Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

이 작품은 IF/01227/2015 및 UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018), 그리고 R.S.R.(SFRH/BD/129710/2017)에서 FC십을 받았습니다. 저자는 현미경 검사법 지원을 위한 Instituto de Medicina 분자 João Lobo Antunes에 있는 생물 화상 진찰 시설의 일원에게 감사하고 싶습니다.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

NSPC의 체외 시스템은 세포 및 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있으며, 이는 생체 내에서 더 검증될 수 있습니다. NSA는 그들의 3 차원 구조 때문에 생리적인 조건을 모방하는 아주 강력한 방법입니다. 더욱이, 이러한 배양 시스템은 또한 단층 배양 시스템과 같은 다른 시험관 내 시스템과 비교하여 기술적으로배양(10)이더 쉽다. 실제로, NSA를 사용하면, 세포 발달 동안 노출된 외인성 단서를 조절하기 쉬우며, 확장 또는 분화 단계 동안, 다른 세포 유형으로 신경구를 배양함으로써 뿐만 아니라 미디어에 관심 요인의 정확하고 가변적인 양을 추가함으로써6. 더욱이, 단층 배양에 비해, NSA에서, 소량의 조직 또는 소수의 세포로부터 더 높은 세포 밀도를 얻을 수 있으며, 병렬 연구가 수행될 수 있게 하여, 따라서 동물의 수를 감소시킨다1.
NSA는 NSCs11,,12,,13을분리하고 확장하는 가장 일반적인 방법이며, 주어진 조직 샘플5및 상이한 조건 사이의 전구체 세포 빈도에 존재하는 전구체 세포의 수를 추정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 신경구와 단층 문화 둘 다 정지 NSCs14를고려하지 않습니다. 더욱이, NSA는11,,12,,13 및 생성된 신경구 주파수는 배지 성분, 해부 절차, 해리 과정11,12,,13,및 신경구 응집5를포함하는 많은 인자에 의존한다., 실제로, 고밀도 문화에서, 신경구는 집합하는 경향이 있습니다. 따라서 샘플에서 전구체 셀수를 추정할 때는 주의해야 합니다. 위의 한계를 극복하기 위해, 분리된 NSPC는 또한 단층5,,15로확장 및 통과될 수 있다. 중요한 것은, NSA를 사용하여 서로 다른 조건 들 사이에서 전구체 세포 주파수를 비교하는 것은 이 모든 한계가 암시적이고 동일한 실험에서 수행된 모든 조건 사이에서 유사하기 때문에 매우 유용하고 정확합니다.
주의가 필요한 신경구 문화에는 중요한 단계가 있습니다. 뇌 수확 단계에서, 수막의 완전한 제거와 신경 성 틈새의 좋은 격리는 NSPC의 순도와 수율을 극대화하는 데 필수적입니다. 조직 해리 동안, 트립신의 프로테올분해 활성으로 인해, 트립신의 과도한 사용 또는 더 긴 배양 시간은 세포 용해로 이어질 수 있습니다. 또한, 통로의 날은 신경 구의 건강한 인구를 얻기 위해 중요합니다. 직경이 200 μm 보다 높은 신경구를 통과하는 것은 NSPC의 생존성, 증식 및 분화 능력에 크게 영향을미칩니다. 또한 SVZ 및 DG 세포에 대한 PDL 및 PLD/라미닌코팅은 분화 과정을 손상시키지 않으면서 신경구에서 좋은 세포 이동을 보장하는 데 필수적입니다. 면역 세포 화학 분석의 관점에서, PFA를 가진 더 긴 배양 시간은 항원을 마스킹하고 배경을 증가시킴으로써 염색을 손상시킬 수 있습니다.
NSA는 신경 발달 및 분화뿐만 아니라 치료목적16,,17의시험관 내 연구를 위한 일관되고 무제한의 NSPC 소스를 제공하는 강력한 도구이다. 실제로, 이러한 분석은 NSPC 증식 및 분화에 관여하는 분자 및 세포 기전을 더욱 이해하기 위해 유전적 및 행동 모델에 적용될 수있다 18,,19. 이러한 분석실험은 NSC 특성을 조절하기 위해 다른 약물 및 화합물,23 20,,21,,22뿐만 아니라 유전자 조작을 수행하는데에도유용하다. 면역세포화학 이외에, 역전사 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블롯 분석은 RNA 및 단백질 발현에 접근하기 위해 수행될 수 있으며, 전기생리학 연구 및 칼슘 이미징은 신생뉴런21의기능을 평가하는데 사용될 수 있다.

신경구 분석 (NSA)는 1992년1,,2에서 처음 기술되었으며 여전히 신경 줄기 세포 (NSC) 연구에서 독특하고 강력한 도구로 남아 있습니다. 주요 신경 발생 지역에서 신경 세포의 격리는 생리적 조건에서 이러한 세포를 유지하기 위한 요구 사항이 제대로 이해되지 않아 어려운 문제가 있습니다. NSA에서, 세포는 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함하는 성장 인자의 존재와 함께 화학적으로 정의된 무혈청 배지에서 배양된다1,,2,,3. 신경 전구체 세포(stem 및 전구체)는 이들 세포가 EGF 및 FGF-반응성 다른 세포, 즉 분화세포, 즉 분화세포, 다이4동안활성 증식의 기간에 진입하기 때문에 이들 미토겐을 이용하여 선택된다. 신경 전구체 세포는 신경구로서 성장하며, 이는 이들 세포의 풀을 더 확장하기 위해 통과될 수 있다5. 중요한 것은, 이들 신경줄기 전구세포(NSPC)가 다능하기 때문에 중추신경계(CNS)의 3대 세포 유형으로 분화할 수 있다:뉴런, 올리고헨드로시트 및 성상세포5.
NSA는 생리학적 및 질병 맥락에서 NSC 증식 및 자기 갱신, 신경 및 신경교 분화를 포함한 여러 프로세스를 연구하는 데 사용할 수 있는 미분화 CNS 전구체의 재생 가능한 공급원을 제공합니다. 더욱이, 시험관내 연구는 발달 동안 신경 전구체에 존재하는 본질적인 명세의 정도를 평가하고, 세포의 완전한 잠재력을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 그들의 정상 환경과 관련된 외적 단서를 제거함으로써6. 신경구 모델은 혈청이 없는 배지에서 세포를 유지함으로써, 환경 큐는 주변세포6에의해서만 제공되기 때문에 가제 조절제를 평가하는 데 유용하다. 더욱이, NSA에서 NSPC는 배양에서 용이하게 확장되고, 영역당 세포의 밀도가 높고, 신경구의 이질적인 조성은 생체 내 틈새와 약간의 유사성을 갖는다6. 이러한 잘 확립 된 장점은이 방법론이 많은 연구자들에 의해 널리 사용되는 이유입니다.
다음 프로토콜은 두 가지 주요 신경 발생 영역, 심실 영역 (SVZ) 및 해마 치과 자이러스 (DG)에서 산후 NSPC 집단의 격리에서부터 신경 구체로서의 세포의 확장뿐만 아니라 뉴런, 성상 세포 및 올리고덴드로질로의 분화에 이르기까지 모든 과정을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 상이한 세포는 또한 SVZ- 및 DG 유래 NSPC의 줄기 및 다기능 특성에 접근하기 위해 기술된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

신경구 분석법은 증식, 자기 갱신 및 다능성을 포함하는 신경 줄기/전구 세포 (NSPC)의 고유 특성을 연구하기 위한 매우 유용한 시험관 내 기술입니다. 산후 및 성인 두뇌에서, NSPC는 2개의 신경성 틈새에 주로 존재합니다: 심실 영역 (SVZ) 외측 심실 및 해마 치과 자이러스의 자궁 내부 영역 (DG). 출생 후 뇌에서 신경 성 틈새 의 격리 는 더 높은 수율의 결과적인 이점과 문화에서 NSPC의 높은 금액을 얻을 수 있습니다. 각 신경구 내의 세포 사이 가까운 접촉은 신경성 틈새 시장을 닮을 수 있는 미세 환경을 만듭니다. 여기서, 우리는 1-3 일 (P1−3) 마우스에서 SVZ- 및 DG 유래 신경구 배양권뿐만 아니라, 신경구 확장을 위한 통과를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이것은 신경구 분석실험이 NSPC 클론(6-12일)의 빠른 생성을 허용하고 동물 사용의 수를 현저하게 감소시키기 때문에 유리한 접근법이다. 분화 한 조건에서 신경 구를 도금함으로써, 우리는 NSPC 증식, 분화, 세포 생존 및 신생에 대한 본질적 또는 외인적 인자의 행동을 연구 할 수 있도록 NSPC와 다른 신경 계보 (뉴런, 성상 세포 및 올리고드로시스트)의 분화 된 세포로 구성된 세포의 의사 단독 층을 얻을 수 있습니다.

NSA를 사용하여 얻어진 SVZ 및 DG 신경구는 미분화 세포로 구성되며, Sox2에 대한 양성, 자가 재생 능력에 관여하는 전사 인자 및 네스팅에 대한 양성, NSPC에서 발현되는 중간 필라멘트단백질(그림 1A). 또한, SVZ 유래 신경구는 그들의 DG 대응물보다 더 큰 치수를갖는다(그림 1A). 중요한 것은, 분화성 조건에서, SVZ- 및 DG 유래 NSPC는 세포의 의사 단층층을 형성하는 신경구에서 이동한다(그림 1B).
자가 재생 용량에 액세스하기 위해, 세포 쌍 분석기는 Sox2 및 네스텐의 발현에 기초하여 수행되며 이는 즉, DCX의 마커와 함께 분화 과정을 시작하는 세포를 분할하여 사라지는 경향이 있다. 두 신경 성 영역에서, Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- 대칭 부문 (자체 갱신)(그림 2A1,B1),Sox2-/+/네스트틴의 존재를 관찰할 수 있습니다./+/DCX+/- 비대칭 부문(그림 2A1, B2)및 Sox2-/-/네스팅-/-/DCX+/+ 대칭 부문(그림2A2,B1).
신경구를 통과하면 NSPC의 수율이 증가합니다. 그러나 DIV2에서의 세포 사멸은 통과와 함께 변경됩니다. 실제로, PI 양성 세포의 백분율은 SVZ에서 세포 통과와 함께 증가된다 (P0: 15.6% ± 1.2% vs P1: 19.2% ± 2.7% 대 P2: 32.35% ± 0.14% vs P3: 39.6% ± 4.0%) 및 DG에서 (P0: 16.31% ± 0.95% vs P1: 32.1% ± 1.7% vs P2: 27.42% 대 P3: 32.2% ± 3.1%) (그림3).
신경발생은 분화의 시작 시에 SVZ 및 DG NSPC의 분화로부터 수득된 뉴런에서 평가될 수 있다: DIV1(도 4A, D),DIV2(도 4B, E)및 DIV3(도 4C, F). 사실, 도 4에서관찰된 바와 같이, 신경염의 길이 및 파급효과는 분화에 따라 증가한다.
세포 증식은 SVZ-및 DG 유래 신경구에서 평가될 수 있다. Div1에서 1차 분화 신경구를 SVZ(그림5A1)및 DG(그림5A2)에서비교하는 경우, BrdU 양성 세포의 비율은 DG(SVZ: 6.15% ± 0.64% 대 DG: 3.27% ±0.13%, p & 0.05; n=4; 그림 5A3). 더욱이, 세포 분화는 또한 BrdU 염색을 성숙한 뉴런을 식별하는 뉴런 핵(NeuN)과 같은 성숙한 제조사와 결합함으로써 접근할 수있다(도 5B1,B2). 도 5B3는 성숙한 뉴런으로 분화하는 증식 선조의 비율이 SVZ 및 DG에서 유사하다는 것을 보여준다(SVZ: 12.04% ± 1.58% 대 DG: 13.56% ± 0.48% ; p > 0.05; n= 4).
SVZ-및 DG 유래 NSPC의 줄기 및 다중 포력은 상이한 분화 일(DIV2 및 DIV7)에서 상이한 마커의 발현을 평가함으로써 NSA를 사용하여 접근할 수 있다. 실제로, NSC(네스테인-및 신경교 섬유성 단백질[GFAP]-이중 양성 세포)는 두 신경발생 영역 모두에존재한다(도 6A,G). 이들 세포는 미성숙 뉴런(DCX 양성 세포)(그림6B,H),성숙한 뉴런(NeuN 양성 세포)(그림 6F,L),올리고덴드로시테 전구체 세포(뉴런-신경교항원 2[NG2] 및 혈소판 유래)로 분화할 수 있다. 성장 인자 수용체 α [PDGFRα]-양성 세포)(도 6C,I),성숙한 올리고엔드로시트 (미엘린 기본 단백질 [MBP]-양성 세포)(그림 6E,K)및 성상 세포 (GFAP 양성 세포)(그림 6D,J).
상이한 기질은 커버립을 코팅하여 분화 조건 하에서 세포의 의사 단일층을 형성하는 데 사용될 수 있다. 보충 도 1에도시된 바와 같이, DG 세포는 PDL 단독보다 PLO 또는 PDL과 결합된 라미닌으로 엑스트라 코팅을 할 때 더 많이 이동한다(보충도 1B−H). 실제로, PDL과 라미닌이 기판으로 함께 사용될 때(보충 도 1C, G),DG 세포는 PDL이 단독으로 사용되는 SVZ 세포보다 더 많은 수민단층을 형성한다(보충도1A,E).
중요한 것은, 이러한 결과는 두 가지 주요 신경발생 틈새에서 유래된 NSC의 줄기 및 다기능 특성을 평가하는 NSA의 잠재력을 입증한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> 그림 1: 심실 영역 및 치과 자이러스 유래 NSPC는 신경구 또는 가명 단층으로 배양되었다. (A)대표적인브라이트필드(A1,A3)및형광(A2,A4)SVZ-및 DG 유래 신경구의 이미지, 여기서 핵은 Hoechst 33342(파란색)와 Sox2(녹색)와 네스틴(빨간색)에 대한 NSC로 염색되었다. (B)분화 조건 하에서 SVZ- 및 DG 유래 신경구에서 생성된 의사 단층의 대표적인 브라이트필드 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> 도 2: 세포 쌍 분석. 전구 세포 분열로부터 유래된 세포 쌍의 대표적인 형광 이미지. SVZ 및 DG 핵은 Hoechst 33342 (파란색), Sox2 (빨간색) 및 네스틴 (흰색)뿐만 아니라 DCX (녹색)를 가진 미성숙 뉴런에 대한 줄기 유사 세포로 염색되었습니다. 패널 A1 및 B1의 화살촉은 Sox2+/+/네스트틴+/+/DCX-/- 대칭 자체 갱신 부문을 나타냅니다. 패널 A1 및 B2의 화살표는 Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ 비대칭 분할, 패널 A2 및 B1의 파선 화살표를 나타내며 Sox2-/-네스팅-/-DCX+/+ 대칭 차별화 구분을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> 그림 3: 세포 통과를 가진 세포 생존 분석. SVZ-및 DG 유래 분화 신경구 배양에서 DIV2에서의 PI 양성 세포의 정량적 분석은 0, 1, 2 및 3 대후(P0−P3) 후에. 데이터는 평균 ± SEM, n = 1−8로 표현된다. PI = 프로피듐 요오드화물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> 그림 4: DIV 1, 2 및 3에서의 신발생 분석. βIII-tubulin 신호에 의해 확인된 신경염의 대표적인 공초점 형광 이미지는, SVZ 및 DG 뉴런에서(A,D)DIV1,(B,E)DIV2 및(C,F)DIV3에서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> 도 5: 세포 증식 분석. DIV1에서 BrdU 양성 세포의 대표적인 공초점 이미지(A1)SVZ 및(A2)DG. (A3) DG-및 SVZ 유래 분화 신경구 배양에서 DIV1에서 BrdU 양성 세포의 정량적 분석. 데이터는 평균 ±SEM, n=4로 표현된다. * p < 0.05 t-테스트에 의해. 대표적인 뇌-및 뉴엔 양성 세포의 대표적인 형광 이미지는 DIV7에서(B1)SVZ 및(B2)DG에서. 화살촉은 BrdU-/NeuN 양성 세포를 나타냅니다. (B3) 두 틈새 시장에서 DIV7에서 BrdU-/NeuN 양성 세포의 정량분석. 데이터는 평균 ±SEM, n=4로 표현된다. BrdU: 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 합성 티미딘 유사체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> 도 6: SVZ-및 DG 유래 분화 신경구 배양에 존재하는 신경 세포 유형. SVZ- 및 DG 유래 세포 유형의 대표적인 형광 이미지는 2 및 7일 후 신경구 분화(DIV2 및 DIV7)를 거쳐, 세포 핵이 Hoechst 33342(파란색)로 염색된 후:(A,G)GFAP(녹색) 및 네스틴(적색)및네스틴(적색) NSC DX(녹색),(C,I)올리고벤드로시테 전구체 세포는 PDGFRα(녹색) 및 NG2(빨강) 및(D,J)GFAP용 성상세포(녹색),(E,K)MBP(녹색)에 대한 성숙한 올리고젠드로시테(green), 및(F,L)NeuN(적색)에 대한 성숙한 뉴런이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> 보충 그림 1: 신경구 준수 및 이동에 대한 다른 기질을 테스트하여 의사 모노레이어를 형성합니다. 대표적인 형광 이미지(A,E)SVZ 유래 의사 단층기로서 폴리-D-리신을 사용하여,(B,F)DG 유래 의사단층은 폴리-D-리신을 기판으로,(C,G)다중-D-리신을 기판으로 사용하는 DG 유래 의사단층, 및(D,H)다중-L-L-L을 이용한 폴리-D-리신을 이용한 DG 유래 의사단층이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

신경권 분석법은 생리학적 및 병리학적 맥락에서 증식, 자기 재생 및 다효능을 포함한 신경 줄기/전구 세포의 내재된 특성을 연구하기 위한 체외 기법에 유용합니다. 3차원 구조로 인해 이 기술은 성인 신경 발생을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 또한 배양 하 고 신경 줄기/전구 세포의 높은 수율을 얻기 에 대 한 유용.이 신경권 분석은 알츠하이머병과 파킨슨 병 또는 다발성 경화증과 같은 뇌 질환연구에 적용될 수 있습니다. 신경구는 또한 다른 두뇌 지구 또는 시스템에서 얻을 수 있습니다., 지방 조직 또는 창 자 등. 필리핀 리베이로와 함께 절차를 시연하는 것은 리타 소아레스, 내 그룹에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.산후 날부터 3개의 마우스 두뇌를 수확하기 위해, 머리 의 밑에 바디의 복부 부분을 잡고 두개골을 드러내기 위하여 머리의 전체 길이에 있는 피부에 있는 중간 절개를 만들기 위하여 작은 뾰족한 가위를 이용합니다. 두개골 의 바닥에 세로 절개를하고 뇌 구조를 손상시키지 않도록 가능한 한 얕은 각도에서 간구 봉합사를 따라 절단을 계속합니다. 구부러진 집게를 사용하여 두개골을 측면에 껍질을 벗기고 뇌 의 밑에 작은 주걱을 밀어 뇌의 기지에 연결된 두개골 신경과 혈관을 잘라냅니다.항생제로 보충 된 차가운 HBSS의 페트리 접시에 뇌를 넣고 낮은 배율에서 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 등대 표면에 뇌를 배치합니다. 소뇌에 의해 뇌를 들고있는 동안, 뇌와 후각 전구의 복부 측에서 수막을 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다.뇌를 복부 측면으로 회전시키고 나머지 수막을 벗겨냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 소뇌를 제거하고 구부러진 뾰족한 집게를 사용하여 조직 헬기 위에 11 마이크로미터 기공을 가진 필터 용지 조각으로 뇌를 옮겨냅니다. SVZ 및 DG 미세 절의 경우 뇌를 450 마이크로미터 관상 섹션으로 자르는 것으로 시작합니다.젖은 라미나는 절제된 뇌를 해부 현미경으로 보충한 차가운 항생제 로 채워진 새로운 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 측삭 심실이 있는 슬라이스에 도달할 때까지 앞쪽에서 후방 방식으로 관상 동맥 조각을 분리합니다. 미세 한 집게를 사용하여 심실의 측면 벽을 둘러싼 조직의 얇은 층을 잘라, striatal parenchyma와 코퍼스 callosum을 제외하고, 즉시 코퍼스 callosum 아래에 집게의 한 끝을 배치하고 다른 하나는 SVZ를 분리하기 위해 측면 심실의 복부 영역에 인접한 조직에 즉시 배치합니다. 측면 심실을 둘러싼 작은 조직의 라인을 잘라 보충 HBSS 용액을 포함하는 샘플 튜브로 해부 된 조직을 수집합니다.모든 슬라이스가 집게와 해마 형성으로 미세 해부되었을 때 DG가 여전히 인식할 수없는 해마로 첫 번째 조각을 폐기하십시오. DG를 제거하려면 먼저 해마를 슬라이스에서 분리하고 현미경에 다시 초점을 맞추어 DG 주변의 테두리를 시각화합니다. DG를 수확하려면 집게를 사용하여 DG와 CA1 영역 을 잘라내고 DG와 CA3 영역 사이의 수직 절단을 합니다. 그런 다음 펨브리아와 인접한 조직을 제거하고 수확한 조직을 항생제 보충제 HBSS 용액의 별도의 튜브에 배치합니다.SVZ 및 DG 샘플을 분리하려면 트립신-EDTA0.05%를 HBSS에 0.05%의 최종 농도에 0.05%를 추가하여 섭씨 37도에서 약 50분 간 배양합니다. 트립신 또는 너무 긴 잠복기의 전체 사용은 세포 성장에 부정적인 영향을 미치는 증가 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 조직이 함께 뭉쳐지면 효소 용액을 4 연속 세척용으로 교체하여 세척당 신선한 보충 HBSS 1밀리리터로 바꿉니까.마지막 세척 후, 혈청없는 매체의 1 밀리리터에 소화 된 조직을 다시 일시 중단 표피 성장 인자의 밀리리터 당 10 나노 그램과 튜브 당 기본 섬유 아세포 성장 인자의 밀리리터 당 5 나노 그램. 그런 다음 동질세포 용액이 얻어질 때까지 P1000 파이펫으로 7~10회 부드러운 파이펫으로 조직을 기계적으로 분리한다. 해리된 DG 또는 SVG 셀의 밀도를 결정하려면 각 현탁액의 세포를 혈중세포계에서 계산합니다.신경구로 세포를 확장하려면, 성장 인자와 함께 보충 세럼없는 매체에 밀리리터 밀도 당 네 번째 세포 당 두 배 10에서 개별 세포 인구를 희석하고 코팅되지 않은 60 밀리미터 직경 페트리 접시에 세포 현탁액의 씨앗 5 밀리리터. 그런 다음 SVZ 세포를 6~8일 동안 배양하고 DG 세포는 1차 신경권 형성을 위해 섭씨 37도에서 10~12일 동안 배양한다. 신경구의 대다수가 150 에서 200 마이크로미터 직경을 가지고 있을 때, 배양에서 세포 현탁액을 수확하고 원심분리에 의해 신경구를 수집합니다.다른 원심 분리로 세포를 수집하기 전에 제조업체의 지시에 따라 마우스 화학 해리 키트로 신경 구 팔레트를 다시 중단하십시오. 상체를 성장 요인으로 보충한 세럼이 없는 매체의 1밀리리터로 대체하고 펠릿을 약 10회 부드럽게 평가하십시오. 해리된 신경 세포를 입증된 대로 계산하고 새로운 60 밀리리터 페트리 접시로 성장 인자로 보충된 혈청 이없는 배지의 밀리리터 밀도당 4번째 세포에 2회 10회에서 세포를 재시드한다.그런 다음 이차 신경구를 얻기 위해 적절히 6 8 일 또는 10 일 에서 12 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 세포를 반환합니다. 신경권 분석체를 이용하여 얻은 SVG 및 DG 신경구는 미분화된 Sox2 양성, 네신 양성 세포로 구성된다. 특히, SVG 유래 신경구는 DG 보다 더 큰 치수를 가지고 있습니다.중요한 것은, 분화 조건하에서, SVG 및 DG 유래 신경 줄기/선조 세포는 신경구에서 이동하여 세포의 의사단층을 형성한다. 두 신경발생 부위모두에서, 스스로 재생을 나타내는 대칭 분열에 대응하는 Sox2 이중 양성, 네틴 이중 양성, 이중 코르틴 이중 음세포 쌍의 존재를 관찰할 수 있다. 세포쌍은 Sox2 양성, 네스트린 양성 및 이중 코르틴 음성의 한 세포, 및 다른 세포 Sox2 네거티브, 네스트린 네거티브 및 이중 코르틴 양성 비대칭 분열을 입증하는 쌍을 이.및 Sox2 이중 음수, 네신틴 이중 음수 및 이중 코르틴 이중 양성 세포 쌍은 분화를 나타내는 대칭 분열에 해당한다. 전반적으로, 패혈증은 체외에서 둘째 날에 세포 사망률을 변경합니다. Neuritogenesis는 분화의 시작 부분에 SVG 및 DG 신경 줄기/전구 세포의 분화에서 얻은 뉴런에서 평가될 수 있다.관찰된 바와 같이, 중성염의 길이와 파급효과는 분화와 함께 증가한다. 증식 세포의 높은 비율은 DG에 비해 SVG에서 관찰된다. 성숙한 뉴런으로 분화하는 증식 선조의 비율은 신경성 틈새 시장 모두에서 유사합니다. 두 세포 유형 은 또한 미성숙 뉴런으로 분화 할 수 있습니다, 성숙한 중성자, 올리고 드로키테스 전구 세포, 성숙한 올리고드로키테스, 그리고 성상 세포.신경구를 얻은 후 면역 세포 화학, 칼슘 이미징, 서양 얼룩 및 RT-PCR을 포함한 여러 가지 방법이 신경 줄기/전구 세포의 줄기 및 다효능을 연구하기 위해 수행될 수 있다. 신경권 분석체는 신경 줄기/전구 세포의 증식 및 분화 모두에 수반되는 분자 및 세포 과정을 더욱 평가하기 위해 유전 및 질병 모델에 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...