Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل IF/01227/2015 وUID/BIM/50005/2019، projeto financiado بيلا فونداساو بارا سيينسيا إي تكنولوغيا (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017، F.F.R. (IMM/CT/35-2018)، D.M.L. (PD/BD/141784/2018)، وR.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) حصلت على زمالة من FCT. يود المؤلفان أن يشكرا أعضاء مرفق التصوير الحيوي في معهد ميديسينا الجزيئي جواو لوبو أنتونز على المساعدة في الفحص المجهري.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

في النظم المختبرية من NSPCs تسمح فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية، والتي يمكن التحقق من صحتها في الجسم الحي. وكالة الأمن القومي هي طريقة قوية جدا لمحاكاة الظروف الفسيولوجية بسبب هيكلها ثلاثي الأبعاد. وعلاوة على ذلك، هذا النظام الثقافي هو أيضا أسهل من الناحية الفنية للثقافة10، بالمقارنة مع غيرها من النظم في المختبر مثل نظام ثقافة أحادية الطبقات. في الواقع ، مع وكالة الأمن القومي ، من السهل التحكم في الإشارات الخارجية المكشوفة أثناء تطور الخلايا ، إما أثناء التوسع أو مرحلة التمايز ، عن طريق إضافة كميات دقيقة ومتغيرة من العوامل التي تهم وسائل الإعلام وكذلك عن طريق زراعة الخلايا العصبية مع أنواع الخلايا الأخرى6. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الثقافات أحادية الطبقة، في وكالة الأمن القومي، فمن الممكن الحصول على كثافة أعلى الخلية من كمية صغيرة من الأنسجة أو مع عدد قليل من الخلايا، مما يسمح بإجراء دراسات موازية، وبالتالي تقليل عدد الحيوانات1.
وكالة الأمن القومي هي الطريقة الأكثر شيوعا لعزل وتوسيع NSCs11،12،13، يمكن استخدامها لتقدير عدد الخلايا السلائف الموجودة في عينة نسيج معين5 وتردد الخلايا السليفة بين الظروف المختلفة. ومع ذلك، كل من الثقافات العصبية والثقافات أحادية الطبقات لا تأخذ في الاعتبار لnSCs التكويسين14. وعلاوة على ذلك، فإن وكالة الأمن القومي لديها بعض القيود11،,12،,13 ويعتمد تردد الغلاف العصبي الناتج على العديد من العوامل بما في ذلك المكونات المتوسطة، وإجراءات التشريح، وعملية التفكك11،,12،,13،وتجميع الغلاف العصبي5. والواقع أن المجالات العصبية تميل إلى التجميع في ثقافة عالية الكثافة. وبالتالي، يجب توخي الحذر عند تقدير عدد الخلايا السليفة في العينة. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، يمكن أيضا توسيع NSPCs معزولة ومرورها في أحادية5،15. والأهم من ذلك، استخدام وكالة الأمن القومي لمقارنة تردد الخلايا السليفة بين ظروف مختلفة مفيد جدا ودقيق لأن كل هذه القيود ضمنية ومتشابهة بين جميع الشروط التي أجريت في نفس التجربة.
هناك خطوات حاسمة في ثقافة الغلاف العصبي التي تحتاج إلى الاهتمام. في خطوة حصاد الدماغ ، والإزالة الكاملة للmeninges والعزلة الجيدة للمحاريب العصبية ضرورية لتحقيق أقصى قدر من نقاء وغلة NSPCs. أثناء انفصال الأنسجة ، بسبب النشاط البروتيني للتريبسين ، يمكن أن يؤدي الاستخدام المفرط للتريبسين أو أوقات الحضانة الأطول إلى التحلل الخلوي. وعلاوة على ذلك، فإن يوم المرور أمر بالغ الأهمية للحصول على سكان أصحاء من الاعصاب. الممرات العصبية مع قطر أعلى من 200 ميكرون يؤثر بشكل كبير على قدرة البقاء، التكاثرية والتفريقية من NSPCs. والأهم من ذلك، دورات أطول من الممرات، أكثر من 10 يمكن أن تزيد من عدم الاستقرار الوراثي6. وعلاوة على ذلك، طلاء مع PDL وPLD / laminin لخلايا SVZ وDG، على التوالي، أمر ضروري لضمان هجرة الخلايا جيدة من الخلايا العصبية دون المساس بعملية التمايز. من حيث تحليل الكيمياء المناعية ، يمكن لأوقات الحضانة الأطول مع PFA أن تعرض تلطيخًا للخطر عن طريق إخفاء المستضدات وزيادة الخلفية.
وكالة الأمن القومي هي أداة قوية لتوفير مصدر ثابت وغير محدود من NSPCs للدراسات المختبرية للتنمية العصبية والتمايز وكذلك للأغراض العلاجية16،17. في الواقع، يمكن تطبيق هذا القول على النماذج الوراثية والسلوكية لمزيد من فهم الآليات الجزيئية والخلوية التي ينطوي عليها انتشار NSPC والتمايز18,19. هذا المقاهى مفيد أيضا لاختبار مختلف الأدوية والمركبات20،21،22 وكذلك لتنفيذ التلاعب الجيني19،23 لتعديل خصائص NSC. بالإضافة إلى الكيمياء المناعية، يمكن إجراء تفاعل سلسلة البوليميراز النسخ العكسي وتحليل لطخة الغربية للوصول إلى الحمض النووي الريبي والتعبير البروتيني، في حين يمكن استخدام الدراسات الكهروفيزيولوجية والتصوير الكالسيوم لتقييم وظيفة الخلايا العصبية المولودة حديثا21.

وصف أولاً في عام 19921,2 ولا يزال أداة فريدة وقوية في أبحاث الخلايا الجذعية العصبية (NSC). عزل NSCs من المناطق العصبية الرئيسية لديه قضايا صعبة لأن متطلبات الحفاظ على هذه الخلايا في الظروف الفسيولوجية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. في وكالة الأمن القومي، يتم استزراع الخلايا في وسط خال من المصل كيميائيا مع وجود عوامل النمو بما في ذلك عامل نمو البشرة (EGF) وعامل النمو الليفي الأساسي (bFGF)1،2،3. يتم اختيار الخلايا السلائف العصبية (الجذعية والسلف) باستخدام هذه الخلايا الميتومية لأن هذه الخلايا هي EGF وFGF استجابة دخول فترة من الانتشار النشط في حين أن الخلايا الأخرى، وهي خلايا متباينة، يموت4. تنمو الخلايا السلائف العصبية ككرة عصبية ، والتي يمكن تمريرها بعد ذلك لزيادة توسيع بركة هذه الخلايا5. الأهم من ذلك، لأن هذه الخلايا السلف الجذعية العصبية (NSPCs) هي متعددة القدرات أنها قادرة على التفريق في ثلاثة أنواع الخلايا الرئيسية للجهاز العصبي المركزي (CNS): الخلايا العصبية، oligodendrocytes والخلايا الفلكية5.
توفر وكالة الأمن القومي مصدرًا متجددًا لسلائف الجهاز العصبي المركزي غير المتمايزة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة العديد من العمليات بما في ذلك انتشار NSC والتجديد الذاتي ، والتمايز العصبي والدلي ، في كل من السياق الفسيولوجي وسياق المرض. وعلاوة على ذلك، في الدراسات المختبرية يمكن استخدامها لتقييم درجة المواصفات الجوهرية الموجودة في السلائف العصبية أثناء التنمية، وكذلك لدراسة الإمكانات الكاملة للخلايا، عن طريق إزالة الإشارات الخارجية المرتبطة بيئتها العادية6. نموذج الغلاف العصبي هو قيمة لتقييم المنظمين المفترضين منذ الحفاظ على الخلايا في وسط خالية من المصل، يتم توفير الإشارات البيئية فقط من قبل الخلايا المحيطة6. وعلاوة على ذلك، في وكالة الأمن القومي، يتم توسيع NSPCs بسهولة في الثقافة، وكثافة الخلايا لكل منطقة عالية والتكوين غير المتجانس للكرة العصبية لديه بعض التشابه في منافذ الجسم الحي6. هذه المزايا الراسخة هي السبب في استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع من قبل العديد من الباحثين.
يصف البروتوكول التالي بالتفصيل جميع العمليات من عزلة سكان NSPC بعد الولادة من المنطقتين العصبية الرئيسيتين ، المنطقة تحت البطين (SVZ) والدوران في قرن آمون ، إلى توسع تلك الخلايا ككرة عصبية ، وكذلك إلى التمايز في الخلايا العصبية والخلايا الفلكية وoligodendrocytes. وأخيراً، يتم وصف المقالات المختلفة أيضًا للوصول إلى الخصائص المتعددة القدرات والمتعددة القدرات لـ NSPCs المشتقة من SVZ وDG.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

إن القول بالغلاف العصبي هو تقنية مفيدة للغاية في المختبر لدراسة الخصائص المتأصلة للخلايا الجذعية العصبية / السلف (NSPCs) بما في ذلك الانتشار والتجديد الذاتي والقدرة المتعددة. في الدماغ بعد الولادة والبالغين ، NSPCs موجودة بشكل رئيسي في اثنين من المنافذ العصبية: المنطقة تحت البطين (SVZ) بطانة البطينين الجانبي والمنطقة تحت الحبيبية من الدوران دنيتات فرس النهر (DG). العزلة من المنافذ العصبية من الدماغ بعد الولادة يسمح الحصول على كمية أكبر من NSPCs في الثقافة مع ما يترتب على ذلك من ميزة ارتفاع الغلة. يخلق الاتصال الوثيق بين الخلايا داخل كل كرة عصبية بيئة دقيقة قد تشبه المنافذ العصبية. هنا، نصف، بالتفصيل، كيفية توليد ثقافات الغلاف العصبي المشتقة من SVZ وDG من الفئران التي يبلغ عمرها 1-3 أيام (P1−3) ، وكذلك التمرير ، لتوسيع نطاق الكرة العصبية. وهذا نهج مفيد لأن القول بالغلاف العصبي يسمح بجيل سريع من استنساخ NSPC (6-12 يوماً) ويساهم في انخفاض كبير في عدد استخدام الحيوانات. من خلال طلاء الخلايا العصبية في ظروف متباينة ، يمكننا الحصول على طبقة الزائفة من الخلايا المكونة من NSPCs والخلايا المتمايزة من الأنساب العصبية المختلفة (الخلايا العصبية والخلايا الفلكية وoligodendrocytes) مما يسمح بدراسة إجراءات العوامل الجوهرية أو الخارجية على انتشار NSPC والتمايز وبقاء الخلايا وتولد الخلايا.

تتكون SVZ و DG neurospheres ، التي تم الحصول عليها باستخدام NSA ، من خلايا غير متمايزة ، إيجابية لـ Sox2 ، وهو عامل النسخ الذي ينطوي عليه قدرة التجديد الذاتي وإيجابي للنيشتين ، وهو بروتين خيوط متوسط يتم التعبير عنه في NSPCs(الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك ، فإن المجالات العصبية المشتقة من SVZ لها أبعاد أكبر من نظيراتها في DG(الشكل 1A). الأهم من ذلك ، في ظروف متباينة ، SVZ - وDG المشتقة NSPCs الهجرة من الخلايا العصبية تشكيل pseudomonolayer من الخلايا(الشكل 1باء).
للوصول إلى قدرة التجديد الذاتي ، يتم إجراء المقازة زوج الخلية استنادًا إلى تعبير Sox2 و nestin الذي يميل إلى الاختفاء في الخلايا المنقسمة التي تبدأ عملية التمايز مع مزيج من علامة النسب العصبي وهي DCX. في كلتا المنطقتين العصبية، من الممكن مراقبة وجود Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- الانقسامات المتماثلة (التجديد الذاتي)(الشكل 2A1، B1)،Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- أقسام غير متناظرة(الشكل 2A1، B2)وSox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ أقسام متناظرة (تمايز)(الشكل 2A2، B1).
تمرير الاعصاب يزيد من غلة NSPCs; ومع ذلك، موت الخلية في DIV2 التغييرات مع تمرير. في الواقع ، يتم زيادة النسبة المئوية للخلايا إيجابية PI مع مرور الخلية في SVZ (P0: P0: 15.6٪ ± 1.2٪ مقابل P1: 19.2٪ ± 2.7٪ مقابل P2: 32.35٪ ± 0.14٪ مقابل P3: 39.6٪ ± 4.0٪ وفي DG (P0: 16.31٪ ± 0.95٪ مقابل P1: 32.1٪ ± 1.7٪ مقابل P2: 27.42٪ مقابل P3: 32.2٪ ± 3.1٪) (الشكل3).
يمكن تقييم الخلايا العصبية النيأوريتومجينيسيس في الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من التمايز SVZ و DG NSPCs في بداية التمايز: DIV1(الشكل 4A, D)، DIV2(الشكل 4B, E)و DIV3(الشكل 4C, F). في الواقع ، كما لوحظ في الشكل 4، يزيد طول وتشعبات النتريت مع التمايز.
ويمكن تقييم انتشار الخلايا في المجالات العصبية المشتقة من SVZ وDG. مقارنة الخلايا العصبية المتمايزة الأولية في DIV1 من SVZ(الشكل 5A1)و DG(الشكل 5A2)، فإن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية بـ BrdU أعلى في SVZ منها في DG (SVZ: 6.15٪ ± 0.64٪ مقابل DG: 3.27٪ ± 0.13٪؛ p & 0.05؛ n = 4؛ الشكل 5A3). وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا الوصول إلى التمايز الخلية عن طريق الجمع بين تلطيخ BrdU مع صانع ناضجة مثل نواة الخلايا العصبية (نيوان) الذي يحدد الخلايا العصبية الناضجة(الشكل 5B1، B2). ويبين الشكل 5B3 أن النسبة المئوية للذريات المنتشرة التي تميز في الخلايا العصبية الناضجة مماثلة في SVZ و DG (SVZ: 12.04٪ ± 1.58٪ مقابل DG: 13.56٪ ± 0.48٪؛ p > 0.05؛ n = 4).
يمكن الوصول إلى الصلابة والفعالية المتعددة لـ NSPCs المشتقة من SVZ وDG باستخدام وكالة الأمن القومي من خلال تقييم التعبير عن علامات مختلفة في أيام تمايز مختلفة (DIV2 و DIV7). في الواقع ، NSCs (النشاش والبروتين الحمضي الببري ليفي [GFAP] - الخلايا المزدوجة إيجابية) موجودة في كل من المناطق العصبية(الشكل 6A، G). هذه الخلايا قادرة على التفريق في الخلايا العصبية غير ناضجة (الخلايا الإيجابية DCX)(الشكل 6B, H),الخلايا العصبية الناضجة (الخلايا الإيجابية نيوني)(الشكل 6F, L),خلايا السلائف oligodendrocyte (الخلايا العصبية الدبقية 2 [NG2] والصفائح الدموية المستمدة عامل النمو مستقبلات α [PDGFRα]- الخلايا الإيجابية)(الشكل 6C, I),ناضجة oligodendrocytes (المايليين البروتين الأساسي [MBP]-الخلايا الإيجابية)(الشكل 6E, K)والخلايا الفلكية (خلايا GFAP إيجابية)(الشكل 6D, J).
يمكن استخدام ركائز مختلفة لمعطف coverslips لتشكيل pseudomonolayer من الخلايا في ظل ظروف متباينة. كما هو موضح في الشكل التكميلي 1، تهاجر خلايا DG أكثر عندما يكون لدى coverslips طلاء إضافي مع اللامينين مع منظمة التحرير الفلسطينية أو PDL من PDL وحده(الشكل التكميلي 1B−H). في الواقع، عندما يتم استخدام PDL واللامينين معا كركائز(الرقم التكميلي 1C، G)،خلايا DG تشكل pseudomonolayer أكثر تعامي من خلايا SVZ التي يتم استخدام PDL وحدها(الرقم التكميلي 1A، E).
والأهم من ذلك أن هذه النتائج تظهر قدرة وكالة الأمن القومي على تقييم خصائص الصلابة والقدرات المتعددة لـ NSCs المستمدة من المنافذ العصبية الرئيسية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> الشكل 1: المنطقة تحت البطين ية والدنات جيروس المستمدة NSPC المستزرعة كدراسات عصبية أو كما pseudomonolayers. (أ)ممثل برايتفيلد(A1، A3)وfluorescence(A2، A4)صور من SVZ- وDG المستمدة من الاعصاب، حيث كانت ملطخة النوى مع هويشت 33342 (الأزرق) وNSCs لSox2 (الأخضر) والنشاش (الأحمر). (B)صور ساطعة تمثيلية لطبقات الصوت الزائفة المتولدة من المجالات العصبية المشتقة من SVZ وDG في ظل ظروف متباينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> الشكل 2: احسب زوج الخلية. صور الفلورسينس التمثيلية لأزواج الخلايا المشتقة من انقسام الخلايا السلف. كانت نواة SVZ و DG ملطخة بـ Hoechst 33342 (الأزرق) والخلايا الجذعية الشبيهة بـ Sox2 (الأحمر) والنشاش (أبيض) بالإضافة إلى الخلايا العصبية غير الناضجة مع DCX (الأخضر). تشير رؤوس الأسهم في الألواح A1 و B1 إلى Sox2+/+/ nestin+/+/ DCX-/- الانقسامات المتماثلة للتجديد الذاتي، تشير الأسهم في الألواح A1 و B2 إلى Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ تقسيمات غير متناظرة، سهام خط متقطعة في الألواح A2 وB1 تظهر Sox2-/-/nestin-/--DCX+/+ تقسيمات متناظرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> الشكل 3: تحليل بقاء الخلية مع تمرير الخلية. التحليل الكمي للخلايا الإيجابية PI في DIV2 في SVZ- وDG المستمدة من ثقافة الخلايا العصبية المتمايزة، بعد 0 و 1 و 2 و 3 مقاطع (P0-P3). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 1−8. PI = البوليديوم يوديد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> الشكل 4: تحليل تكوين النيلوريات في DIV 1 و 2 و 3. ممثل الصور الفلورية confocal من neurites, التي حددتها إشارة αIII-tubulin, في الخلايا العصبية SVZ و DG في(A, D)DIV1,(B, E)DIV2, و(C, F)DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> الشكل 5: القول بانتشار الخلايا. صور تمثيلية من الخلايا الإيجابية BrdU في DIV1 في (A1) SVZ و (A2) DG. (A3) التحليل الكمي للخلايا الإيجابية بـ BrdU في DIV1 في DG - و SVZ المستمدة من ثقافة الخلايا العصبية المتمايزة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 4. * ع < 0.05 عن طريق اختبار تي. صور الفلورسينس التمثيلية للخلايا الإيجابية لـ BrdU وNeuN في DIV7 في(B1)SVZ و(B2)DG. تشير رؤوس الأسهم إلى خلايا BrdU-/NeuN-positive. (B3) التحليل الكمي للخلايا الإيجابية BrdU/NeuN في DIV7 في كلا المجالين. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 4. BrdU: 5-برومو-2'-deoxyuridine، الاصطناعية الثيميدين التماثلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> الشكل 6: أنواع الخلايا العصبية الموجودة في استزراع الغلاف العصبي المتمايز المشتق من SVZ وDG. صور الفلورسينس التمثيلية لأنواع الخلايا المشتقة من SVZ و DG بعد 2 و 7 أيام من تمايز الغلاف العصبي (DIV2 و DIV7) ، حيث كانت نواة الخلايا ملطخة بـ Hoechst 33342 (الأزرق) و:(A، G)NSCs لGFAP (الأخضر) والنشاش (الأحمر) (B ، H) الخلايا العصبية غير الناضجة لDCX (الأخضر),(C, I)خلايا السلائف oligodendrocyte لPDGFRα (الأخضر) وNG2 (الأحمر),(D, J)الخلايا الفلكية لGFAP (الأخضر),(E, K)oligodendrocytes ناضجة لMBP (الأخضر), و(F, L)الخلايا العصبية ناضجة لنوين (أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> الشكل التكميلي 1: اختبار ركائز مختلفة للالتزام بالغلاف العصبي والهجرة لتشكيل طبقة زائفة. صور الفلورسين التمثيلية لـ(A, E)SVZ المشتقة من الـ pseudomonolayer باستخدام البولي د-ليسين كركيزة،(B, F)DG المشتقة pseudomonolayer باستخدام البولي D-ليسين كركيزة,(C, G)DG المشتقة من pseudomonolayer باستخدام البولي D-lysine مع اللامينين كركيزة, و (D, H)DG المشتقة من pseudomonolayer باستخدام البولي د-ليسين مع بولي-L-ornithine كركيزة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

في هذه المقالة، نصف، بالتفصيل، بروتوكول لتوليد ثقافات الغلاف العصبي من الخلايا الجذعية العصبية الماوس بعد الولادة المستمدة من منافذ الماوس العصبيالرئيسي الرئيسي. وتستخدم الخلايا العصبية لتحديد الخلايا الجذعية العصبية من أنسجة الدماغ مما يسمح لتقدير أعداد الخلايا السلائف. وعلاوة على ذلك، يمكن مطلي هذه الهياكل 3D في ظروف متباينة، مما يؤدي إلى الخلايا العصبية، oligodendrocytes والخلايا الفلكية، مما يسمح لدراسة مصير الخلية.

عزل وتوسعة المجالات العصبية من بعد الولادة (P1−3) منافذ عصبية للفأر

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

إن مقايسة الغلاف العصبي مفيدة في تقنية المختبر لدراسة الخصائص المتأصلة للخلايا الجذعية العصبية/الخلايا السلف بما في ذلك الانتشار والتجديد الذاتي وتعدد القدرات في السياق الفسيولوجي والمرضي على حد سواء. نظرا لبنيتها ثلاثية الأبعاد، هذه التقنية هي أدوات قوية لدراسة تولد الأعصاب الكبار. كما أنه مفيد لاستزراع والحصول على غلة أعلى من الخلايا الجذعية العصبية / السلف.يمكن تطبيق هذا الفحص العصبي على دراسة اضطرابات الدماغ مثل مرض الزهايمر وأمراض باركنسون أو التصلب المتعدد. يمكن الحصول على الخلايا العصبية أيضا من مناطق أو أنظمة أخرى في الدماغ، مثل الأنسجة الدهنية أو الأمعاء. التظاهر الإجراء مع فيليبا ريبيرو ستكون ريتا سواريس، طالبة دكتوراه في مجموعتي.لحصاد اليوم التالي للولادة من 1 إلى 3 أدمغة فأرة، أمسك الجزء البطني من الجسم عند قاعدة الرأس واستخدم مقصًا مدببًا صغيرًا لإجراء شق في الجلد على طول الرأس لفضح الجمجمة. جعل شق طولي في قاعدة الجمجمة ومواصلة قطع على طول خياطة القوس في زاوية ضحل ممكن لتجنب إتلاف هياكل الدماغ. استخدم ملقط منحنية لقشر الجمجمة إلى الجانبين لفضح الدماغ وشريحة ملعقة صغيرة تحت الدماغ لقطع الأعصاب القحفية والأوعية الدموية التي ترتبط بقاعدة الدماغ.وضع الدماغ في طبق بيتري من HBSS الباردة تكملها المضادات الحيوية ووضع الطبق تحت مجهر تشريح في التكبير منخفضة. ضع الدماغ على سطحه الظهري. أثناء الإمساك بالدماغ عن طريق المخيخ، استخدم ملقطًا ناعمًا لإزالة السحايا من الجانب البطني من الدماغ والمصابيح الشمية.تدوير الدماغ على الجانب البطني وتقشر قبالة بقية السحانيات. ثم استخدم ملقط لإزالة المخيخ واستخدام ملقط مدببة منحنية لنقل الدماغ على قطعة من ورقة التصفية مع مسام 11 ميكرومتر على رأس المروحية الأنسجة. لSVZ وDG microdissection، تبدأ بتقطيع الدماغ إلى 450 ميكرومتر أقسام التاجية.استخدام lamina الرطب لجمع الدماغ مقطعة في طبق بيتري جديد مليئة المضادات الحيوية الباردة تكمل HBSS تحت مجهر تشريح واستخدام ملقط لفصل شرائح الإكليل بطريقة من الأمامي إلى الخلفي حتى يتم التوصل إلى شرائح مع البطينين الجانبي. استخدام ملقط غرامة لقطع طبقة رقيقة من الأنسجة المحيطة الجدار الجانبي للبطينين، باستثناء parenchyma سترياتال والكالوسوم الجسم ووضع طرف واحد من ملقط مباشرة تحت الكولوسوم الجسم والآخر في الأنسجة المجاورة مباشرة للمنطقة البطينية من البطين الجانبي لعزل SVZ. قطع خط صغير من الأنسجة المحيطة البطين الجانبي وجمع الأنسجة تشريح في أنبوب عينة تحتوي على مكملات HBSS الحل.عندما تم الوصول إلى جميع الشرائح microdissected مع ملقط وتشكيل فرس النهر، والتخلص من الشريحة الأولى مع قرن آمون الذي DG لا يزال لا يمكن التعرف عليها. لإزالة DG، أولا عزل قرن آمون من شرائح وإعادة تركيز المجهر لتصور الحدود حول DG. لحصاد DG، استخدم ملقط لجعل قطع بين DG ومنطقة CA1 تليها قطع عمودي بين DG ومنطقة CA3. ثم إزالة الفمبرية وأي الأنسجة المجاورة ووضع الأنسجة المحصودة في أنبوب منفصل من محلول HBSS مكملة للمضادات الحيوية.للفك العينات SVZ وDG، إضافة تريبسين-EDTA 0.05٪ إلى تركيز نهائي من 5-10٪ من تريبسين-EDTA 0.05٪ في HBSS إلى كل أنبوب لاحتضان ما يقرب من 50 دقيقة في 37 درجة مئوية. الاستخدام الكامل لل تريبسين أو فترة حضانة طويلة جدا يمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا, تؤثر سلبا على نمو الخلايا. عندما تتجمع الأنسجة معا، استبدال محلول انزيم لأربعة يغسل متتالية مع ملليلتر واحد من ابر هبس الطازجة المكملة لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، resuspend الأنسجة المهضوبة في ملليلتر واحد من المتوسطة خالية من المصل تستكمل مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو البشرة وخمسة نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو الليفي الأساسي لكل أنبوب. ثم تفكيك ميكانيكيا الأنسجة مع الأنابيب لطيف سبع إلى 10 مرات مع أنبوب P1000 حتى تم الحصول على حل الخلية المتجانسة. لتحديد كثافة DG أو الخلية SVG المنفصلة، عد الخلايا في كل تعليق على مقياس دموي.لتوسيع الخلايا إلى neurospheres، تمييع مجموعات الخلايا الفردية في مرتين عشر إلى الخلايا الرابعة في كثافة المليلتر في المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو وبذور خمسة ملليلتر من تعليق الخلية في أطباق بيتري غير المصقولة قطر 60 ملليمتر. ثم احتضان خلايا SVZ لمدة ستة إلى ثمانية أيام وخلايا DG لمدة 10 إلى 12 يوما في 37 درجة مئوية لتشكيل الغلاف العصبي الأولية. عندما يكون معظم neurospheres 150 إلى 200 ميكرومتر القطر، حصاد تعليق الخلية من الثقافات وجمع الخلايا العصبية عن طريق الطرد المركزي.Resuspend منصة الغلاف العصبي مع طقم تجزئة الماوس الكيميائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل جمع الخلايا مع طرد مركز آخر. استبدال سوبرنات مع ملليلتر واحد من المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو ومحاولة بلطف لتقييم بيليه حوالي 10 مرات. عد الخلايا العصبية المنفصلة كما أظهرت وإعادة من الخلايا في مرتين 10 إلى الخلايا الرابعة في كثافة المليلتر في المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو في أطباق بيتري 60 ملليلتر جديدة.ثم ارجع الخلية إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ستة إلى ثمانية أيام إضافية أو 10 إلى 12 يوماً حسب الاقتضاء للحصول على neuro ثانوي. تتكون الخلايا العصبية SVG و DG التي يتم الحصول عليها باستخدام مقايسة الغلاف العصبي من خلايا إيجابية إيجابية من Sox2 غير متمايزة. وتجدر الإشارة إلى أن المغنطيس العصبي المشتق من SVG له أبعاد أكبر من نظيرها DG.الأهم من ذلك، في ظل ظروف التمايز، SVG وDG المستمدة الخلايا الجذعية /السلف العصبية تهاجر من الخلايا العصبية، وتشكيل pseudomonolayer من الخلايا. في كل من المناطق العصبية، فمن الممكن أن نلاحظ وجود Sox2 إيجابية مزدوجة، nestin إيجابية مزدوجة، مزدوجcortin أزواج الخلايا السلبية المزدوجة المقابلة لتقسيمات متناظرة تدل على التجديد الذاتي. أزواج الخلايا التي خلية واحدة من Sox2 إيجابية، nestin إيجابية، و doublecortin السلبية، والخلية الأخرى Sox2 السلبية، نستين سلبية، ومزدوجةcortin إيجابية مما يدل على الانقسامات غير المتماثلة.وSx2 السلبية المزدوجة، nestin السلبية المزدوجة، ومزدوجة paircortin مزدوج أزواج الخلايا الإيجابية المقابلة لتقسيمات متناظرة تدل على التمايز. عموما، تمرير يغير معدل وفيات الخلايا في اليوم الثاني في المختبر. يمكن تقييم تولد نيوريتوجين في الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من تمايز خلايا الجذعية العصبية SVG وDG/السلف في بداية التمايز.كما لوحظ، وطول وتشعب neurites يزيد مع التمايز. ويلاحظ أن نسبة عالية من الخلايا التكاثرية في SVG مقارنة DG. على الرغم من أن النسبة المئوية لتكاثر السلف التي تفرق في الخلايا العصبية ناضجة مماثلة في كل من المنافذ العصبية. كلا النوعين من الخلايا هي أيضا قادرة على التفريق في الخلايا العصبية غير ناضجة, النيوترونات ناضجة, oligodendrocytes الخلايا السلائف, oligodendrocytes ناضجة, والخلايا الفلكية.بعد الحصول على الخلايا العصبية، يمكن تنفيذ عدة طرق بما في ذلك الكيمياء المناعية، وتصوير الكالسيوم، والبقع الغربية وRT-PCR لدراسة الجذعية وتعدد القدرات للخلايا الجذعية العصبية / السلف. يمكن تطبيق مقايسة الغلاف العصبي على النماذج الوراثية والمرضية لمواصلة تقييم العمليات الجزيئية والخلوية التي تنطوي على انتشار وتمايز الخلايا الجذعية العصبية / السلف.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

ثقافة الخلايا العصبية المشتقة من المنافذ العصبية في الكبار فولز

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...