Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door IF/01227/2015 en UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) en R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) kregen een beurs van FCT. De auteurs willen de leden van de bioimaging faciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes bedanken voor microscopie assistentie.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In vitro systemen van NSC's zorgen voor een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen, die verder kunnen worden gevalideerd in vivo. De NSA is een zeer krachtige methode om fysiologische omstandigheden na te bootsen als gevolg van hun driedimensionale structuur. Bovendien is dit cultuursysteem technisch ook gemakkelijker te kweken10, in vergelijking met andere in vitro systemen zoals het monolayer cultuursysteem. Inderdaad, met de NSA, is het gemakkelijk om de blootgestelde extrinsieke signalen tijdens de celontwikkeling te controleren, hetzij tijdens de expansie- of differentiatiefase, door nauwkeurige en variabele hoeveelheden factoren toe te voegen die van belang zijn voor de media en door neurosferen te kweken met andere celtypen6. Bovendien is het in vergelijking met monolayerculturen in de NSA mogelijk om een hogere celdichtheid te verkrijgen uit een kleine hoeveelheid weefsel of met een klein aantal cellen, waardoor parallelle studies kunnen worden uitgevoerd, waardoor het aantal dieren kan wordenverminderd 1.
De NSA is de meest voorkomende methode om NSC's te isoleren en uit te breiden11,12,13, kan worden gebruikt om het aantal voorlopercellen aanwezig in een bepaald weefselmonster5 en de voorlopercelfrequentie tussen verschillende omstandigheden te schatten. Echter, zowel neurosferen en monolayer culturen geen rekening houden met rust NSCs14. Bovendien heeft de NSA een aantal beperkingen11,12,13 en de resulterende neurosfeerfrequentie is afhankelijk van vele factoren, waaronder de medium componenten, de dissectieprocedure, het dissociatieproces11,12,13, en neurosfeeraggregatie5. Inderdaad, in een cultuur met hoge dichtheid, neurosferen hebben de neiging om samen te voegen. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het schatten van het aantal voorlopercellen in een monster. Om bovenstaande beperkingen te overwinnen, kunnen geïsoleerde NSSPCs ook worden uitgebreid en doorgetrokken in een monolayer5,15. Belangrijk is dat het gebruik van NSA om de frequentie van voorlopercellen tussen verschillende omstandigheden te vergelijken zeer nuttig en nauwkeurig is, omdat al deze beperkingen impliciet en vergelijkbaar zijn tussen alle omstandigheden die in hetzelfde experiment worden uitgevoerd.
Er zijn kritische stappen in de neurosfeer cultuur die aandacht nodig hebben. In de hersenen oogsten stap, volledige verwijdering van de hersenvliezen en een goede isolatie van de neurogene niches zijn essentieel om de zuiverheid en opbrengst van NSC's te maximaliseren. Tijdens weefseldissociatie kan als gevolg van de proteolytische activiteit van trypsine overmatig gebruik van trypsine of langere incubatietijden leiden tot cellyse. Bovendien is de dag van de passage van cruciaal belang om een gezonde populatie van neurosferen te verkrijgen. Voorbijgaande neurosferen met een diameter hoger dan 200 μm heeft een grote invloed op de levensvatbaarheid, de proliferatie en de onderscheidende capaciteit van NSPc's. Belangrijk is dat langere cycli van passages, meer dan 10 genetische instabiliteit kunnen verhogen6. Bovendien is coating met RESPECTIEVELIJK PDL en PLD/laminine voor SVZ- en DG-cellen essentieel om een goede celmigratie uit de neurosferen te garanderen zonder het differentiatieproces in gevaar te brengen. In termen van de immunocytochemie analyse, langere incubatietijden met PFA kan ingevaar brengen kleuring door het maskeren van de antigenen en het verhogen van de achtergrond.
De NSA is een krachtig instrument voor het verstrekken van een consistente en een onbeperkte bron van NSSP's voor in vitro studies van neurale ontwikkeling en differentiatie, alsmede voor therapeutische doeleinden16,17. Deze test kan immers worden toegepast op genetische en gedragsmodellen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de proliferatie van DEPC en differentiatie18,19verder te begrijpen. Deze test is ook nuttig om verschillende geneesmiddelen en verbindingen te testen20,21,22 evenals om genetische manipulaties uit te voeren19,23 om NSC eigenschappen te moduleren. Naast immunocytochemie, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie en westerse vlek analyse kan worden uitgevoerd om toegang te krijgen tot RNA en eiwit expressie, terwijl elektrofysiologische studies en calcium beeldvorming kan worden gebruikt om de functie van de pasgeboren neuronen te evalueren21.

De neurosfeer test (NSA) werd eerst beschreven in 19921,2 en nog steeds een uniek en krachtig instrument in neurale stamcel (NSC) onderzoek. De isolatie van NSC's uit de belangrijkste neurogene regio's heeft uitdagende problemen omdat de vereisten om deze cellen in fysiologische omstandigheden te behouden slecht begrepen blijven. In de NSA worden cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd serumvrij medium met de aanwezigheid van groeifactoren, waaronder de epidermale groeifactor (EFG) en de basisgroeifactor voor fibroblasten (bFGF)1,2,3. Neurale voorlopercellen (stamcellen en voorlopers) worden geselecteerd met behulp van deze mitogenen, omdat deze cellen EFG en FGF-responsief zijn die een periode van actieve proliferatie binnenkomen, terwijl andere cellen, namelijk gedifferentieerde cellen, sterven4. Neurale voorlopercellen groeien als neurosferen, die vervolgens kunnen worden doorgestoid om de pool van deze cellen verder uit te breiden5. Belangrijk is dat, aangezien deze neurale stam voorloper cellen (NSSPCs) zijn multipotent ze in staat zijn om te differentiëren in de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS): neuronen, oligodendrocyten en astrocyten5.
De NSA biedt een hernieuwbare bron van ongedifferentieerde CNS-precursoren, die kunnen worden gebruikt om verschillende processen te bestuderen, waaronder NSC-proliferatie en zelfvernieuwing, en neuronale en gliadifferentiatie, zowel in fysiologische als in ziektecontext. Bovendien kunnen in vitro studies worden gebruikt om de mate van intrinsieke specificatie die aanwezig is in neurale precursoren tijdens de ontwikkeling te evalueren, evenals om het volledige potentieel van de cellen te bestuderen, door het verwijderen van extrinsieke signalen in verband met hun normale omgeving6. Het neurosfeermodel is waardevol om putatieve regelgevers te evalueren, aangezien door het handhaven van de cellen in een medium zonder serum, de milieusignalen alleen worden geleverd door de omringende cellen6. Bovendien zijn nssspc's in de NSA gemakkelijk uit te breiden in cultuur, is de dichtheid van cellen per gebied hoog en heeft de heterogene samenstelling van de neurosferen enige gelijkenis met in vivo niches6. Deze gevestigde voordelen zijn de reden waarom deze methodologie is op grote schaal gebruikt door veel onderzoekers.
Het volgende protocol beschrijft in detail alle processen van de isolatie van de postnatale NSPC-populatie uit de twee belangrijkste neurogene regio's, de subventriculaire zone (SVZ) en de hippocampaldentategyrus (DG), tot de uitbreiding van die cellen als neurosferen, evenals tot de differentiatie in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Ten slotte worden ook verschillende tests beschreven om toegang te krijgen tot stamness en multipotentie-eigenschappen van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

De neurosfeer test is een zeer nuttig in vitro techniek voor het bestuderen van de inherente eigenschappen van neurale stam / voorloper cellen (NSSPCs) met inbegrip van proliferatie, zelf-vernieuwing en multipotentie. In het postnatale en volwassen brein zijn NSPC's voornamelijk aanwezig in twee neurogene nissen: de subventriculaire zone (SVZ) langs de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampaldentate gyrus (DG). De isolatie van de neurogene niches van postnatale hersenen maakt het verkrijgen van een hogere hoeveelheid NSSPCs in de cultuur met een daaruit voortvloeiend voordeel van hogere opbrengsten. Het nauwe contact tussen cellen binnen elke neurosfeer creëert een micro-omgeving die kan lijken op neurogene niches. Hier beschrijven we in detail hoe we SVZ- en DG-afgeleide neurosfeerculturen kunnen genereren van 1-3-dagenoude (P1−3) muizen, evenals passaging, voor neurosfeeruitbreiding. Dit is een voordelige benadering omdat de neurosfeertest een snelle generatie NSPC-klonen (6−12 dagen) mogelijk maakt en bijdraagt aan een aanzienlijke vermindering van het aantal dierlijke toepassingen. Door neurosferen in differentiërende omstandigheden te platen, kunnen we een pseudomonolayer verkrijgen van cellen bestaande uit NSPC's en gedifferentieerde cellen van verschillende neurale geslachten (neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) waardoor de acties van intrinsieke of extrinsieke factoren op NSPC-proliferatie, differentiatie, celoverleving en neuritogenese kunnen worden bestudeerd.

SVZ en DG neurosferen, verkregen met behulp van de NSA, zijn samengesteld uit ongedifferentieerde cellen, positief voor Sox2, een transcriptiefactor die betrokken is bij de zelfvernieuwingscapaciteit en positief voor nestine, een tussenliggend filamenteiwit uitgedrukt in NSMc's (figuur 1A). Bovendien hebben svz-afgeleide neurosferen grotere afmetingen dan hun DG-tegenhangers (figuur 1A). Belangrijk is dat in differentiërende omstandigheden SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs migreren uit neurosferen die een pseudomonolayer van cellen vormen (figuur 1B).
Om toegang te krijgen tot de zelfvernieuwingscapaciteit, wordt de test van het celpaar uitgevoerd op basis van de expressie van Sox2 en nestindie meestal verdwijnen in delende cellen die het differentiatieproces starten met een combinatie van een marker van de neuronale afstamming namelijk DCX. In beide neurogene gebieden is het mogelijk om de aanwezigheid van Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische divisies (zelfvernieuwing) (Figuur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetrische divisies (figuur 2A1,B2) en Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetrische divisies (differentiatie)(figuur 2A2,B1).
Het passeren van de neurosferen verhoogt de opbrengst van NSPC's; echter, celdood bij DIV2 verandert met passaging. In feite wordt het percentage PI-positieve cellen verhoogd met celpassage in SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) en in DG (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (figuur 3).
Neuritogenese kan worden geëvalueerd in neuronen verkregen uit de differentiatie van SVZ en DG NSSpCs aan het begin van differentiatie: DIV1 (Figuur 4A, D), DIV2 ( Figuur4B, E) en DIV3 ( Figuur4C, F). In feite, zoals waargenomen in figuur 4,de lengte en vertakking van de neurites toeneemt met differentiatie.
Celproliferatie kan worden geëvalueerd in svz- en dg-afgeleide neurosferen. Door de primaire gedifferentieerde neurosferen bij DIV1 te vergelijken met SVZ (figuur 5A1) en DG (figuur 5A2), is het percentage BrdU-positieve cellen hoger in SVZ dan in DG (SVZ: 6,15% ± 0,64% vs DG: 3,27% ± 0,13%; p < 0,05; n = 4; Figuur 5A3). Bovendien kan celdifferentiatie ook worden benaderd door BrdU-kleuring te combineren met een volwassen maker, zoals neuronale kernen (NeuN) die volwassen neuronen identificeert(figuur 5B1,B2). Figuur 5B3 toont aan dat het percentage zich vermenigvuldigende voorouders dat zich onderscheidt in volwassen neuronen vergelijkbaar is in SVZ en DG (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs DG: 13,56% ± 0,48%; p > 0,05; n = 4).
De stamkracht en de multipotentie van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs kunnen worden benaderd met behulp van de NSA door de expressie van verschillende markers op verschillende differentiatiedagen (DIV2 en DIV7) te evalueren. NsC's (nestin- en gliafibrillaire zure eiwitten [GFAP]-dubbelpositieve cellen) zijn namelijk aanwezig in beide neurogene gebieden(figuur 6A,G). Deze cellen zijn in staat om te differentiëren in onrijpe neuronen (DCX-positieve cellen) (Figuur 6B,H), rijpe neuronen (NeuN-positieve cellen) (Figuur 6F, L),oligodendrocyte precursorcellen (neuron-glial antigeen 2 [NG2] en bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor α [PDGFRα]- positieve cellen) ( Figuur6C,I), rijpe oligodendrocyten (myelinebasiseiwit [MBP]-positieve cellen) (Figuur 6E,K) en astrocyten (GFAP-positieve cellen) (Figuur 6D,J).
Verschillende substraten kunnen worden gebruikt om coverslips te coaten om de pseudomonolayer van cellen te vormen onder differentiërende omstandigheden. Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1, migreren DG-cellen meer wanneer de coverslips extra coating hebben met laminine in combinatie met PLO of PDL dan met PDL alleen ( Aanvullend figuur1B−H). In feite vormen DG-cellen een meer confluente pseudomonolayer dan SVZ-cellen waarvoor ALLEEN PDL wordt gebruikt (Aanvullend figuur 1C,E).Supplementary Figure 1C,G
Belangrijk is dat deze resultaten het potentieel van de NSA aantonen om de stam- en multipotentie-eigenschappen van NSC's afkomstig van de twee belangrijkste neurogene niches te evalueren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figuur 1: Subventriculaire zone en dentate gyrus afgeleid NSPC gekweekt als neurosferen of als pseudomonolayers. (A) Representative brightfield (A1,A3) en fluorescentie (A2,A4) beelden van SVZ- en DG-afgeleide neurosferen, waar kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en NSCs voor Sox2 (groen) en nestin (rood). (B) Representatieve brightfield beelden van pseudomonolagen gegenereerd uit SVZ- en DG-afgeleide neurosferen onder differentiërende omstandigheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Figuur 2: De test van het celpaar. Representatieve fluorescentiebeelden van celparen afkomstig van een celdeling van de voorloper. SVZ en DG kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw), stamcellen-achtige cellen voor Sox2 (rood) en nestin (wit) en onrijpe neuronen met DCX (groen). Pijlpunten in de deelvensters A1 en B1 geven Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische zelfvernieuwende divisies, pijlen in panelen A1 en B2 aan op Sox2+/- /-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetrische divisies, stippellijnpijlen in panelen A2 en B1 tonen Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetrische differentiëringdivisies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figuur 3: Celoverlevingsanalyse met celveroudering. Kwantitatieve analyse van PI-positieve cellen bij DIV2 in SVZ- en DG-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur, na 0, 1, 2 en 3 passages (P0−P3). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 1−8. PI = propidium Jodide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figuur 4: Neuritogenese analyse bij DIV 1, 2 en 3. Representatieve confocale fluorescentiebeelden van neurites, geïdentificeerd door het βIII-tubulinesignaal, in SVZ- en DG-neuronen bij (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 en (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figuur 5: Celproliferatietest. Representatieve confocale beelden van BrdU-positieve cellen bij DIV1 in (A1) SVZ en (A2) DG. (A3) Kwantitatieve analyse van BrdU-positieve cellen bij DIV1 in DG- en SVZ-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 4. *p < 0,05 door t-test. Representatieve fluorescentiebeelden van BrdU- en NeuN-positieve cellen bij DIV7 in (B1) SVZ en (B2) DG. Pijlpunten wijzen brdu-/NeuN-positieve cellen aan. (B3) Kwantitatieve analyse van BrdU-/NeuN-positieve cellen bij DIV7 in beide niches. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine, synthetisch thymidine analoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figuur 6: Neurale celtypen aanwezig in SVZ- en DG-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur. Representatieve fluorescentiebeelden van SVZ- en DG-afgeleide celtypen na 2 en 7 dagen neurosfeerdifferentiatie (DIV2 en DIV7), waar celkernen werden bevlekt met Hoechst 33342 (blauw) en: (A,G) NSCs voor GFAP (groen) en nestin (rood), (B,H) onrijpe neuronen voor DCX (groen), (C,I) oligodendrocyte precursorcellen voor PDGFRα (groen) en NG2 (rood), (D,J) astrocyten voor GFAP (groen), (E,K) rijpe oligodendrocyten voor MBP (groen), en (F, L) volwassen neuronen voor NeuN (rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Aanvullend figuur 1: Het testen van verschillende substraten voor neurosfeertherapie en migratie om een pseudomonolayer te vormen. Representatieve fluorescentiebeelden van (A,E) SVZ-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine als substraat; (B,F) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine als substraat, (C,G) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine met laminine als substraat, en (D,H) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine met poly-L-ornithine als substraat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden bestudeerd.

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

De neurosfeertest is nuttig in vitro techniek voor het bestuderen van de inherente eigenschappen van neurale stam / voorloper cellen met inbegrip van proliferatie, zelfvernieuwing en multipotentie in zowel fysiologische en pathologische context. Door zijn driedimensionale structuur is deze techniek een krachtig middel voor het bestuderen van volwassen neurogenese. Het is ook nuttig voor het kweken en het verkrijgen van hogere opbrengsten van neurale stam / voorloper cellen.Deze neurosfeer test kan worden toegepast op de studie van hersenaandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson of multiple sclerose. Neurosferen kunnen ook worden verkregen uit andere hersengebieden of systemen, zoals vetweefsel of de darm. Het aantonen van de procedure met Filipa Ribeiro zal Rita Soares, een promovendus in mijn groep.Om postnatale dag één tot drie muishersenen te oogsten, houdt u het ventrale deel van het lichaam aan de basis van het hoofd vast en gebruikt u een kleine puntige schaar om een middellijnincisie in de huid over de gehele lengte van het hoofd te maken om de schedel bloot te stellen. Maak een longitudinale incisie aan de basis van de schedel en blijf snijden langs de sagittale hechting onder een ondiepe hoek mogelijk om te voorkomen dat beschadiging van de hersenstructuren. Gebruik gebogen tangen om de schedel te pellen aan de zijkanten om de hersenen bloot te stellen en schuif een kleine spatel onder de hersenen om de craniale zenuwen en bloedvaten die zijn aangesloten op de basis van de hersenen te snijden.Plaats de hersenen in een petrischaaltje van koude HBSS aangevuld met antibiotica en plaats de schotel onder een ontledende microscoop bij een lage vergroting. Plaats de hersenen op het rugoppervlak. Terwijl u de hersenen bij het cerebellum houdt, gebruikt u fijne tangen om hersenvliezen uit de ventrale kant van de hersenen en de reukbollen te verwijderen.Draai de hersenen op het ventrale aspect en pel de rest van de hersenvliezen af. Gebruik vervolgens de tangen om het cerebellum te verwijderen en gebruik gebogen puntige tangen om de hersenen over te brengen op een stuk filterpapier met een porie van 11 micrometer bovenop een weefselhakselaar. Voor SVZ en DG microdissection, beginnen met het hakken van de hersenen in 450 micrometer coronale secties.Gebruik een natte lamina om de gesegmenteerde hersenen te verzamelen in een nieuwe petrischaal gevuld met koude antibioticum aangevuld HBSS onder een ontleden microscoop en gebruik tangen om coronale plakjes te scheiden in een voorste-naar-achter-manier tot plakjes met de laterale ventrikels worden bereikt. Gebruik fijne tangen om de dunne laag van de weefsels rond de laterale wand van de ventrikels te snijden, met uitzondering van het striatale parenchyma en het corpus callosum en plaats een punt van de tangen onmiddellijk onder het corpus callosum en de andere in het weefsel direct grenzend aan het ventrale gebied van de laterale ventrikrie om de SVZ te isoleren. Snijd een kleine lijn van weefsels rond de laterale ventrikel en het verzamelen van de ontleed weefsel in een monster buis met aanvullende HBSS oplossing.Wanneer alle plakjes zijn microdissected met tangen en hippocampal vorming is bereikt, gooi het eerste plakje met hippocampus waarin het DG nog onherkenbaar is. Om het DG te verwijderen, isoleer eerst de hippocampus van de plakjes en richt u de microscoop opnieuw om de grenzen rond DG te visualiseren. Om het DG te oogsten, gebruik krachtpen om een snede te maken tussen de DG en CA1-regio, gevolgd door een verticale snede tussen de DG en CA3-regio. Verwijder vervolgens de fimbria en het aangrenzende weefsel en plaats het geoogste weefsel in een aparte buis van antibiotica aangevuld HBSS-oplossing.Om de monsters van SVZ en DG te scheiden, voegt u Trypsin-EDTA 0,05% toe aan een uiteindelijke concentratie van 5-10% trypsin-EDTA 0,05% in HBSS aan elke buis voor een incubatie van ongeveer 50 minuten bij 37 graden Celsius. Het hele gebruik van trypsine of te lange incubatietijd kan leiden tot een verhoogde celdood, die de celgroei negatief beïnvloedt. Wanneer het weefsel samengeklonterd is, vervang de enzymoplossing voor vier opeenvolgende wasbeurten door één milliliter verse aangevulde HBSS per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, resuspend de verteerde weefsels in een milliliter serum-vrij medium aangevuld met 10 nanogram per milliliter van epidermale groeifactor en vijf nanogram per milliliter van fundamentele fibroblast groeifactor per buis. Dan mechanisch scheiden van de weefsels met zachte pipetting zeven tot 10 keer met een P1000 pipet totdat een homogene cel oplossing is verkregen. Om de dichtheid van de gescheiden DG- of SVG-cel te bepalen, telt u de cellen in elke suspensie op een hematocytometer.Om de cellen uit te breiden in neurosferen, verdun de individuele cel populaties op een twee keer tien tot de vierde cellen per milliliter dichtheid in serum-vrij medium aangevuld met groeifactoren en zaad vijf milliliter van de cel suspensie in ongecoate 60 millimeter diameter petrischaaltjes. Vervolgens broeden de SVZ cellen voor zes tot acht dagen en de DG cellen voor 10 tot 12 dagen bij 37 graden Celsius voor primaire neurosfeer vorming. Wanneer de meerderheid van de neurosferen een diameter van 150 tot 200 micrometer heeft, oogst u de celsuspensie uit de culturen en verzamelt u de neurosferen door centrifugatie.Resuspend de neurosfeer pallet met een muis chemische dissociatie kit volgens de instructies van de fabrikant voor het verzamelen van de cellen met een andere centrifugatie. Vervang de supernatant door een milliliter serum-vrij medium aangevuld met groeifactoren en probeer voorzichtig om de pellet ongeveer 10 keer te beoordelen. Tel de gescheiden neurocellen zoals aangetoond en reseed de cellen op een twee keer 10 tot de vierde cellen per milliliter dichtheid in serum-vrij medium aangevuld met groeifactoren in nieuwe 60 milliliter petrischaaltjes.Breng de cel vervolgens terug naar de couveuse van de celkweek voor extra zes tot acht of 10 tot 12 dagen, indien nodig om secundaire neurosferen te verkrijgen. SVG en DG neurosferen verkregen met behulp van de neurosfeer test zijn samengesteld uit ongedifferentieerde Sox2 positieve, nestine positieve cellen. Met name, SVG afgeleide neurosferen hebben grotere afmetingen dan hun DG tegenhangers.Belangrijk is dat onder differentiatieomstandigheden, SVG en DG-afgeleide neurale stam/voorlopercellen uit de neurosferen migreren en een pseudomonoër van cellen vormen. In beide neurogene gebieden is het mogelijk om de aanwezigheid van Sox2 dubbel positief te observeren, nestin dubbel positief, doublecortine dubbele negatieve celparen die overeenkomen met symmetrische divisies die wijzen op zelfvernieuwing. Celparen waarin de ene cel van Sox2 positief, nestin positief en dubbelcortine negatief, en de andere cel Sox2 negatief, nestin negatief, en doublecortine positief aantonen asymmetrische divisies.En Sox2 dubbele negatieve, nestin dubbele negatieve, en doublecortine dubbele positieve celparen die overeenkomen met symmetrische divisies indicatief voor differentiatie. Over het algemeen verandert passaging het celsterftecijfer op de tweede dag in vitro. Neuritogenese kan worden geëvalueerd in neuronen verkregen uit de differentiatie van SVG en DG neurale stam / voorloper cellen aan het begin van differentiatie.Zoals waargenomen, de lengte en vertakking van de neurites toeneemt met differentiatie. Een hoog percentage proliferative cellen wordt waargenomen in SVG in vergelijking met DG. Hoewel het percentage prolifererende voorouders die zich onderscheiden in volwassen neuronen is vergelijkbaar in beide neurogene niches. Beide celtypen zijn ook in staat om zich te onderscheiden in onrijpe neuronen, volwassen neutronen, oligodendrocyten voorlopercellen, volwassen oligodendrocyten en astrocyten.Na het verkrijgen van de neurosferen kunnen verschillende methoden worden uitgevoerd, waaronder immunocytochemie, calciumbeeldvorming, westerse vlekken en RT-PCR om de stamheid en de multipotentie van de neurale stam/voorlopercellen te bestuderen. De neurosfeer test kan worden toegepast op genetische en ziekte modellen om verder te evalueren van de moleculaire en cellulaire processen te betrekken bij zowel de proliferatie en differentiatie van neurale stam / voorloper cellen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Cultuur van neurosferen afgeleid van de neurogene niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...