Name: homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

E.C. minnetle La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Programı "BioSynProt"), özellikle t.V. bir doktora bursu mali destek kabul eder. Biz de Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Fransa) onun değerli teknik tavsiyeler için kabul.

1. UAA sentezi: propargyl-lizin (PrK)
<ol><li>N αsentezi -Boc-propargyl-lizin18<ol>
<li>500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) sulu 1 M NaOH (5 mL) ve THF (5 mL) karışımını bir şişede çözün ve şişeyi silikon septumla sığdırın.</li>
		<li>Bir buz banyosunda şişeyi soğutun ve karıştırırken mikroşiniş kullanarak 158 μL propargyl kloroformate (1,62 mmol) damla (2-3 dk'lık bir süre içinde) ekleyin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına Kad...

<ol>
	<li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoconjugate+vaccines:+Principles+and+mechanisms.">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li><li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b.">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li><li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines:+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification.">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li><li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines.">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li><li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines.">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).</li><li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine.">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li><li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates.">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li><li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation.">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li><li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function.">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li><li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology.">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li><li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies.">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2:+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids.">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li><li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate.">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li><li>. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: <a target="_blank" href="https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)">https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&amp;recNum=65&amp;docAn=15859251&amp;queryString=(GBS)</a> (2018)</li><li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis.">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li><li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals:+Biological+Considerations+and+Impacts.">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li><li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression:+Development+and+Applications.">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li><li>. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction</a> (2019)</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation.">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein/PsaA+as+a+pneumococcal+vaccine.">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li><li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis.">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li><li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+(PsaA)+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae.">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li><li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14.">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry &amp; Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein.">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li><li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins.">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li><li>Dadov&#225;, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine.">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li><li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System.">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li><li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation.">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li></ol>

Site yönelimli mutagenez ancak glikokonjugate aşıları hazırlamak amacıyla kullanılan kalır bir protein tanımlı bir konumda belirli amino asitler dahil etmek için basit bir stratejidir7,8,14. 20 doğal amino asit yaklaşımına dayalı klasik mutagenez, çeviri makinelerinde herhangi bir değişiklik gerektirmediğinden son derece etkilidir. Sistein mutasyonları genellikle daha doğrudan ya da iki adımda benzersiz ti...

Glikokonjugate aşıları, bulaşıcı hastalıkların profilaktik tedavisinde mevcut olan aşı cephaneliğinin temel unsurlarıdır. Onlar güvenli, iyi tolere ve genç bebekler de dahil olmak üzere geniş bir yaş grubunda verimli. Meningokok, pnömokok veya Haemophilus influenzae tip b1gibi kapsüllü bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlara karşı en iyi savunmayı sağlarlar. Glycococonjugate aşılar bakteri kapsülleri oluşturan saflaştırılmış bakteriyel polisakkaritler veya bu yüzey ifade li polisakkaritler taklit sentetik oligosakkaritler yapılır2, kovalent bir taşıyıcı protein ebağlı. Bir taşıyıcı protein varlığı karbonhidrat antijenleri tarafından ifade antijenik determinant karşı yönlendirilen koruyucu humoral bağışıklık yanıtları teşvik etmek esastır3. Karbonhidrat antijeninin dikkatli bir seçimi ve üretimi dışında, glikokonjugate aşısının etkinliği üzerinde etkili olduğu bilinen özellikler şunlardır: taşıyıcı proteinin doğası, konjugasyon kimyası (kullanılırsa bağlayıcının doğası ve uzunluğu dahil) veya sakkarit/protein oranı3. Açıkçası, sakkarit proteine konjuge pozisyonları yanı sıra bağlantı noktalarının sayısı immünjenite için ilgilidir. Glikokonjugates hazırlanması büyük ölçüde ampirik kalır, çünkü bugüne kadar, bu iki parametre pek çalışılmıştır. Sentezleri genellikle taşıyıcı protein dizisinde bulunan lizin veya aspartik/glutamik asit yan zincir kalıntılarının amin veya karboksilik asit fonksiyonlarının kullanımına dayanır. Bu tek bir değil, glikokonjugates heterojen bir karışıma yol açar.
Proteindeki amino asit kalıntılarının reaktivitesi, erişilebilirliği veya dağılımı üzerinde oynamak, sakkarit/protein bağlantısının etkisini belgelemek için daha güvenilir olan daha tanımlı glikokonjugates'e yol açar4. Bu hedefe doğru bir adım protein glikan kaplin teknolojisi, hücre fabrikalarında kontrollü glikokonkonjugate aşıların üretimine olanak sağlayan bir rekombinant süreci uygulayarak elde edilebilir5,6. Ancak, glikozilasyon sadece D /EXNYS/T sequons içinde bir asparagin kalıntısı yer alır (x herhangi bir olduğu gibi 20 doğal amino asitler, doğal taşıyıcı proteinler üzerinde mevcut değildir.
Site seçici mutagenez ve sistein özellikle dahil onların yüksek ve seçici reaktivite yararlanmak için alternatif olarak görünür7,8. Kendi sıralarına UAA'ları içeren taşıyıcı proteinlerin üretimi homojen glikokonleklek aşı hazırlanması için daha fazla esneklik sunabilir. 100'den fazla UAA geliştirilmişve daha çeşitli proteinler9,10dahil edilmiştir. Birçoğu genellikle post translational modifikasyonlar11 veya aşılamak için kullanılan biyoortogonal fonksiyonlar içerir12 veya ilaçlar13 ama karbonhidrat antijenleri ile daha fazla konjugasyon için ideal kolları vardır. Başarılı örnekler Biotech14 tarafından hücresiz protein sentezi15 kullanılarak iddia edilmiştir ancak bu stratejiye göre glikokonjugate aşıların hazırlanması hala popüler hale gelmesini beklemaktadır.
Mutasyona uğramış taşıyıcı protein üretimi için in vivo stratejisinin uygulanması belirli bir kodon içeren değiştirilmiş bir çeviri makine ihtiyacı, kodonu tanıyan bir tRNA ve özellikle tRNA üzerinde UAA transferi katalizler bir aminoasil-tRNA synthetase (aaRS) (Şekil 1)16. Pyrrolysine kehribar stop kodon bastırma uaa dahil etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir, özellikle propargyl-lizin (PrK)17. İkincisi sırayla tam tanımlanmış, homojen glycococonjugates sağlamak için azido fonksiyonel karbonhidrat haptens ile reaksiyona olabilir. Bu el yazmasında, alkin sapı taşıyan bir UAA olan propargyl-L-lizinin nasıl sentezleneceğini, bir bakterinin çevirisi sırasında hedef proteine nasıl dahil edilebildiğini ve son olarak da modifiye edilmiş protein ile tıklama kimyası kullanan bir azit fonksiyonu taşıyan hapten arasında çekimin nasıl yapılacağını anlatıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AIM (autoinductif medium)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AIMLB0210</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Lys-OH</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>H63859</td>
			<td>Solid powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)</td>
			<td>Merck Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &#955;(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&#955;S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Machery Nagel</td>
			<td>Protino</td>
			<td>Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall centrifugal device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET24d-mPsaA-WT</td>
			<td>this study</td>
			<td></td>
			<td>pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL plasmid</td>
			<td>gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)</td>
			<td></td>
			<td>plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl chloroformate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>460923</td>
			<td>Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB120-220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous glycoconjugate produced by combined unnatural amino acid incorporation and click-chemistry for vaccine purposes

Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri (UAA) proteinlerin özelliklerini değiştirmek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için tanıtmak için güçlü bir araçtır. Stop kodon bastırma, özellikle kehribar kodon bastırma, genetik olarak tanımlanmış pozisyonlarda BA'ları tanıtmak için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran bir UAA içeren bir taşıyıcı protein hazırlanması için uygulanır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Protokol 1:1 karbonhidrat hapten/taşıyıcı protein oranında glikokonjugates sentezi ile sınırlıdır ancak biorthogonal fonksiyonel grupların çok sayıda çiftleri için münasiptir. Glycococonjugate aşı homojenliği tam fizyo-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir, bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu ilaç düzenleyici kurum önerileri tatmin, klasik konjugasyon stratejileri ile karşılanmayan bir kriter. Ayrıca, bu protokol, yapı-immünojenite ilişkilerine yönelik araçlar ortaya çıkararak, gerçek eşleç aşının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır.

Bu projede, tanımlanmış bir bölgede UAA tanıtmak için kehribar stop kodon bastırma stratejisi kullanılarak homojen bir glikonkonjuge aşı hazırlanmıştır(Şekil 1). Pnömokok alhesin A taşıyıcı protein moiety olarak seçildi. Bu protein son derece korunmuş ve Streptococcus pneumoniaetüm suşları ile ifade22. Bu son derece immünojenik ve daha önce pnöyokok aşı formülasyonları21,...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes at JoVE.com

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bu işlemin genel amacı, kanonik olmayan amino asit birleşme ve tıklama kimyasını birleştirerek homojen bir glikokonlektolekaşı aşısı üretmektir. Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri proteinlerin özelliklerine dahil ederek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için güçlü bir araçtır. Bir kodon bastırma yöntemi farklı pozisyonlarda doğal olmayan amino asitler dahil etmek için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır.Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran doğal olmayan bir amino asit içeren bir protein taşıyıcı üretimi için uygulanacaktır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Propargyl-lizin, PrK, ticari Boc-lizin iki adımda sentezlenir.İlk adımda, Boc-lizin korunmasız amino grubu propargyl kloroformate dönüştürülür. İkinci adımda, alfa amino grubu korumasızdır. N(alfa)Boc-propargyl-lizin sentezlemek için, ilk bir şişe sulu bir molar NaOH beş mililitre karışımı Boc-lizin 500 miligram eritmek ve bir şişe içinde THF beş mililitre ve silikon septum ile şişe uygun.Şişeyi buz banyosunda soğutun ve tozun çözülmesini bekleyin. Sonra karıştırma altında 2-3 dakikalık bir süre içinde propargyl kloroformate damla-bilge ekleyin. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında ısıtın ve karıştırmaya 10 saat devam edin.Diethyl eter, sulu bir molar hidroklorik asit ve etil asetat çözeltileri soğutun. Bir buz banyosunda ham reaksiyon karışımı nı soğutun. Karışımı ayıran bir huniye dökün.Diethyl eter elli mililitre ile bir karışım ayıklayın. Çıkarma basınç birikmesi neden olabilir, sık sık herhangi bir basınç birikimi serbest emin olun. Sulu faz toplamak ve organik tabaka atın.Ayırma hunisindeki sulu faza dikkatli bir şekilde, bir azı dişi hidroklorik asitelli mililitre ekleyin. Sonra, etil asetat otuz mililitre kullanarak iki kez sulu tabaka ayıklayın. Organik faz toplamak, TLC ile bileşik varlığını doğrulayın.Bu aşamada, organik fazda olmalıdır. Magnezyum sülfat üzerinde kombine organik katmanları kurulayın. Katı fazdan süzün.Ve bir döner evaporatör üzerinde azaltılmış basınç altında filtrasyon konsantre. Ham yağlı N(alfa)Boc-propargyl-lizin örneğini deuterated kloroform içinde çözünve nmr tarafından kimliğini kontrol. Propargyl-L-lizin sentezlemek için, bir septum ile donatılmış yuvarlak bir düğme şişesi nde N(alfa)Boc-propargyl-lizin tanıtın.Argon altında şişe içine dört mililitre susuz diklorotan ekleyin. Karıştırma altında damla-bilge, trifloroasetik asit dört mililitre ekleyin. TFA'nın silikon septuma zarar vermesini önlemek için cam kapak için silikon septumu değiştirin.Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Boc-PrK'nın TLC tarafından korunmasını doğrulayın. Reaksiyon karışımını azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın.Ham kalıntıya dietil eter ekleyin. Propargyl-L-lizin'i, fritted-glass üzerinde beyaz bir katı şeklinde filtreleyin. Döteryum oksit propargyl-L-lizin bir aliquot eritin, sonra kimliğini ve saflığını kontrol etmek için NMR analizi yürütmek.Propargyl-L-lizin sonra yüz milimolar son konsantrasyonda distile suda çözülür ve eksi 20 derece bir mililitre aliquots saklanır. Plazmidleri ifade süzmesine dönüştürmek için, kimyasal olarak yetkin E.Coli BL21'in yüz mikrolitrelik aliquot'unun beş dakika boyunca buz üzerinde çözülmesi. Hücrelere her plazmid veya elli yüz nanogram bir mikrolitre ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçka.Yetkili hücreleri 42 derecede, 45 saniye boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra, iki dakika buza geri koyun. Antibiyotiklerifade sağlamak için 37 derece bir saat sallayarak altında LB orta ve inkübat dokuz yüz mikrolitre ekleyin.Sonra antibiyotik ile LB agar üzerinde dönüştürülmüş bakteri plaka. Bakterilerin bir gecede 37 derecede büyümesine izin verin. PrK ile modifiye proteinleri ifade etmek için, antibiyotikler ile LB orta beş mililitre tek bir co-dönüştürülmüş koloni aşılamak.Bir gecede 37 derecede sallayarak kuluçkaya yat. Ertesi gün, antibiyotik içeren otomatik indüksiyon aracı beş yüz mililitre birincil kültürün beş mililitre ile seyreltmek, L-arabinose% 0.02, ve PrK bir milimolar ve 37 derece sallayarak altında 24 saat boyunca kuluçka. Yabani tip protein geni içeren bir klonun kültürünü gerçekleştirerek PrK olmadan kültürü ve pozitif kontrolü gerçekleştirerek negatif kontrol ekleyin.10 dakika boyunca 5, 000 x g santrifüj ile gece kültüründen hasat hücreleri. Supernatant atın ve eksi 20 derece pelet dondurun. Proteinin yerçekimi akış-tezgah afiyeti kromatografisi ile saflaştırılması için hücre peletlerini yirmi mililitre likis tamponuna dönüştürün.DNase I ve lysozyme ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece süspansiyon kuluçka tarafından lysis izin verin. Beş dakika boyunca buzdaki hücreleri sonicate, sonra 30 dakika boyunca 20, 000 x g santrifüj ile hücre enkaz kaldırın. 0,45 mikrometre filtre ile lytrate süspansiyon için Ni-NTA rezorna ekleyin.Bir saat boyunca dört derecede hafifçe karıştırılır. Bir polipropilen sütuniçine süspansiyon dökün ve bağlanmamış fraksiyonu toplamak. Rekarnı on mililitre ve ardından beş mililitre yıkama tamponuile yıkayın.Yıkama kesirlerini toplayın. Bir milimetre lik elüsyon tamponu ile His-tagged protein elute ve bu adımı dört kez tekrarlayın ve tüm ek kesirleri toplamak. Saf histidin etiketli proteinler içeren fraksiyonları birleştirin ve diyaliz membran kullanarak bir gecede TEV proteaz tampon bir litre içine diyaliz.Protein örneğini 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve bir mililitrenin son hacminde mililitre başına iki miligramlık son konsantrasyonelde etmek için TEV tamponu ekleyin. TEV proteaz yüz mikrolitre ekleyin. 0.1 molar DTT 50 mikrolitre ekleyin.Beş mililitreye kadar TEV tamponu ile tamamlayın. Bir gecede dört derece kuluçka, yavaş sallayarak. EDTA kaldırmak için, beş milimolar imidazol ile diyaliz membran ve fosfat tampon kullanarak bir gecede dört derece protein diyaliz.TEV proteaz ve sindirilmemiş proteinleri ortadan kaldırmak için, Ni-NTA boncukile karışımı kuluçkaya yatırın ve dört derecede bir saat hafifçe karıştırın. Süspansiyonu polipropilen kolona dökün. Bağlanmamış kesir toplandı.TEV proteaz ve sindirilmemiş proteinler boncuklara bağlı kalır ve sindirilmiş protein eluted. Beş mililitre yıkama tamponu ile sütunyı yıkayın ve yıkama kesirlerini de toplayın. Diyaliz membranı ile bir gecede dört derece tıklama tampon bir litre karşı sindirilmiş protein diyaliz yanı sıra tampon değişimi için imidazol kaldırmak için.Ve proteinin konsantrasyonunu 280 nanometre de ölçün. 6-hexachloro-fluorescein-azide veya bir panzehir-fonksiyonel karbonhidrat antijeni ile mPsAA eşleştirmek için, iki mililitrelik mikro tüp içine 57.8 mikromolar konsantrasyonda PrK mutasyona uğramış protein koymak. Beş milimolar azit bileşik 10 mikrolitre ekleyin, sonra bakır sülfat çözeltisi ve THPTA bir ön karışımı ekleyin.Aminoguanidin hidroklorür ekleyin. Sodyum askorbat extemporaneously hazırlanmış sulu çözelti ekleyin. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun. SDS sayfasındaki çekimi kontrol edin. Göçten sonra, floresan ile eşlekap için 312 nanometre UV ışığı üzerinde jel görselleştirin.Veya karbonhidrat antijeni ile eşlenik görselleştirmek için Coomassie Mavi ile jel leke. Hapten eklenmesi olarak moleküler ağırlık bir değişiklik neden olmalıdır. Glikokonjugate PBS ile dengede bir jel filtrasyon sütununa uygulayarak arındırın.Glikokonjugates içeren kesirleri toplayın. Uzun süreli depolama için, distile suya karşı glikokonjugate diyaliz, sonra dondurularak kuru ve eksi 80 derece glikokonjugate saklayın. PrK, PsaA'nın N-terminusu yakınlarındaki bir lizin yerine 32.MPsaA üretiminin etkinliği Anti-Histidin etiket antikor kullanılarak SDS sayfası ve Batı leke analizi ile kontrol edilmiştir. Tam uzunlukta bir proteinin varlığı PrK'nın başarılı bir şekilde birleştirilmesine işaret eder. Yoğunluğu, ancak, yabani tip milletvekilleri için gözlenen daha düşüktür.Milletvekilleri Ni-NTA boncuklar üzerinde saflaştırılmıştır.). Sekiz miligram tipik bir verim ve PrK kalıntısı dahil nihayet kütle spektrometresi tarafından doğrulandı. Histidin etiketi TEV proteaz kullanılarak proteolitik dekolte üzerine kaldırıldı.MPsaA(K32PrK) alkine reaktivitesi azido-fonksiyonel floresan kullanılarak değerlendirildi ve sentetik oligosakkarit antijeni konjuvet için kullanıldı. Kontrol olarak vahşi tip milletvekilleriile karşılaştırıldığında deneyler yapılmıştır. Son olarak, glikokonjugate jel filtrasyon ve kitle spektrometresi tarafından doğrulandı kimliği ile saflaştırılmış oldu.Bu projede, homojen glikokonkonjuge aşılar tanımlanan siteler altında doğal olmayan bir amino asit dahil etmek için amber stop kodon bastırma teknolojisi kullanılarak hazırlanmıştır. Glikokonjugate aşı homojenliği tam fiziko-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir. Ve bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu uyuşturucu ajansı önerileri tatmin edici.Bu ölçüt klasik saf çekim yöntemi kullanılarak tatmin edilmez. Ayrıca, bu protokol glikokonjugate aşısının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır. Homojenlik ve glikokonjugate yapısı arasındaki ilişkiyi incelemek için benzeri görülmemiş bir araç doğurarak.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Biyomühendislik

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Bir Kombine Yüzey Tırnak ve Postmodification Süreci Işık duyarlı Membranların Hazırlanması

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...