Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי IF/01227/2015 ו UID/בים בם/50005/2019, הקסם הפיננסי העליון (FCT)/מיני-מיניריו דה-לוגי, Tecnoלוגיה a Ensino מעולה (מק) מפואר ביותר בצפון-מג (MCTES). R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018), ו R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) קיבל מלגת מ-FCT. המחברים מתבקשים להודות לחברי מתקן הביודמיה ב-"המכון המולקולרי" לובו אנטז מולקולארי לסיוע במיקרוסקופ.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

במערכות חוץ-גופית של NSPCs מאפשרים הבנה טובה יותר של המנגנונים הסלולריים והמולקולריים, אשר ניתן לאימות נוסף בvivo. לחקות מצבים פיזיולוגיים. בשל המבנה התלת-מימדי שלהם כמו-כן, מערכת התרבות הזאת קלה יותר לתרבות10, לעומת אחרים במערכות מבחנה כגון מערכת התרבות המונאולייר. ואכן, עם ה-לאומי, קל לשלוט ברמזים חיצוניים חשופים במהלך פיתוח התא, או במהלך התפשטות או הבחנה, על ידי הוספת כמויות מדויקות ומשתנה של גורמי עניין למדיה, כמו גם על ידי נוירוטיורינג מדומה עם סוגי תאים אחרים6. יתר על כן, בהשוואה לתרבויות המונאולייר, בסוכנות לאומי, ניתן להשיג צפיפות תא גבוהה יותר מכמות קטנה של רקמה או עם מספר קטן של תאים, המאפשר למחקרים מקבילים להתבצע, ובכך להקטין את מספר בעלי החיים1.
ה-לאומי היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לבודד ולהרחיב את NSCs11,12,13, ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר התאים הקודמן הקיימים בדגם רקמות נתון5 ואת תדירות התא מקודמת בין תנאים שונים. עם זאת, גם הנוירוספירות ותרבויות המונרוייר אינן מתחשבות בשקט NSCs14. יתרה מזאת, לסוכנות המרכזית יש כמה מגבלות של11,12,13 ותדירות הנוירוספירה הנוצרת תלויה בגורמים רבים, כולל הרכיבים הבינוניים, הליך הניתוח, תהליך הדיסוציאציה11,12,13ומצבור נוירוספירה5. אכן, בתרבות בעלת צפיפות גבוהה, נוירוספירות נוטות לצבור. כתוצאה מכך, יש לנקוט זהירות בעת הערכת מספר התאים הקודמיים במדגם. כדי להתגבר על המגבלות הנ ל, ניתן גם להרחיב את nspcs בודדים ולעבור במונאולייר5,15. חשוב מכך, שימוש ב-לאומי להשוואת תדר התא הקודמי בין תנאים שונים הוא מאוד שימושי ומדויק משום שכל המגבלות הללו מפורשות ודומות בין כל התנאים המבוצעים באותו ניסוי.
ישנם צעדים קריטיים בתרבות נוירוספירה הזקוקים לתשומת לב. בשלב קצירת המוח, הסרה מלאה של קרום המח והבידוד הטוב של נישות הנוירוגניים חיוניים כדי למקסם את הטוהר והתשואה של NSPCs. במהלך הדיסוציאציה לרקמות, בשל פעילות הפרוטחרדה של טריפסין, שימוש מוגזם בטריפסין או בזמני דגירה ארוכים עלולים להוביל לפירוק תאים. יתרה מזאת, יום המעבר הוא קריטי להשגת אוכלוסיה בריאה של הנוירוספירות. הפסדות נוירוספירות עם קוטר גבוה יותר מ-200 יקרומטר משפיע מאוד על הכדאיות, יכולת ההתרבות והדיפרנציאל של nspcs. חשוב מכך, מחזורים ארוכים יותר של מעברים, יותר מ -10 יכול להגביר את חוסר היציבות הגנטית6. יתר על כן, ציפוי עם PDL ו PLD/למינציה עבור SVZ ו-DG תאים, בהתאמה, חיוני כדי להבטיח הגירה תא טוב מתוך נוירוספירות מבלי להתפשר על תהליך הבידול. מבחינת הניתוח האימונוציטוכימיה, זמני דגירה ארוכים יותר עם המישור הבינלאומי יכול לפגוע בצביעת על ידי מיסוך אנטיגנים והגדלת הרקע.
ה-לאומי הוא כלי רב עוצמה לאספקת מקור עקבי ובלתי מוגבל של nspcs למחקרים מחוץ לתחום של התפתחות עצבית ובידול, כמו גם למטרות טיפוליות16,17. ואכן, ניתן ליישם את האפשרות הזאת על מודלים גנטיים והתנהגותיים כדי להבין עוד יותר את המנגנונים המולקולריים והסלולאריים המעורבים בשגשוג nspc ובידול18,19. שיטת זה שימושית גם לבדיקת תרופות ותרכובות שונות20,21,22 וכן לבצע מניפולציות גנטיות19,23 לווסת נכסים לבטחון לאומי. בנוסף לאימונוציטוכימיה, תמלול הפוך תגובת שרשרת פולימראז וניתוח כתמי מערביות ניתן לבצע כדי לגשת RNA וביטוי חלבון, בעוד מחקרים אלקטרופיסיולוגיים והדמיה סידן ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה של הנוירונים נולד חדש21.

שיטת הנוירוספירההראשונהתוארה ב-1992 1,2 ועדיין נותרה כלי ייחודי ורב עוצמה במחקר של תא גזע עצבי (לאומי). הבידוד של NSCs מן האזורים הנוירוגניים הראשי יש בעיות מאתגרות, כי הדרישות לשמור על תאים אלה בתנאים פיסיולוגיים נשארים ברורים למדי. ב-לאומי, תאים הם מתורבתים במדיום מוגדר סרום-ללא כימית עם נוכחות של גורמי גדילה כולל גורם הגידול באפידרמיס (egf) ואת גורם הצמיחה פיברופיצוץ בסיסי (bfgf)1,2,3. תאים הקודמן העצבי (גזע ושלתי) נבחרים באמצעות אלה mitogens מאז תאים אלה הם EGF ו-FGF-תגובה הזנת תקופה של התפשטות פעילה בעוד תאים אחרים, כלומר תאים הבדיל, למות4. התאים המקודמים העצביים לצמוח כמו נוירוספירות, אשר יכול להיות אז החוצה כדי להרחיב עוד יותר את הבריכה של תאים אלה5. חשוב מכך, מאז אלה בתאי גזע העצביים (nspcs) הם רב עוצמה הם מסוגלים להבדיל לתוך שלושה סוגי תאים עיקריים של מערכת העצבים המרכזית (cn): נוירונים, oligodendrocytes הפוך ו אסטרוציטים5.
ה-סוכנות לבטחון לאומי מספקת מקור מתחדש של בלתי מובחן, שניתן להשתמש בו כדי ללמוד מספר תהליכים, כולל הפצת המועצה לבטחון לאומי והתחדשות עצמית, ובידול עצבי וגליאל, בהקשר הפיזיולוגי והמחלה. יתר על כן, במחקרים מחוץ לתחום ניתן להשתמש כדי להעריך את מידת המפרט של מפרט פנימי במהלך פיתוח, כמו גם ללמוד את הפוטנציאל המלא של התאים, על ידי הסרת רמזים חיצוניים הקשורים בסביבה הרגילה שלהם6. מודל הנוירוספירה הוא בעל ערך רב להערכת הרגולטורים הניתנים ליישום, מאחר שתחזוקת התאים בינונית נטולת סרום, הרמזים הסביבתיים מסופקים רק על-ידי התאים המקיפים6. יתר על כן, ב-לאומי, NSPCs מורחב בקלות בתרבות, צפיפות של תאים לאזור הוא גבוה ההרכב הטרוגנית של נוירוספירות יש כמה דמיון vivo נישות6. יתרונות אלה מבוססים היטב הם הסיבה לכך מתודולוגיה זו בשימוש נרחב על ידי חוקרים רבים.
הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט את כל התהליכים מן הבידוד של אוכלוסיית nspc לאחר לידה משני אזורים נוירוגניים הראשי, אזור תת-המוח (svz) ו-היפוקמאליום פיתול כישור (DG), להרחבת התאים הללו כמו נוירוספירות, כמו גם לבידול לתוך נוירונים, אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך. לבסוף, שונה שונים מתוארים גם לצורך גישה לשטיות ולתכונות רב עוצמה של SVZ-ו-DG-הנגזרות NSPCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

שיטת הנוירוספירה היא טכניקה שימושית ביותר לחקר המאפיינים הטבועים של תאי גזע/מחולל מעשה עצבי (NSPCs), כולל התפשטות, התחדשות עצמית וריבוי כדוריות. בתוך המוח לאחר לידה ובוגרים, nspcs נמצאים בעיקר בשני נישות נוירוגניים: אזור תת המוח (svz) רירית החללי הצדדיים ואת האזור התת הגרגירים של פיתול כישור היפוקמאל (DG). הבידוד של נישות הנוירוגניים מהמוח לאחר הלידה מאפשר קבלת כמות גבוהה יותר של NSPCs בתרבות עם יתרון מסוגר של תשואות גבוהות. המגע הקרוב בין התאים שבתוך כל נוירוספירה יוצר מיקרוסביבה שעשויה להידמות לגומחות נוירוגניים. כאן, אנו מתארים, בפרוטרוט, כיצד ליצור תרבויות NEUROSPHERE-ו-DG נגזרות מ-1-3 ימים (P1-3) עכברים, כמו גם מעבר החוצה, להרחבת נוירוספירה. זוהי גישה יתרון מאז שיטת הנוירוספירה מאפשרת דור מהיר של שיבוטים NSPC (6-12 ימים) ותורמת לירידה משמעותית במספר השימוש בבעלי חיים. על ידי ציפוי נוירוספירות בתנאים הדיפרנציאל, אנו יכולים להשיג פסבדו אקראי של תאים מורכב nspcs והבדיל תאים של שונות עצביים שונים (נוירונים, אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך) המאפשר את המחקר של פעולות של גורמים פנימיים או חיצוניים על התפשטות nspc, בידול, הישרדות התא neuritogenesis.

כדורי SVZ ו-DG, המתקבלים באמצעות ה-לאומי, מורכבים מתאים מובחן, חיובי עבור Sox2, גורם שעתוק מעורב ביכולת חידוש עצמי וחיובי עבור nestin, חלבון פילמנט ביניים ביטא NSPCs (איור 1א). בנוסף, ממדים שנגזרו על SVZ יש מימדים גדולים יותר מאשר עמיתיהם DG שלהם (איור 1א). וחשוב מכך, בתנאים מסוימים, SVZ-ו-DG נגזרות NSPCs לעבור מתוך כדורים נוירודוונייר של תאים (איור 1B).
כדי לגשת לקיבולת החידוש העצמי, מבוצעת הגישה של זוג התא מבוסס על הביטוי של Sox2 ו nestin אשר נוטה להעלם בחלוקת תאים המתחילים את תהליך הבידול עם שילוב של סמן של השושלת העצבית כלומר, DCX. באזורים נוירוגניים, ניתן להתבונן בנוכחות Sox2+/+/nestin+/+/dcx-/- מחלקות סימטריות (התחדשות עצמית) (איור 2A1, B1), Sox2/+/nestin-/+/dcx+/- מחלקות א-סימטריות (איור 2A1, B2) ו-Sox2-/-/nestin-/-/nestin+/+ מחלקות סימטריות (איור 2A2, B1).
הפסדות הנוירוספירות מגדילה את התשואה של NSPCs; עם זאת, מוות תאים ב DIV2 שינויים עם הפסמות. למעשה, אחוז התאים PI-חיוביים גדל עם מעבר תאים ב-SVZ (P0:15.6% ± 1.2% לעומת P1:19.2% ± 2.7% לעומת P2:32.35% ± 0.14% לעומת P3:39.6% ± 4.0%) ו-DG (P0:16.31% ± 0.95% לעומת P1:32.1% ± 1.7% לעומת P2:27.42% לעומת P3:32.2% ± 3.1%) (איור 3).
Neuritogenesis ניתן להעריך הנוירונים שהתקבלו מן הבידול של SVZ ו-DG NSPCs בתחילת בידול: DIV1 (איור 4A, D), DIV2 (איור4B, E) ו DIV3 (איור 4C, F). למעשה, כפי שנצפה באיור 4, האורך והרמיפיקציה של הניאוריטים מגדיל את הבידול.
ניתן להעריך את תפוצת התאים בתחומי הנוירוז-ו-DG נגזרות. השוואת נוירוספירות עיקריות הבדיל ב DIV1 מ SVZ (איור 5A1) ו-DG (איור 5A2), אחוז התאים BRDU-חיוביים גבוה יותר ב-SVZ מאשר ב-dg (svz: 6.15% ± 0.64% לעומת dg: 3.27% ± 0.13%; p < 0.05; n = 4; איור 5A3). יתר על כן, בידול התא ניתן גם לגשת על ידי שילוב BrdU מכתים עם יצרנית בוגרת כגון גרעינים עצביים (NeuN) המזהה נוירונים בוגרים (איור 5B1, B2). איור 5B3 מראה כי אחוז מתרבים ושלתי כי להבדיל לנוירונים בוגרים דומה svz ו-dg (svz: 12.04% ± 1.58% vs dg: 13.56% ± 0.48%; p > 0.05; n = 4).
את הסטטיות ואת רב העוצמה של SVZ-ו-DG נגזרות NSPCs ניתן לגשת באמצעות ה-לאומי על ידי הערכת הביטוי של סמנים שונים בימים בידול שונים (DIV2 ו DIV7). אכן, NSCs (nestin-ו גליה החלבון החומצי החומציות [gfap]-כפול-חיובי תאים) נמצאים שני באזורים נוירוגניים (איור 6A, G). תאים אלה מסוגלים להבדיל נוירונים בלתי בוגרים (התאים dcx-חיוביים) (איור 6B, H), נוירונים בוגרים (התאים neun-חיוביים) (איור 6F, L), אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (תא העצב, אנטיגן glial 2 [NG2] ו-טסיות נגזר גורם הצמיחהFigure 6הנגזרתα [pdgfrα] I), oligodendrocytes הפוך בוגרת (חלבון המיאלין בסיסי [mbp]-תאים חיוביים) (איור 6E, K) ו אסטרוציטים (התאים החיוביים gfap) (איור 6D, J).
מצעים שונים ניתן להשתמש כדי שמיכות מעילים כדי ליצור את הפסבדו של תאים תחת תנאים דיפרנציאל. כפי שמוצג באיור המשלים 1, תאי ה-DG להעביר יותר כאשר הכיסויים יש ציפוי נוסף עם למינציה בשילוב עם אש ף או PDL מאשר עם pdl בלבד (איור משלים 1B-H). למעשה, כאשר PDL ו-למינציה משמשים יחד כמו מצעים (המשלים איור 1C, G), התאים DG ליצור מדומה יותר בתאים מאשר בתאי svz אשר בשימוש PDL לבדה (איור המשלים 1C, E).
וחשוב מכך, תוצאות אלו מדגימות את הפוטנציאל של ה-אן. אס. איי להעריך את הסטטיות ואת תכונות רב העוצמה של NSCs הנגזרות משתי גומחות נוירוגניים הראשי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> איור 1: אזור תת-חדרית ו-הדנטט פיתול כישור נגזר nspc תרבותי כמו נוירוספירות או כמו פסבדו. (א) הנציגה ברייטפילד (A1, A3) והתמונות הפלואורסצנטית (A2, A4) של svz-ו-DG, היכן שהגרעינים היו מוכתמים בצבע הואכסט 33342 (כחול) ו-NSCs עבור Sox2 (ירוק) ו-nestin (אדום). (ב) הנציג ברייטפילד דימויים של פסאודוונואולאיירס שנוצר מ-svz-ו-DG-הנגזרים בתנאים הדיפרנציאל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> איור 2: שיטת הזוג התאים. מייצגים תמונות של זוגות תאים. שמקורם במחלקת תאים הגרעינים SVZ ו-DG היו מוכתמים עם Hoechst 33342 (כחול), תאים גזע כמו עבור Sox2 (אדום) ו nestin (לבן) כמו גם נוירונים בוגרים עם DCX (ירוק). ראשי חץ בפאנלים A1 ו-B1 מצביעים על Sox2+/+/nestin+/+/dcx-/- החלוקות לחידוש עצמי סימטרי, חיצים בחלוניות A1 ו-B2 מציינים Sox2+/-/nestin+/-/dcx-/+ מחלקות סימטריות, חיצי קו מקווקווים בחלוניות A2 ו-B1 מציגים Sox2-/-/nestin-/-/nestin+/+ מחלקות סימטריות ממבדילים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> איור 3: ניתוח הישרדות התא עם הפסיית התא. ניתוח כמותי של תאים PI-חיוביים ב-DIV2 ב-SVZ-ו-DG-מובחנים בתרבות הנוירוספירה, לאחר 0, 1, 2 ו-3 קטעים (P0-P3). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM, n = 1/8. PI = propidium יודיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> איור 4: ניתוח נוריטוגנזה בשנת DIV 1, 2 ו-3. הנציג ממוקד תמונות פלואורסצנטית של neurites, מזוהה על ידי βIII-טובולין האות, ב SVZ ו-DG נוירונים ב (A, D) DIV1, (ב, E) DIV2, ו (ג, F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> איור 5: שיטת הפצת תאים. מייצגים של תמונות מיקוד של תאים BrdU-חיוביים ב DIV1 (A1) svz ו (A2) DG. (A3) ניתוח כמותי של תאים BrdU-חיוביים ב DIV1 ב-DG-ו SVZ-נגזר הבדיל תרבות נוירוספירה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM, n = 4. * p < 0.05 על ידי t-test. מייצגים של תמונות זריחה של BrdU-ו NeuN-חיובי תאים ב DIV7 (B1) svz ו (B2) DG. ראשי חץ מציינים תאים BrdU-/Ne-. (B3) ניתוח כמותי של תאים BrdU-/Ne-DIV7 בשני גומחות. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM, n = 4. Brdu: 5-brdu-2'-deoxyuridine, מלאכותי תימידין אנלוגי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> איור 6: סוגי תאים עצביים נמצאים SVZ-ו-DG-הבדיל בתרבות נוירוספירה. מייצגים של תמונות פלואורסצנטית של svz-ו-DG-נגזרות סוגי תאים לאחר 2 ו -7 ימים של בידול נוירוספירה (DIV2 ו DIV7), שבו גרעיני התא היו מוכתמים עם hoechst 33342 (כחול) ו: (A, G) NSCs עבור gfap (ירוק) ו nestin (אדום), (ב, H) נוירונים בוגרים עבור dcx (ירוק), (ג, I) אוליגודנדרוציטים תאים מקודכי עבור pdgfrα (ירוק) ו NG2 (אדום), (ד, J) אסטרוציטים עבור gfap (ירוק), (E, K) בוגרת oligodendrocytes הפוך עבור mbp (ירוק), ו (F, L) בוגרים נוירונים עבור nestin (אדום <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> איור משלים 1: בדיקת מצעים שונים לדבקות נוירוספירה והגירה כדי ליצור פסבדו-מוח. מייצגים של תמונות פלואורסצנטית של (A, E) באמצעות פולי-ליזין כמצע, (ב, F) מפסאודוונוע באמצעות פולי-די-ליזין כמצע, (C, G) הפסאודוונוד dg-d באמצעות פולי-ליזין עם הלימינציה כמצע, ו (ד, ה) dg-D-משתמש באמצעות פולי-די-ליזין עם פולי-אל אורלך כמצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

במאמר זה, אנו מתארים, בפרוטרוט, פרוטוקול עבור הדור של תרבויות נוירוספירה מתאי גזע העכבר הפוסט-לידתיים נגזר של נישות הראשי נוירוגניים העכבר. הנוירוספירות משמשות לזיהוי תאי גזע עצביים מרקמת מוח המאפשרים הערכה של מספרי תאים מקודמי. יתר על כן, אלה מבנים תלת-ממדיים יכול להיות מצופה בתנאים הדיפרנציאל, הענקת הנוירונים, oligodendrocytes הפוך ו astrocytes, המאפשר לימוד של הגורל התא.

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

בדיקת הנוירוספרה שימושית בטכניקת חוץ-חוץ-גוף לחקר המאפיינים הטבועים בתאי גזע/גוף עצביים, כולל התפשטות, התחדשות עצמית ורב-פוטנציה הן בהקשר הפיזיולוגי והן בהקשר הפתולוגי. בשל המבנה התלת מימדי שלה, טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לחקר נוירוגנזה למבוגרים. זה גם שימושי עבור culturing וקבלת תשואות גבוהות יותר של גזע עצבי / תאים מולדים.בדיקה נוירוספרית זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של הפרעות מוחיות כגון אלצהיימר ומחלות פרקינסון או טרשת נפוצה. נוירוספרות ניתן להשיג גם מאזורים אחרים במוח או מערכות, כגון רקמת שומן או המעיים. מדגימה את ההליך עם פיליפה ריבירו תהיה ריטה סוארס, דוקטורנטית בקבוצה שלי.כדי לקצור את היום שלאחר הלידה מוח אחד עד שלושה עכברים, החזק את החלק הגחוני של הגוף בבסיס הראש ולהשתמש במספריים מחודדים קטנים כדי לבצע חתך קו האמצע בעור לאורך כל הראש כדי לחשוף את הגולגולת. בצע חתך אורך בבסיס הגולגולת ולהמשיך לחתוך לאורך התפר sagittal בזווית רדודה ככל האפשר, כדי למנוע פגיעה במבני המוח. השתמש במקלפים מעוקלים כדי לקלף את הגולגולת לצדדים כדי לחשוף את המוח ולהחליק מרית קטנה מתחת למוח כדי לחתוך את עצבי הגולגולת וכלי הדם המחוברים לבסיס המוח.מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי של HBSS קר בתוספת אנטיביוטיקה ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה נמוכה. מקם את המוח על פני הגב שלו. תוך החזקת המוח על ידי המוח הקטן, להשתמש במטסים עדין כדי להסיר קרום המוח מהצד הגחוני של המוח ואת נורות הריח.לסובב את המוח על ההיבט הגחוני לקלף את שאר קרום המוח. לאחר מכן השתמש במקלות כדי להסיר את המוח הקטן ולהשתמש בממטרים מחודדים מעוגלים כדי להעביר את המוח על פיסת נייר מסנן עם נקבובית 11 מיקרומטר על גבי מסוק רקמות. למיקרו-דיסקטקט SVZ ו-DG, יש להתחיל בחיתוך המוח ל-450 מיקרומטר קורונה.השתמשו בלמינה רטובה כדי לאסוף את המוח החתוך לתוך צלחת פטרי חדשה מלאה באנטיביוטיקה קרה בתוספת HBSS תחת מיקרוסקופ מנתח ולהשתמש במקלות כדי להפריד פרוסות קורונאליות בצורה חזיתית לחלק האחורי עד להגיע לפרוסות עם החדרים הצידיים. השתמש מטליות עדין לחתוך את השכבה הדקה של הרקמות המקיפות את הקיר הרוחבי של החדרים, למעט parenchyma striatal ואת כפיס המוח קורפוס ולמקם קצה אחד של המדפים מיד מתחת כפיס המוח והשני לתוך הרקמה מיד סמוך לאזור הגחוני של הגחון הרוחבי כדי לבודד את SVZ. חותכים קו קטן של רקמות המקיפות את החדר הצלבי ולאסוף את הרקמה נותחת לתוך צינור מדגם המכיל פתרון HBSS בתוספת.כאשר כל הפרוסות כבר microdissected עם מטלפים היווצרות ההיפוקמפוס כבר הגיע, להשליך את הפרוסה הראשונה עם ההיפוקמפוס שבו DG הוא עדיין בלתי מזוהה. כדי להסיר את ה- DG, תחילה לבודד את ההיפוקמפוס מהפרוסות ולמקד מחדש את המיקרוסקופ כדי לדמיין את הגבולות סביב DG. כדי לקצור את ה- DG, השתמש במדפים כדי לבצע חתך בין אזור DG ו- CA1 ואחריו חתך אנכי בין אזור DG ו- CA3. לאחר מכן להסיר את פימבריה וכל רקמה סמוכה ולמקום את הרקמה שנקטפה לתוך צינור נפרד של פתרון HBSS בתוספת אנטיביוטיקה.כדי לנטרל את דגימות SVZ ו- DG, הוסף טריפסין-EDTA 0.05% לריכוז סופי של 5-10% של טריפסין-EDTA 0.05% ב HBSS לכל צינור עבור דגירה של כ 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כל השימוש טריפסין או זמן דגירה ארוך מדי יכול להוביל למוות מוגבר של תאים, להשפיע לרעה על צמיחת התא. כאשר הרקמה יש גושים יחד, להחליף את פתרון האנזים במשך ארבע שטיפות רצופות עם מיליליטר אחד של HBSS בתוספת טריים לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, יש לעכל מחדש את הרקמות המתעכלות במיליליטר אחד של מדיום נטול סרום בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה אפידרמלי וחמישה ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי לכל צינור. ואז מכנית לנתק את הרקמות עם צינורות עדינים שבע עד 10 פעמים עם צינור P1000 עד פתרון תא הומוגני הושג. כדי לקבוע את הצפיפות של תא DG או SVG דיסוציאציה, לספור את התאים בכל השעיה על המטוציטומטר.כדי להרחיב את התאים לנוירוספרות, לדלל את אוכלוסיות התאים הבודדים במהירות של פי 10 עד לתאים הרביעיים לצפיפות מיליליטר במדיום נטול סרום בתוספת גורמי גדילה וזרע חמישה מיליליטר של מתלי התא לתוך צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר לא צותת. לאחר מכן הדגירה את תאי SVZ במשך שישה עד שמונה ימים ואת תאי DG במשך 10 עד 12 ימים ב 37 מעלות צלזיוס להיווצרות נוירוספרה ראשונית. כאשר רוב הנוירוספרות יש 150 עד 200 קוטר מיקרומטר, לקצור את ההשעיה התא מן התרבויות ולאסוף את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה.תן מחדש את משטח הנוירוספרה עם ערכת ניתוק כימית של העכבר בהתאם להוראות היצרן לפני איסוף התאים עם צנטריפוגה אחרת. החלף את supernatant עם מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום בתוספת גורמי גדילה בעדינות לנסות לדרג את גלולה על 10 פעמים. לספור את תאי נוירו ניתק כפי שהודגם ו reseed את התאים פעמיים 10 לתאים הרביעית לכל צפיפות מיליליטר במדיום ללא סרום בתוספת גורמי גדילה לתוך חדש 60 מיליליטר פטרי מנות.לאחר מכן להחזיר את התא לאנקובטור תרבות התא במשך שישה עד שמונה או 10 עד 12 ימים נוספים בהתאם לצורך כדי לקבל נוירוספרות משניות. נוירוספרות SVG ו- DG המתקבלות באמצעות בדיקה נוירוספרית מורכבות תאים חיוביים לא מו מופקים Sox2, קינון חיובי. יש לציין, נוירוספרות נגזר SVG יש ממדים גדולים יותר מאשר עמיתיהם DG שלהם.חשוב לציין, בתנאי התבולל, SVG ו DG נגזר גזע עצבי / פגיונרים תאים נודדים מתוך הנוירוספרות, ויוצרים pseudomonolayer של תאים. בשני האזורים הנוירוגניים, ניתן לראות את נוכחותם של Sox2 חיובי כפול, נקין כפול חיובי, כפולקורטין כפול תאים שליליים זוגות תואמים חלוקות סימטריות המעידות על התחדשות עצמית. תאי התאים שבהם תא אחד של Sox2 חיובי, נקין חיובי, ו כפולקורטין שלילי, והתא השני Sox2 שלילי, נקין שלילי, ו כפולקורטין חיובי מדגים חלוקות אסימטריות.וסוקס2 שלילי כפול, נקין שלילי כפול, וזוגות תאים חיוביים כפולים המתאימים לחלוקות סימטריות המעידות על בידול. בסך הכל, מעבר משנה את שיעור התמותה של התאים ביום השני במבחנה. Neuritogenesis ניתן להעריך נוירונים המתקבלים ההידור של SVG ו DG גזע עצבי / תאים מולדים בתחילת ההידור.כפי שנצפה, האורך וההשלכות של neurites עולה עם ההידול. אחוז גבוה של תאים שגשוג נצפתה SVG לעומת DG. למרות שאחוז המופתים המתרבים המבדילים לנוירונים בוגרים דומה בשתי הנישות הנוירוגניות. שני סוגי התאים מסוגלים גם להתבדל לנוירונים לא בוגרים, נייטרונים בוגרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים, אוליגודנדרוציטים בוגרים ואסטרוציטים.לאחר קבלת הנוירוספרות, ניתן לבצע מספר שיטות הכוללות אימונוציטוכימיה, הדמיית סידן, כתמים מערביים ו- RT-PCR כדי לחקור את הגבעול ואת הרב-פוטנציה של תאי הגזע העצבי/האב. ניתן ליישם את הבדיקות הנוירוספריות על מודלים גנטיים ומחלות כדי להעריך עוד יותר את התהליכים המולקולריים והתאיים הכרוכים הן בהתפשטות והן בהידול של תאי גזע עצביים/ סניטריים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

תרבות הנוירוספירות הנגזרות מהנישות הנוירוגניות בערבה בוגרת וול

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...