Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) modtog et stipendium fra FCT. Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af bioimaging facilitet på Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi bistand.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

In vitro-systemer af NSPCs giver en bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, som kan valideres yderligere in vivo. NSA er en meget kraftfuld metode til at efterligne fysiologiske forhold på grund af deres tre-dimensionelle struktur. Desuden er dette kultursystem også teknisk lettere at kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer såsom monolayer kultur system. Faktisk, med NSA, er det let at styre de eksponerede ydre signaler under celleudvikling, enten under ekspansion eller differentiering fase, ved at tilføje præcise og variable mængder af faktorer af interesse for medierne samt ved dyrkning neurosfærer med andre celletyper6. Sammenlignet med monolagskulturer er det desuden muligt at opnå en højere celletæthed fra en lille mængde væv eller med et lille antal celler, hvilket gør det muligt at udføre parallelle undersøgelser, hvilket reducerer antallet af dyr1.
NSA er den mest almindelige metode til at isolere og udvide NSCs11,,12,13, kan bruges til at vurdere antallet af prækursorceller til stede i en given vævsprøve5 og prækursorcellefrekvensen mellem forskellige betingelser. Men både neurosfærer og monolayer kulturer ikke tegner sig for quiescence NSCs14. Desuden NSA har nogle begrænsninger11,12,13 og den deraf følgende neurosfære frekvens afhænger af mange faktorer, herunder de mellemstore komponenter, dissektion procedure, dissociation proces11,12,13, og neurosfæren sammenlægning5. Faktisk, i en high-density kultur, neurosfærer tendens til at samle. Der skal derfor udvises forsigtighed ved vurdering af antallet af prækursorceller i en prøve. For at overvinde ovennævnte begrænsninger kan isolerede NSPC'er også udvides og omringes i et monolag5,15. Det er vigtigt at bruge NSA til at sammenligne prækursorcellefrekvens mellem forskellige betingelser er meget nyttigt og præcist, fordi alle disse begrænsninger er implicitte og ens blandt alle forhold, der udføres i det samme eksperiment.
Der er kritiske trin i neurosfæren kultur, der kræver opmærksomhed. I hjernen høst trin, fuldstændig fjernelse af meninges og god isolering af neurogene nicher er afgørende for at maksimere renheden og udbyttet af NSPCs. Under vævdissociation, på grund af proteolytisk aktivitet af trypsin, overdreven brug af trypsin eller længere inkubationstider kan føre til celle lysis. Desuden er dagen for passagen afgørende for at opnå en sund population af neurosfærer. Passaging neurosfærer med en diameter højere end 200 μm i høj grad påvirker levedygtighed, spredning og differentierende kapacitet NSPCs. Vigtigere, længere cyklusser af passager, mere end 10 kan øge genetisk ustabilitet6. Desuden er belægning med PDL og PLD/laminin til henholdsvis SVZ og DG-celler afgørende for at sikre god cellemigration ud af neurosfærerne uden at gå på kompromis med differentieringsprocessen. Med hensyn til immunocytokemianalyse kan længere inkubationstider med PFA kompromittere farvning ved at maskere antigenerne og øge baggrunden.
NSA er et kraftfuldt værktøj til at give en konsekvent og en ubegrænset kilde til NSPCs for in vitro undersøgelser af neurale udvikling og differentiering samt til terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analyse anvendes på genetiske og adfærdsmæssige modeller for yderligere at forstå de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i NSPC spredning og differentiering18,19. Denne analyse er også nyttigt at teste forskellige lægemidler og forbindelser20,21,22 samt at udføre genetiske manipulationer19,23 at modulere NSC egenskaber. Ud over immuncytokemi kan der udføres omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion og vestlig blotanalyse for at få adgang til RNA og proteinekspression, mens elektrofysiologiske undersøgelser og calciumbilleddannelse kan bruges til at evaluere funktionen af de nyfødte neuroner21.

Neurosfæren assay (NSA) blev først beskrevet i 19921,2 og stadig et unikt og kraftfuldt værktøj i neurale stamceller (NSC) forskning. Isoleringen af nscs fra de vigtigste neurogene regioner har udfordrende problemer, fordi kravene til at opretholde disse celler under fysiologiske forhold fortsat er dårligt forstået. I NSA dyrkes cellerne i et kemisk defineret serumfrit medium med tilstedeværelse af vækstfaktorer, herunder den epidermale vækstfaktor (EGF) og den grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF)1,2,3. Neurale prækursorceller (stamceller og stamafske) vælges ved hjælp af disse mitogener, da disse celler er EGF og FGF-responsive ind i en periode med aktiv spredning, mens andre celler, nemlig differentierede celler, dør4. Neurale prækursorceller vokser som neurosfærer, som derefter kan passages for yderligere at udvide puljen af disse celler5. Vigtigere, da disse neurale stamceller progenitor celler (NSPCs) er multipotente de er i stand til at differentiere ind i de tre store celletyper af centralnervesystemet (CNS): neuroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA giver en vedvarende kilde til udifferentierede CNS prækursorer, som kan bruges til at studere flere processer, herunder NSC spredning og selvfornyelse, og neuronal og glial differentiering, i både fysiologisk og sygdom sammenhæng. Desuden kan in vitro-undersøgelser bruges til at vurdere graden af iboende specifikation til stede i neurale prækursorer under udviklingen, samt at studere det fulde potentiale af cellerne, ved at fjerne ydre signaler forbundet med deres normale miljø6. Neurosfæremodellen er værdifuld til at evaluere formodede regulatorer, da ved at opretholde cellerne i et medium uden serum, de miljømæssige signaler er kun leveret af de omkringliggende celler6. Desuden er i NSA, NSPCs let udvides i kultur, tætheden af celler pr område er høj, og den heterogene sammensætning af neurosfærer har en vis lighed med in vivo nicher6. Disse veletablerede fordele er grunden til, at denne metode er blevet udbredt af mange forskere.
Følgende protokol beskriver i detaljer alle processer fra isolering af postnatal NSPC-population fra de to vigtigste neurogene regioner, subventrikulær zone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til udvidelse af disse celler som neurosfærer, samt til differentiering i neuroner, astrocytter og oligodendrocytes. Endelig beskrives der også forskellige analyser for at få adgang til stængelogens egenskaber for SVZ- og DG-afledte NSP'er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

Neurosfæren assay er en yderst nyttig in vitro teknik til at studere de iboende egenskaber af neurale stamceller / progenitor celler (NSPCs), herunder spredning, selvfornyelse og multipotency. I den postnatale og voksne hjerne er NSP'er hovedsageligt til stede i to neurogene nicher: den subventrikulære zone (SVZ), der forede de laterale ventrikler og den subgranulære zone i hippocampal dentate gyrus (GD). Isoleringen af de neurogene nicher fra postnatal hjerne gør det muligt at opnå en højere mængde nSPCs i kultur med en deraf følgende fordel af højere udbytter. Den tætte kontakt mellem celler inden for hver neurosfære skaber et mikromiljø, der kan ligne neurogene nicher. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man genererer SVZ- og DG-afledte neurosfærekulturer fra 1-3-dages gamle (P1-3) mus, samt passaging, til neurosfæreekspansion. Dette er en fordelagtig tilgang, da neurosfæren assay giver mulighed for en hurtig generation af NSPC kloner (6−12 dage) og bidrager til en betydelig reduktion i antallet af brug af dyr. Ved plating neurosfærer i differentierende betingelser, kan vi få en pseudomonolayer af celler, der består af NSPCs og differentierede celler af forskellige neurale slægter (neuroner, astrocytter og oligodendrocytes) giver mulighed for undersøgelse af handlinger iboende eller ydre faktorer på NSPC spredning, differentiering, celle overlevelse og neuritogenese.

SVZ og DG neurosfærer, fremstillet ved hjælp af NSA, er sammensat af udifferentierede celler, positive for Sox2, en transskriptionsfaktor involveret i selvfornyelseskapaciteten og positiv for nestin, et mellemfilamentprotein udtrykt i NSPCs (Figur 1A). Desuden har SVZ-afledte neurosfærer større dimensioner end deres modparter i GD (figur 1A). Det er vigtigt, at SVZ- og DG-afledte NSPC'er under forskellige forhold udvandrer ud af neurosfærer, der danner et pseudomonolag af celler (figur 1B).
For at få adgang til selvfornyelseskapaciteten udføres celleparanalysen baseret på udtrykket af Sox2 og nestin, som har tendens til at forsvinde i opdelingen af celler, der starter differentieringsprocessen med en kombination af en markør for den neuronale afstamning nemlig DCX. I begge neurogene områder er det muligt at observere tilstedeværelsen af Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske divisioner (selvfornyelse) (Figur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetriske divisioner (Figur 2A1,B2) og Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriske divisioner (differentiering) (Figur 2A2,B1).
Passaging neurosfærerne øger udbyttet af NSPCs; celledød ved DIV2 ændres dog med passaging. Faktisk øges procentdelen af PI-positive celler med cellepassage i SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) og i GD (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (Figur 3).
Neuritogenese kan vurderes i neuroner, der opnås ved differentiering af SVZ og GD NSPCs i begyndelsen af differentieringen: DIV1 (Figur 4A,D), DIV2 (Figur 4B,E) og DIV3 (Figur 4C,F). Som det er observeret i figur 4, øges længden og forgreningen af neuriterne med differentiering.
Celleproliferation kan evalueres i SVZ- og DG-afledte neurosfærer. Hvis man sammenligner primære differentierede neurosfærer ved DIV1 fra SVZ (Figur 5A1) og GD (Figur 5A2), er procentdelen af BrdU-positive celler højere i SVZ end i GD (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % vs. GD: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Figur 5A3). Desuden kan celledifferentiering også tilgås ved at kombinere BrdU farvning med en moden maker såsom neuronal kerner (NeuN), der identificerer modne neuroner (Figur 5B1, B2). Figur 5B3 viser, at procentdelen af prolifererende sogenitorer, der skelner til modne neuroner, er den samme i SVZ og GD (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs. GD: 13,56% ± 0,48%; p > 0,05; n = 4).
Der er adgang til stilken og multistyrken af SVZ- og DG-afledte NSP'er ved hjælp af NSA ved at evaluere udtrykket af forskellige markører på forskellige differentieringsdage (DIV2 og DIV7). Nscs (nestin- og glial fibrillary acidic protein [GFAP]-dobbeltpositive celler) findes faktisk i begge neurogene regioner (figur 6A,G). Disse celler er i stand til at skelne til umodne neuroner (DCX-positive celler) (Figur 6B,H), modne neuroner (NeuN-positive celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte prækursorceller (neuron-glial antigen 2 [NG2] og blodplade-afledt vækstfaktor receptor α [PDGFRα]- positive celler) (Figur 6C,I), modne oligodendrocytter (myelin basisprotein [MBP]-positive celler) (Figur 6E,K) og astrocytter (GFAP-positive celler) (Figur 6D,J).
Forskellige substrater kan bruges til at belægge dæksel til at danne pseudomonolayer af celler under differentierede forhold. Som vist i supplerende figur 1migrerer DG-celler mere , når dækslips har ekstrabelægning med lamin in kombineret med PLO eller PDL end med PDL alene (supplerende figur 1B-H). Når PDL og laminin anvendes sammen som substrater (supplerende figur 1C,G),danner GD-celler faktisk et mere sammenflydende pseudomonolag end SVZ-celler, for hvilke PDL anvendes alene (supplerende figur 1A,E).
Det er vigtigt, at disse resultater viser NSA's potentiale til at vurdere stamcellerog multipotency egenskaber nscs stammer fra de to vigtigste neurogene nicher.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figur 1: Subventrikulær zone og dentitet gyrus afledt NSPC dyrket som neurosfærer eller som pseudomonolayers. (A) Repræsentant brightfield (A1,A3) og fluorescens (A2,A4) billeder af SVZ- og DG-afledte neurosfærer, hvor kerner blev farves med Hoechst 33342 (blå) og NSCs for Sox2 (grøn) og nestin (rød). (B) Repræsentative brightfield billeder af pseudomonolayers genereret fra SVZ- og DG-afledte neurosfærer under differentierede forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Figur 2: Celleparassayet. Repræsentative fluorescensbilleder af cellepar, der er afledt af en stamcelledeling. SVZ og DG kerner blev plettet med Hoechst 33342 (blå), stamceller-lignende celler til Sox2 (rød) og nestin (hvid) samt umodne neuroner med DCX (grøn). Pilespidser i paneler A1 og B1 angiver Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske selvfornyende divisioner, pile i paneler A1 og B2 angiver Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetriske divisioner, stiplede linjepile i panelerne A2 og B1 viser Sox2-/-/nestin-/- /-/DCX+/++ symmetriske differentierende divisioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figur 3: Celleoverlevelsesanalyse med cellepassage. Kvantitativ analyse af PI-positive celler ved DIV2 i SVZ- og DG-afledt differentieret neurosfærekultur efter 0, 1, 2 og 3 passager (P0−P3). Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 1-8. PI = propidiumiodid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figur 4: Neuritogenese analyse på DIV 1, 2 og 3. Repræsentative konfokale fluorescensbilleder af neuriter, identificeret ved βIII-tubulinsignalet, i SVZ og DG neuroner ved (A,D) DIV1, (B, E) DIV2 og (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figur 5: Celleproliferationsanalyse. Repræsentative konfokale billeder af BrdU-positive celler ved DIV1 i (A1) SVZ og(A2)DG. (A3) Kvantitativ analyse af BrdU-positive celler ved DIV1 i gd- og SVZ-afledt differentieret neurosfærekultur. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 4. *p < 0,05 ved t-test. Repræsentative fluorescensbilleder af BrdU- og NeuN-positive celler ved DIV7 i (B1) SVZ og(B2)DG. Pilespidser angiver BrdU-/NeuN-positive celler. (B3) Kvantitativ analyse af BrdU-/NeuN-positive celler ved DIV7 i begge nicher. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridin, syntetisk thymidin analog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figur 6: Neurale celletyper til stede i SVZ- og DG-afledt differentieret neurosfærekultur. Repræsentative fluorescensbilleder af SVZ- og DG-afledte celletyper efter 2 og 7 dages neurosfæredifferentiering (DIV2 og DIV7), hvor cellekerner blev farves med Hoechst 33342 (blå) og: (A,G) NSCs for GFAP (grøn) og nestin (rød),(B,H) umoden neuron for DCX (grøn),(C,I) oligodendrocyte prækursorceller til PDGFRα (grøn) og NG2 (rød),(D,J) astrocytter til GFAP (grøn), (E,K) modne oligodendrocytes for MBP (grøn), og (F, L) modne neuroner for NeuN (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Supplerende figur 1: Test af forskellige substrater for neurosfærens vedhæftning og migration for at danne et pseudomonolayer. Repræsentative fluorescensbilleder af (A,E) SVZ-afledte pseudomonolayer, der anvender poly-D-lysin som substrat (B,F) DG-afledte pseudomonolayer, der anvender poly-D-lysin som substrat, (C,G) GD-afledt pseudomonolayer ved hjælp af poly-D-lysin med laminin som substrat, og (D,H) pseudomonolag, der anvender poly-D-lysin med poly-L-ornithin som substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

I denne artikel beskriver vi i detaljer en protokol for generation af neurosfærekulturer fra postnatale museneurale stamceller fra de primære neurogene nicher. Neurosfærer bruges til at identificere neurale stamceller fra hjernevæv tillader estimering af prækursorcelletal. Desuden kan disse 3D-strukturer være belagt under forskellige forhold, hvilket giver anledning til neuroner, oligodendrocytter og astrocytter, så studiet af celleskæbne.

Isolation og udvidelse af neurosfærer fra postnatal (P1-3) Mus neurogene nicher

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Den neurosphere assay er nyttig in vitro teknik til at studere de iboende egenskaber neurale stamceller / progenitor celler, herunder spredning, selvfornyelse og multipotency i både fysiologiske og patologiske sammenhæng. På grund af sin tredimensionelle struktur, denne teknik er et kraftfuldt værktøj til at studere voksne neurogenese. Det er også nyttigt for dyrkning og opnå højere udbytter af neurale stamceller / progenitor celler.Denne neurosphere assay kan anvendes til undersøgelse af hjernesygdomme såsom Alzheimers og Parkinsons sygdomme eller multipel sklerose. Neurosfærer kan også fås fra andre hjerneregioner eller -systemer, såsom fedtvæv eller tarmen. Demonstrere proceduren med Filipa Ribeiro vil være Rita Soares, en ph.d.-studerende i min gruppe.At høste postnatal dag en til tre mus hjerner, holde ventrale del af kroppen i bunden af hovedet og bruge små spidse saks til at gøre en midterlinjen snit i huden over hele længden af hovedet for at afsløre kraniet. Lav en langsgående snit i bunden af kraniet og fortsætte med at skære langs sagittal sutur på en lavvandet en vinkel som muligt for at undgå at beskadige hjernens strukturer. Brug buede kraftbefædre til at skrælle kraniet til siderne for at eksponere hjernen og skubbe en lille spatel under hjernen for at skære kranienerver og blodkar, der er forbundet til bunden af hjernen.Placer hjernen i en petriskål af kold HBSS suppleret med antibiotika og placere skålen under en dissekere mikroskop ved lav forstørrelse. Placer hjernen på dens dorsale overflade. Mens du holder hjernen ved lillehjernen, bruge fine kraftang til at fjerne meninges fra ventrale side af hjernen og olfaktoriske pærer.Drej hjernen på ventrale aspekt og skalle resten af meninges. Brug derefter de vicessper til at fjerne lillehjernen og bruge buede spidse kraftang til at overføre hjernen på et stykke filterpapir med en 11 mikrometer pore på toppen af en væv chopper. For SVZ og DG mikrodissektion, begynde med at hakke hjernen i 450 mikrometer koronale sektioner.Brug en våd lamina til at samle den sektionsopdemerede hjerne i en ny petriskål fyldt med koldt antibiotikum suppleret HBSS under en dissekere mikroskop og bruge kraftbærende skiver til at adskille koronale skiver i en forreste-til-posterior måde, indtil skiver med laterale ventrikler er nået. Brug fine kraftbefæstelser til at skære det tynde lag af væv omkring venklens laterale væg, bortset fra striatal parenkym og corpus callosum og placere den ene spids af snæver umiddelbart under corpus callosum og den anden i vævet umiddelbart støder op til ventrale område af den laterale hjertekammer for at isolere SVZ. Skær en lille linje af væv omkring den laterale hjertekammer og indsamle dissekeret væv i en prøve rør, der indeholder supplerende HBSS løsning.Når alle skiverne er blevet mikrodesopret med snævler og hippocampal formation er nået, kasseres den første skive med hippocampus, hvor DG stadig er uigenkendelig. For at fjerne DG skal du først isolere hippocampus fra skiverne og fokusere mikroskopet igen for at visualisere grænserne omkring DG. For at høste generaldirektoratet skal der anvendes støttekraft til at foretage en nedskæring mellem GD og CA1-regionen efterfulgt af en lodret nedskæring mellem GD og CA3-regionen. Fjern derefter fimbria og eventuel tilstødende væv og placere det høstede væv i separat rør af antibiotika suppleret HBSS opløsning.For at adskille SVZ- og DG-prøverne skal du tilføje Trypsin-EDTA 0,05% til en endelig koncentration på 5-10% af Trypsin-EDTA 0,05% i HBSS til hvert rør for en ca. 50 minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Hele brugen af trypsin eller for lang inkubationstid kan føre til øget celledød, negativ indvirkning cellevækst. Når vævet er klumpet sammen, erstattes enzymopløsningen i fire på hinanden følgende vaske med en milliliter frisk suppleret HBSS pr. vask.Efter den sidste vask opsaltrede det fordøjede væv igen i en milliliter serumfrit medium suppleret med 10 nanogram pr. milliliter epidermal vækstfaktor og fem nanogram pr. milliliter grundlæggende fibroblastvækstfaktor pr. rør. Derefter disskrives vævet mekanisk med blid pipettering syv til 10 gange med en P1000-pipet, indtil der er opnået en homogen celleopløsning. For at bestemme tætheden af det dissocierede DG eller SVG-celle skal cellerne i hver suspension tælles på et hæmatocytometer.For at udvide cellerne i neurosfærer, fortynde de enkelte cellepopulationer på en to gange ti til de fjerde celler pr milliliter tæthed i serum-fri medium suppleret med vækstfaktorer og frø fem milliliter af celle suspension i ubestrøget 60 millimeter diameter Petri retter. Derefter inkuberes SVZ-cellerne i seks til otte dage og DG-cellerne i 10 til 12 dage ved 37 grader Celsius for primær neurosfæredannelse. Når størstedelen af neurosfærerne har 150 til 200 mikrometerdiameter, høste celle suspension fra kulturerne og indsamle neurosfærer ved centrifugering.Resuspend neurosphere pallen med en mus kemisk dissociation kit i henhold til producentens anvisninger, før indsamling af cellerne med en anden centrifugering. Udskift supernatanten med en milliliter serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer og forsøg forsigtigt at bedømme pellet omkring 10 gange. De dissocierede neuroceller tælles som påvist og reseed cellerne med to gange 10 til de fjerde celler pr. millilitertæthed i serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer i nye 60 milliliter petriskåle.Derefter returnere cellen til cellekultur inkubatoren for yderligere seks til otte eller 10 til 12 dage efter behov for at opnå sekundære neurosfærer. SVG og DG neurosfærer opnået ved hjælp af neurosphere assay er sammensat af udifferentieret Sox2 positive, nestin positive celler. Især, SVG afledte neurosfærer har større dimensioner end deres DG kolleger.Vigtigere, under differentiering betingelser, SVG og DG-afledte neurale stamceller / progenitor celler migrere ud af neurosfærer, danner en pseudomonolayer af celler. I begge neurogene regioner er det muligt at observere tilstedeværelsen af Sox2 dobbelt positiv, nestin dobbelt positiv, dobbeltkortin dobbelt negative cellepar svarende til symmetriske divisioner, der indikerer selvfornyelse. Cellepar, hvor en celle med Sox2-positiv, nestin positiv og dobbeltkorsinalktiv, og den anden celle Sox2 negativ, nestin negativ og dobbeltkortin positiv, der demonstrerer asymmetriske divisioner.Og Sox2 dobbelt negativ, nestin dobbelt negativ, og dobbeltkortin dobbelt positive cellepar svarende til symmetriske divisioner, der tyder på differentiering. Samlet set passerer ændrer celle dødelighed på den anden dag in vitro. Neuritogenese kan evalueres i neuroner opnået fra differentiering af SVG og DG neurale stamceller / progenitor celler i begyndelsen af differentiering.Som observeret, længden og forgrening af neuritterne stiger med differentiering. Der observeres en høj procentdel af proliferative celler i SVG sammenlignet med GD. Selv om procentdelen af prolifererende forfædre, der differentierer sig i modne neuroner er ens i begge neurogene nicher. Begge celletyper er også i stand til at differentiere sig til umodne neuroner, modne neutroner, oligodendrocytes prækursorceller, modne oligodendrocytter og astrocytter.Efter at have fået neurosfærer, flere metoder, herunder immunoktokemi, calcium billeddannelse, vestlige blots og RT-PCR kan udføres for at studere stemness og multipotency af neurale stamceller / progenitor celler. Den neurosphere assay kan anvendes på genetiske og sygdomsmodeller til yderligere at vurdere de molekylære og cellulære processer indebærer i både spredning og differentiering af neurale stængel / progenitor celler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering og Udvidelse af menneskelige glioblastom multiforme tumorceller Brug af Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering og dyrkning af Voksen neurale stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic Transplantation af Interneuron prækursorer i tidlige Postnatal mus hjerner

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantation af kemo genetisk manipulerede kortikale interneuron-Progenitorer til tidlige postnatale musehjerner

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generation af Neuro kugler fra blandede primære hippocampus og kortikale neuroner isoleret fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rensning af Prominin-1+ Stamceller fra Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur af Neurosfærer Stammer fra neurogene nicher i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...