitet är ett viktigt kriterium för att säkerställa fullständig fysikalisk-kemisk karakterisering, därmed uppfyller fler och mer krävande läkemedel tillsynsmyndigheten rekommendationer, ett kriterium som inte uppfylls av klassisk konjugation strategier. Dessutom gör detta protokoll det möjligt att finjustera strukturen på det faktiska konjugatvaccinet, vilket ger upphov till verktyg för att ta itu med struktur-immunogenicitetsrelationer.

I detta projekt utarbetades ett homogent glykokonjugatvaccin med hjälp av strategin för amber stop kodon suppression för att införa en UAA på ett definierat ställe (Figur 1). Pneumoccocal yta adhesin A valdes som bäraren protein moiety. Detta protein är mycket bevaras och uttrycks av alla stammar av Streptococcus pneumoniae22. Det är mycket immunogena och tidigare använts som bärare i pneumokockvaccin formuleringar<...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetisk kodexpansion tillämpas för införande av en onaturlig aminosyra som bär en biortsfunktionell grupp på ett bärarprotein på ett definierat ställe. Biorthogonalfunktionen används vidare för den platsselektiva kopplingen av ett kolhydratantigen för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin.

Homogen glykokonjugat producerad av kombinerad onaturlig aminosyra inkorporering och Klicka-kemi för vaccin ändamål

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att producera en homogen glycoconjugate vaccin genom att kombinera icke-kanoniska aminosyra införlivande och klick-kemi. Genetisk kodexpansion är ett kraftfullt verktyg för att införliva onaturliga aminosyror i proteiner för att ändra sina egenskaper, att studera eller skapa nya proteinfunktioner, eller för att få tillgång till proteinkonjuger. En kodon suppression metod har uppstått som den mest populära metoden att införliva onaturliga aminosyror på olika positioner.Denna metodik kommer att vara här tillämpas på produktionen av ett protein bärare som innehåller en onaturlig aminosyra hyser en bioorthogonal funktionell grupp. Detta reaktiva handtag kan nästa användas för att specifikt och effektivt ympa en syntetisk oligosackarid hapten för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin. Den propargyl-lysin, PrK, syntetiseras i två steg från kommersiella Boc-lysin.I det första steget är den oskyddade aminogruppen av Boc-lysin konvertera till propargylkloroformat. I ett andra steg avskyddas alfa-aminogruppen. För att syntetisera N(alfa)Boc-propargyl-lysin, först lösa 500 milligram Boc-lysin i blandningen av fem milliliter vattenhaltiga en molar NaOH och fem milliliter THF i en kolv och passa kolven med en kisel septum.Kyl kolven i ett isbad och vänta tills pulvret är upplöst. Tillsätt sedan propargylklolorformate drop-vis under en två till tre minuter period under omrörning. Värm reaktionsblandningen i rumstemperatur och fortsätt omrörningen i 10 timmar.Kyl ner lösningar av diethyl eter, vattenhaltiga en molar saltsyra, och etylacetat. Kyl ner den råa reaktionsblandningen i ett isbad. Häll blandningen i en separertratt.Extrahera en blandning med femtio milliliter av diethyleter. Utvinning kan resultera i en ansamling av tryck, se till att du släpper något tryck uppbyggd ofta. Samla den vattenhaltiga fasen och kasta det organiska lagret.Tillsätt försiktigt, femtio milliliter av en molar saltsyra till vattenfasen i separertratten. Sedan, extrahera vattenskiktet två gånger med hjälp av trettio milliliter av etylacetat. Samla den organiska fasen, Verifiera förekomsten av din förening genom TLC.I detta skede bör det vara i den organiska fasen. Torka de kombinerade organiska lagren över magnesiumsulfat. Filtrera bort den fasta fasen.Och koncentrera filtratet under minskat tryck på en roterande förångare. Lös upp prov av den råoljeolja N(alfa)Boc-propargyl-lysin i deutererad kloroform och kontrollera dess identitet genom NMR. För att syntetisera propargyl-L-lysin, introducerar du N(alfa)Boc-propargyl-lysin i en rund knappkolv utrustad med ett septum.Tillsätt fyra milliliter vattenfritt diklormetan i kolven under argon. Tillsätt droppvis, fyra milliliter av trifluoroättiksyra under omrörning. Byt ut kiselskildummen mot ett glaslock för att undvika att TFA skadar kiselskildummen.Rör om reaktionsblandningen i en timme i rumstemperatur. Verifiera avskyddet av Boc-PrK genom TLC. Koncentrera reaktionsblandningen under minskat tryck.Tillsätt diethyleter till råresterna. Filtrera propargyl-L-lysin i form av en vit fast på en fritted-glas. Lös upp en alikvot av propargyl-L-lysin i deuteriumoxid, utför sedan NMR-analys för att kontrollera dess identitet och renhet.Propargyl-L-lysin löses sedan i destillerat vatten vid slutkoncentrationen av hundra millimolar och lagras i minus 20 grader i en milliliter alikvoter. För att samtransforma plasmider till uttrycksstammen tinas ett hundratal mikroliter alikvoter av kemiskt kompetent E.Coli BL21 på is under fem minuter. Tillsätt en mikroliter av varje plasmid eller femtio till hundra nanogram av varje i cellerna och inkubera dem i 30 minuter på is.Inkubera de kompetenta cellerna i 42 grader, under 45 sekunder. Sedan lägger du tillbaka dem på is i två minuter. Tillsätt nio hundra mikroliter lb medium och inkubera under skakning i en timme vid 37 grader för att tillåta antibiotika uttryck.Sedan platta de transformerade bakterierna på LB agar med antibiotika. Låt bakterier att växa över natten vid 37 grader. För att uttrycka proteiner modifierade med PrK, inokulera en enda co-transformed koloni i fem milliliter lb medium med antibiotika.Inkubera över natten vid 37 grader med skakningar. Nästa dag, späd med de fem milliliter primärkultur i fem hundra milliliter av auto-induktion medium som innehåller antibiotika, 0,02%av L-arabinose, och en millimolar av PrK och inkubera på 37 grader i 24 timmar under skakning. Inkludera en negativ kontroll genom att utföra kulturen utan PrK och den positiva kontrollen genom att utföra kulturen hos en klon som innehåller proteingenen av vildtyp.Skörda celler från övernattningskulturen genom centrifugering vid 5, 000 x g under 10 minuter. Kassera supernatanten och frys pelleten vid minus 20 grader. För rening av proteinet genom gravitation flöde-bänk affinitet kromatografi, resuspend cellen pellets i tjugo milliliter av lysbuffert.Lägg DNase I och lysozym, och tillåta lys genom att inkubera suspensionen vid 37 grader under 30 minuter. Sonikera cellerna i is under fem minuter, sedan ta bort cellen skräp genom centrifugeringen vid 20, 000 x g under 30 minuter. Filtrate lysate med 0,45 mikrometer filter Lägg till Ni-NTA harts till suspensionen.Blandas försiktigt vid fyra grader i en timme. Häll suspensionen i en polypropenkolonn och samla upp den obundna fraktionen. Tvätta hartset med tio milliliter och sedan fem milliliter tvättbuffert.Samla tvättfraktionerna. Elute den Hans-taggade protein med en millimeter ellution buffert och upprepa detta steg fyra gånger och samla alla ytterligare fraktioner. Kombinera de fraktioner som innehåller rena histidin-taggade proteiner och dialys det till en liter TEV proteas buffert över natten med hjälp av dialys membran.Samla in proteinprovet i ett 50 milliliterrör och tillsätt TEV-buffert för att få en slutlig koncentration på två milligram per milliliter i en slutvolym på en milliliter. Tillsätt hundra mikroliter av TEV proteas. Tillsätt 50 mikroliter på 0,1 molar DTT.Komplett med TEV-buffert upp till fem milliliter. Inkubera över natten vid fyra grader, med långsam skakning. För att avlägsna EDTA, dialysa proteinet vid fyra grader över natten med hjälp av dialysmembran och fosfatbuffert med fem millimolar imidazol.För att eliminera TEV-proteas och osmälta proteiner, inkubera blandningen med Ni-NTA-pärlor och blanda försiktigt i en timme vid fyra grader. Häll suspensionen i en polypropenkolonn. Samlade ihop den obundna fraktionen.TEV proteas och osmälta proteiner stannar bundna till pärlorna och det smälta proteinet eluteras. Tvätta kolonnen med fem milliliter av tvättbuffert och samla tvättfraktionerna också. Dialyze det rötade proteinet mot en liter klickbuffert vid fyra grader över natten med dialysmembran för att ta bort imidazol samt för att utbyta bufferten.Och mäta koncentrationen av proteinet vid 280 nanometer. För att konjuga mPsaA med 6-hexaklore-fluorescein-azid, eller ett antidofunktionaliserat kolhydratantigen, sätt Det PrK-muterade proteinet vid en koncentration av 57,8 mikromolar i ett två millilitermikrorör. Tillsätt 10 mikroliter av fem millimolar azide förening, tillsätt sedan en pre-mix av kopparsulfat lösning och THPTA.Tillsätt aminoguanidinhydroklorid. Lägg extempore beredd vattenlösning av natriumaskorbat. Stäng röret, blanda genom att invertera flera gånger och inkubera i rumstemperatur i två timmar.Stoppa reaktionen genom att lägga till EDTA. Kontrollera konjugationen på SDS-sida. Efter migreringen visualiserar du gelen på UV-ljus vid 312 nanometer för konjugatet med fluorescein.Eller fläck gel med Coomassie Blue för att visualisera konjugate med kolhydratantigenen. Som tillägg av haptenen bör framkalla en ändring av molekylär vikt. Rena glykokonjugaten genom att applicera den på en gel-filtreringskolumn ekvilovillig med PBS.Samla in de fraktioner som innehåller glykokonjugaterna. För långvarig lagring, dialyze glykokonjugat mot destillerat vatten, sedan frystorka och lagra glykokonjugate på minus 80 grader. PrK har införts på position 32 i utbyte av ett lysin nära N-ändstationen i PsaA.Effekten av mPsaA produktionen har kontrollerats av SDS sida och Western blot analys med hjälp av anti-Histidin tag antikropp. Närvaroen av ett full längdprotein indikerar starkt det lyckade inkorporering av PrKEN. Intensiteten är dock lägre än den som observerats för vildtypspsaA.MPsaA(K32PrK)har renats på Ni-NTA pärlor. Med en typisk avkastning på åtta milligram och införlivandet av PrK-rester bekräftades slutligen av masspektrometri. Histidin taggen togs bort på proteolytisk klyvning med hjälp av TEV proteas.Med mPsaA(K32PrK)reaktiviteten hos alkyne bedömdes med hjälp av en azido-functionalized fluorescein och vidare används för att konjugera en syntetisk oligosackarid antigen. Experiment gjordes i jämförelse med vild-typ mPsaA som en kontroll. Slutligen, den glykokonjugate renades genom gel filtrering och dess identitet bekräftas av masspektrometri.I detta projekt har homogena glykokonjugatvacciner utarbetats med hjälp av tekniken för amber stop kodondämpning för att införliva en onaturlig aminosyra under definierade platser. Glykokonjugera vaccin homogenitet är ett viktigt kriterium för att säkerställa fullständig fysikalisk-kemiska karakterisering. Och därmed, tillfredsställande mer och mer krävande läkemedelsmyndigheten rekommendationer.Detta kriterium är inte uppfyllt genom att använda den klassiska renkonjugationsmetoden. Dessutom gör detta protokoll det möjligt att finjustera strukturen av glykokonjugatvaccinet. Att ge upphov till ett verktyg utan motstycke för att studera sambandet mellan homogeniteten och strukturen hos ett glykokonjugat.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatueringar som ett nytt sätt för DNA-vaccin Leverans

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Beredning av Light-responsiva Membran av en Kombinerad Surface Ympning och Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Tillverkning av en funktionaliserad Magnetic bakteriell Nanocellulosa med järnoxid nanopartiklar

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utveckling av en multicellulär Tredimensionell Organotypiska modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlade under mikrogravitation

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Webbplats-regisserad immobilisering av benmorfogent Protein 2 till fasta ytor genom att klicka på kemi

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescens vid selektionstryck inkorporering av icke-kanoniska aminosyror och proteinanalys av masspektrometri och fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Lokalt av primära nedsatt vävnad segment och inkorporering med romanen byggnadsställning-fri konstruktion teknik

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobiella peptider produceras av selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...