Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fikk et fellesskap fra FCT. Forfatterne vil gjerne takke medlemmene av bioimaging anlegget ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi hjelp.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

In vitro systemer av NSPCs tillate en bedre forståelse av cellulære og molekylære mekanismer, som kan ytterligere valideres i vivo. NSA er en svært kraftig metode for å etterligne fysiologiske forhold på grunn av deres tredimensjonale struktur. Videre er dette kultursystemet også teknisk enklere å kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer som monolayerkultursystemet. Faktisk, med NSA, er det lett å kontrollere de eksponerte extrinsic signaler under celleutvikling, enten under utvidelsen eller differensieringsfasen, ved å legge til nøyaktige og variable mengder faktorer av interesse for media, samt ved å kule nevrosfærer med andre celletyper6. Videre, sammenlignet med monolayer kulturer, i NSA, er det mulig å få en høyere celletetthet fra en liten mengde vev eller med et lite antall celler, slik at parallelle studier kan utføres, og dermed redusere antall dyr1.
NSA er den vanligste metoden for å isolere og utvide NSCer11,12,13, kan brukes til å estimere antall forløperceller som finnes i en gitt vevsprøve5 og forløpercellefrekvensen mellom ulike forhold. Imidlertid gjør både nevrosfærer og monolayer kulturer ikke redegjøre for quiescence NSCs14. Videre har NSA noen begrensninger11,12,13 og den resulterende nevrosfærefrekvensen avhenger av mange faktorer, inkludert mellomstore komponenter, disseksjonsprosedyren, dissosiasjonsprosessen11,12,13, og nevrosfæreaggregasjon5. Faktisk, i en høy tetthet kultur, nevrosfærer har en tendens til å aggregere. Forsiktighet må derfor utvises ved estimering av antall forløperceller i en prøve. For å overvinne de ovennevnte begrensningene, kan isolerte NSPCer også utvides og overføres i et monolag5,15. Viktigere, ved hjelp av NSA for å sammenligne forløpercellefrekvens mellom ulike forhold er svært nyttig og nøyaktig fordi alle disse begrensningene er implisitte og like blant alle forhold som utføres i samme eksperiment.
Det er kritiske skritt i nevrosfærekulturen som trenger oppmerksomhet. I hjernen høsting trinn, fullstendig fjerning av meninges og god isolering av nevrogene nisjer er avgjørende for å maksimere renheten og utbyttet av NSPCs. Under vevdissosiasjon, på grunn av proteolytisk aktivitet av trypsin, kan overdreven bruk av trypsin eller lengre inkubasjonstider føre til cellelysis. Videre er dagen for passasjen avgjørende for å oppnå en sunn populasjon av nevrosfærer. Passering av nevrosfærer med en diameter høyere enn 200 μm påvirker i stor grad levedyktigheten, proliferative og differensierende kapasiteten til NSPCer. Viktigst, lengre sykluser av passasjer, mer enn 10 kan øke genetisk ustabilitet6. Videre er belegg med PDL og PLD / laminin for SVZ og DG-celler, henholdsvis avgjørende for å sikre god cellemigrasjon ut av nevrosfærene uten å gå på akkord med differensieringsprosessen. Når det gjelder immuncytokjemianalysen, kan lengre inkubasjonstider med PFA kompromittere farging ved å maskere antigenene og øke bakgrunnen.
NSA er et kraftig verktøy for å gi en konsekvent og en ubegrenset kilde til NSPCer for in vitro studier av neural utvikling og differensiering samt for terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analysen brukes på genetiske og atferdsmessige modeller for å ytterligere forstå molekylære og cellulære mekanismer involvert i NSPC-spredning og differensiering18,19. Denne analysen er også nyttig for å teste ulike stoffer og forbindelser20,21,22 samt å utføre genetiske manipulasjoner19,23 å modulere NSC egenskaper. I tillegg til immuncytokjemi kan omvendt transkripsjonpolymerasekjedereaksjon og vestlig blotanalyse utføres for å få tilgang til RNA og proteinuttrykk, mens elektrofysiologiske studier og kalsiumavbildning kan brukes til å evaluere funksjonen til de nyfødte nevronene21.

Neurosphere analysen (NSA) ble først beskrevet i 19921,2 og fortsatt er et unikt og kraftig verktøy i neural stamcelle (NSC) forskning. Isoleringen av NSCer fra de viktigste nevrogene regionene har utfordrende problemer fordi kravene til å opprettholde disse cellene i fysiologiske forhold forblir dårlig forstått. I NSA, celler er kultivert i et kjemisk definert serum-fritt medium med tilstedeværelse av vekstfaktorer inkludert epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF)1,2,3. Neural forløper celler (stamceller og stamfarer) er valgt ved hjelp av disse mitogener siden disse cellene er EGF og FGF-responsive inn en periode med aktiv spredning mens andre celler, nemlig differensierte celler, dø4. Nevrale forløperceller vokser som nevrosfærer, som deretter kan gå stilutfor for å utvide bassenget av disse cellene5. Viktigere, siden disse nevrale stamceller (NSPCer) er multipotente de er i stand til å skille seg inn i de tre store celletyper av sentralnervesystemet (CNS): nevroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA gir en fornybar kilde til udifferensierte CNS-forløpere, som kan brukes til å studere flere prosesser, inkludert NSC-spredning og selvfornyelse, og nevronal og glial differensiering, i både fysiologisk og sykdomssammenheng. Videre kan in vitro studier brukes til å evaluere graden av egenspesifikasjon som finnes i nevrale forløpere under utvikling, samt å studere det fulle potensialet til cellene, ved å fjerne extrinsic signaler forbundet med deres normale miljø6. Nevrosfæremodellen er verdifull for å evaluere antatte regulatorer siden ved å opprettholde cellene i et medium blottet for serum, er miljøsignaler bare gitt av de omkringliggende cellene6. Videre, i NSA, NSPCs er lett utvidet i kultur, tettheten av celler per område er høy og heterogene sammensetningen av nevrosfærene har noen likhet med in vivo nisjer6. Disse veletablerte fordelene er grunnen til at denne metodikken har blitt mye brukt av mange forskere.
Følgende protokoll beskriver i detalj alle prosessene fra isolasjon av postnatal NSPC-populasjon fra de to viktigste nevrogene regionene, subventrikulær sone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til utvidelse av disse cellene som nevrosfærer, samt differensiering i nevroner, astrocytter og oligodendrocytes. Til slutt er ulike analyser også beskrevet for å få tilgang til stilkog multipotensegenskaper av SVZ- og DG-avledede NSPCer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

Nevrosfæreanalysen er en svært nyttig in vitro-teknikk for å studere de iboende egenskapene til nevrale stamceller /stamceller (NSPCer) inkludert spredning, selvfornyelse og multipotens. I den postnatale og voksne hjernen er NSPCer hovedsakelig tilstede i to nevrogene nisjer: subventrikulær sone (SVZ) som fôrer de laterale ventriklene og den subgranulære sonen til hippocampal dentate gyrus (DG). Isoleringen av de nevrogene nisjene fra postnatal hjerne gjør det mulig å oppnå en høyere mengde NSPCer i kultur med en påfølgende fordel av høyere avkastning. Den nære kontakten mellom celler i hver nevrosfære skaper et mikromiljø som kan ligne nevrogene nisjer. Her beskriver vi, i detalj, hvordan å generere SVZ- og DG-avledede nevrosfærekulturer fra 1-3-dagers gamle (P1-3) mus, samt passaging, for neurosphere ekspansjon. Dette er en fordelaktig tilnærming siden nevrosfæreanalysen tillater en rask generasjon NSPC-kloner (6-12 dager) og bidrar til en betydelig reduksjon i antall dyrebruk. Ved plating av nevrosfærer i differensierende tilstander, kan vi få et pseudomonolayer av celler som består av NSPCer og differensierte celler av forskjellige nevrale slekter (nevroner, astrocytter og oligodendrocytes) slik at studien av handlingene til iboende eller extrinsic faktorer på NSPC proliferasjon, differensiering, celleoverlevelse og neuritogenesis.

SVZ og DG nevrosfærer, oppnådd ved hjelp av NSA, består av udifferensierte celler, positivt for Sox2, en transkripsjonsfaktor involvert i selvfornyelseskapasiteten og positiv for nestin, et mellomliggende filamentprotein uttrykt i NSPCer (figur 1A). I tillegg har SVZ-avledede nevrosfærer større dimensjoner enn sine DG-kolleger (figur 1A). Viktigere, i differensierende forhold migrerer SVZ- og DG-avledede NSPCer ut av nevrosfærer som danner et pseudomonolayer av celler (figur 1B).
For å få tilgang til selvfornyelseskapasiteten utføres celleparanalysen basert på uttrykk for Sox2 og nestin som har en tendens til å forsvinne i å dele celler som starter differensieringsprosessen med en kombinasjon av en markør for nevronal avstamning nemlig DCX. I begge nevrogene regioner, Det er mulig å observere tilstedeværelsen av Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske divisjoner (selvfornyelse) (Figur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/D CX+/- asymmetriske divisjoner (Figur 2A1,B2) og Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriske divisjoner (differensiering) (Figur 2A2,B1).
Passaging nevrosfærene øker utbyttet av NSPCer; Celledød ved DIV2 endres imidlertid med passering. Faktisk økes prosentandelen av PI-positive celler med cellepassasje i SVZ (P0: 15,6 % ± 1,2 % vs P1: 19,2 % ± 2,7 % vs P2: 32,35 % ± 0,14 % vs P3: 39,6 % ± 4,0 %) og i DG (P0: 16,31 % ± 0,95 % vs P1: 32,1 % ± 1,7 % vs P2: 27,42 % vs P3: 32,2 % ± 3,1 %) (Figur 3).
Neuritogenesis kan evalueres i nevroner hentet fra differensiering av SVZ og DG NSPCer i begynnelsen av differensiering: DIV1 (Figur 4A,D), DIV2 (Figur 4B,E) og DIV3 (Figur 4C,F). Faktisk, som observert i figur 4, øker lengden og forkonsekvensen av neurites med differensiering.
Cellespredning kan evalueres i SVZ- og DG-avledede nevrosfærer. Sammenligning av primære differensierte nevrosfærer ved DIV1 fra SVZ (Figur 5A1) og DG (Figur 5A2)er prosentandelen av BrdU-positive celler høyere i SVZ enn i DG (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % vs DG: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Figur 5A3). Videre kan celledifferensiering også nås ved å kombinere BrdU-farging med en moden produsent som nevronale kjerner (NeuN) som identifiserer modne nevroner (figur 5B1,B2). Figur 5B3 viser at prosentandelen av prolifererende stamfarer som differensierer til modne nevroner er lik i SVZ og DG (SVZ: 12,04 % ± 1,58 % vs. DG: 13,56 % ± 0,48 %; p > 0,05; n = 4).
Stilkheten og multipotensen til SVZ- og DG-avledede NSPCer kan nås ved hjelp av NSA ved å evaluere uttrykket for forskjellige markører ved forskjellige differensieringsdager (DIV2 og DIV7). Faktisk er NSCer (nestin- og glial flimmersyreprotein [GFAP]-dobbeltpositive celler) tilstede i begge nevrogene regioner (figur 6A,G). Disse cellene er i stand til å differensiere til umodne nevroner (DCX-positive celler) (Figur 6B,H), modne nevroner (NeuN-positive celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte forløperceller (neuron-glial antigen 2 [NG2] og blodplate-avledet vekstfaktor reseptor α [PDGFRα]- positive celler) (Figur 6C,I), modne oligodendrocytes (myelin grunnleggende protein [MBP]-positive celler) (Figur 6E, K) og astrocytter (GFAP-positive celler) ( Figur6D, J).
Ulike substrater kan brukes til å belegge coverslips for å danne pseudomonolayer av celler under differensierende forhold. Som vist i tilleggsfigur 1,migrerer DG-celler mer når dekksedlene har ekstra belegg med laminin kombinert med PLO eller PDL enn med PDL alene (Tilleggsfigur 1B-H). Faktisk, når PDL og laminin brukes sammen som substrater (Supplerende figur 1C, G), DanneD-celler en mer confluent pseudomonolayer enn SVZ celler som PDL brukes alene (Supplerende figur 1A, E).
Viktigere, disse resultatene viser potensialet i NSA å evaluere stemness og multipotens egenskaper av NSCs avledet fra de to viktigste nevrogene nisjer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figur 1: Subventrikulær sone og dentate gyrus avledet NSPC dyrket som nevrosfærer eller som pseudomonolag. (A) Representative brightfield (A1,A3) og fluorescens (A2,A4) bilder av SVZ- og DG-avledede nevrosfærer, hvor kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå) og NSCer for Sox2 (grønn) og nestin (rød). (B) Representative brightfield bilder av pseudomonolayers generert fra SVZ- og DG-avledede nevrosfærer under differensierende forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Figur 2: Celleparanalysen. Representative fluorescensbilder av cellepar avledet fra en stamcelledeling. SVZ og DG kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå), stamceller for Sox2 (rød) og nestin (hvit) samt umodne nevroner med DCX (grønn). Pilspisser i panelene A1 og B1 indikerer Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske selvfornyende divisjoner, piler i panela A1 og B2 indikerer Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/--/+ asymmetrisk inndelinger, stiplede linjepiler i paneler A2 og B1 viser Sox2-/- /-/DCX+/symmetrisk+ differensiatingsdivisjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figur 3: Celleoverlevelsesanalyse med cellepassaging. Kvantitativ analyse av PI-positive celler ved DIV2 i SVZ- og DG-avledet differensiert nevrosfærekultur, etter 0, 1, 2 og 3 passasjer (P0-P3). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 1−8. PI = propidium Jodid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figur 4: Neuritogenesis analyse på DIV 1, 2 og 3. Representative konfokal fluorescens bilder av nøytritter, identifisert av βIII-tubulin signal, i SVZ og DG nevroner på (A,D) DIV1, (B, E) DIV2, og (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figur 5: Cellespredningsanalyse. Representative konfokale bilder av BrdU-positive celler ved DIV1 i (A1) SVZ og (A2) DG. - Jeg har ikke noe åsi. Kvantitativ analyse av BrdU-positive celler ved DIV1 i DG- og SVZ-avledet differensiert nevrosfærekultur. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 4. *p < 0,05 ved t-test. Representative fluorescensbilder av BrdU- og NeuN-positive celler ved DIV7 i (B1) SVZ og (B2) DG. Pilspisser indikerer BrdU-/NeuN-positive celler. Jeg har ikke noe å si tildeg. Kvantitativ analyse av BrdU-/NeuN-positive celler ved DIV7 i begge nisjer. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine, syntetisk tymidinanalog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figur 6: Nevrale celletyper som finnes i SVZ- og DG-avledet differensiert nevrosfærekultur. Representative fluorescensbilder av SVZ- og DG-avledede celletyper etter 2 og 7 dager med nevrosfæredifferensiering (DIV2 og DIV7), hvor cellekjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå) og: (A,G) NSCer for GFAP (grønn) og nestin (rød), (B,H) umoden nevroner for DCX (grønn), (C,I) oligodendrocyte forløperceller for PDGFRα (grønn) og NG2 (rød), (D,J) astrocytter for GFAP (grønn), (E,K) modne oligodendrocytes for MBP (grønn), og (F,L) modne nevroner for NeuN (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Supplerende figur 1: Testing av forskjellige underlag for neurosphere etterlevelse og migrasjon for å danne et pseudomonolayer. Representative fluorescensbilder av (A,E) SVZ-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin som et substrat, (B,F) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin som substrat, (C,G) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin med laminin som et substrat, og (D,H) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin med poly-L-ornit som et substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

I denne artikkelen beskriver vi i detalj en protokoll for generering av nevrosfærekulturer fra postnatal mus nevrale stamceller avledet fra hovedmusen nevrogene nisjer. Nevrosfærer brukes til å identifisere nevrale stamceller fra hjernevev som tillater estimering av forløpercelletall. Videre kan disse 3D-strukturene være belagt i differensierende forhold, noe som gir opphav til nevroner, oligodendrocytes og astrocytter, slik at studiet av celleskjebne.

Isolasjon og utvidelse av nevrosfærer fra postnatal (P1-3) Mus Neurogenic nisjer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Den nevrosfæreanalysen er nyttig in vitro teknikk for å studere de iboende egenskapene til nevrale stamceller / stamceller, inkludert spredning, selvfornyelse og multipotens i både fysiologisk og patologisk sammenheng. På grunn av sin tredimensjonale struktur er denne teknikken et kraftig verktøy for å studere voksen nevrogenese. Det er også nyttig for å kultere og oppnå høyere utbytter av nevrale stamceller/ stamceller.Denne nevrosfæreanalysen kan brukes på studiet av hjernesykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdommer eller multippel sklerose. Neurosfærer kan også fås fra andre hjerneregioner eller systemer, for eksempel fettvev eller tarmen. Å demonstrere prosedyren med Filipa Ribeiro vil være Rita Soares, en ph.d.-student i gruppen min.For å høste postnatal dag en til tre musehjerner, hold den ventrale delen av kroppen ved foten av hodet og bruk små spisse saks for å lage et midtlinjet snitt i huden over hele lengden av hodet for å avsløre skallen. Lag et langsgående snitt ved foten av skallen og fortsett å kutte langs sagittalsugen i en grunn vinkel som mulig for å unngå å skade hjernestrukturene. Bruk buede tang til å skrelle skallen til sidene for å eksponere hjernen og skyve en liten slikkepott under hjernen for å kutte kranialnerver og blodkar som er koblet til hjernens bunn.Legg hjernen i en petriskål med kaldt HBSS supplert med antibiotika og legg parabolen under et dissekeringsmikroskop ved lav forstørrelse. Plasser hjernen på dens dorsale overflate. Mens du holder hjernen ved lillehjernen, bruk fine tang for å fjerne meninges fra ventral side av hjernen og olfaktoriske pærer.Roter hjernen på ventral aspektet og skrell av resten av meningene. Bruk deretter tangen til å fjerne lillehjernen og bruke buede spisse tang for å overføre hjernen til et stykke filterpapir med en 11 mikrometer pore på toppen av et vevshelikopter. For SVZ og DG mikrodisseksjon, begynn med å kutte hjernen i 450 mikrometer koronar seksjoner.Bruk en våt lamina til å samle den innsneksjonerte hjernen i en ny petriskål fylt med kaldt antibiotika supplert HBSS under et dissekerende mikroskop og bruk tang til å skille koronarskiver på en fremre-til-bakre måte til skiver med laterale ventriklene er nådd. Bruk fine tang for å kutte det tynne laget av vevet rundt sideveggen av ventriklene, unntatt striatal parenchyma og corpus callosum og plassere den ene spissen av tangen umiddelbart under corpus callosum og den andre inn i vevet umiddelbart ved siden av ventralområdet i side ventrikkelen for å isolere SVZ. Skjær en liten linje av vev rundt sidevognen og samle dissekert vev i et prøverør som inneholder supplert HBSS løsning.Når alle skivene er mikrodissected med tang og hippocampal formasjon er nådd, kast den første skiven med hippocampus der DG er fortsatt ugjenkjennelig. For å fjerne DG, først isolere hippocampus fra skiver og refokusere mikroskopet for å visualisere grensene rundt DG. For å høste DG, bruk tang for å gjøre et kutt mellom DG og CA1-regionen etterfulgt av et vertikalt kutt mellom DG- og CA3-regionen. Fjern deretter fimbria og eventuelle tilstøtende vev og legg det høstede vevet i separat rør av antibiotikasupplert HBSS-løsning.For å ta avstand fra SVZ- og DG-prøvene, legg til Trypsin-EDTA 0,05% til en endelig konsentrasjon på 5-10% av Trypsin-EDTA 0,05% i HBSS til hvert rør i ca. 50 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. Hele bruken av trypsin eller for lang inkubasjonstid kan føre til økt celledød, noe som negativt påvirker celleveksten. Når vevet har klumpet sammen, erstatt enzymoppløsningen for fire påfølgende vasker med en milliliter fersk supplert HBSS per vask.Etter den siste vasken, resuspend fordøyd vev i en milliliter serum-fri medium supplert med 10 nanogram per milliliter epidermal vekstfaktor og fem nanogram per milliliter av grunnleggende fibroblast vekstfaktor per rør. Deretter mekanisk dissosiere vevet med mild pipettering syv til 10 ganger med en P1000 pipet til en homogen celleløsning er oppnådd. For å bestemme tettheten av den dissosierte DG- eller SVG-cellen, telle cellene i hver suspensjon på et hematocytometer.For å utvide cellene til nevrosfærer, fortynne de enkelte cellepopulasjonene på en to ganger ti til fjerde celler per milliliter tetthet i serumfri medium supplert med vekstfaktorer og frø fem milliliter av cellesuspensjonen i ubestrøket 60 millimeter diameter Petri retter. Deretter inkubere SVZ-cellene i seks til åtte dager og DG-cellene i 10 til 12 dager ved 37 grader Celsius for primær neurosphere dannelse. Når flertallet av nevrosfærene har 150 til 200 mikrometer diameter, høste cellesuspensjonen fra kulturene og samle nevrosfærene ved sentrifugering.Resuspend neurosphere pallen med en mus kjemisk dissosiasjon kit i henhold til produsentens instruksjoner før samle cellene med en annen sentrifugasjon. Erstatt supernatant med en milliliter serumfri medium supplert med vekstfaktorer og forsiktig prøve å rangere pellet ca 10 ganger. Telle dissosierte nevroceller som demonstrert og reseed cellene på en to ganger 10 til fjerde celler per milliliter tetthet i serum-fri medium supplert med vekstfaktorer i nye 60 milliliter Petri retter.Deretter returnerer cellen til cellekulturinkubatoren i ytterligere seks til åtte eller 10 til 12 dager etter behov for å oppnå sekundære nevrosfærer. SVG og DG neurosfærer oppnådd ved hjelp av nevrosfæreanalysen består av udifferensiert Sox2 positive, nestin positive celler. Spesielt har SVG avledede nevrosfærer større dimensjoner enn sine DG-kolleger.Viktigere, under differensieringsforhold migrerer SVG og DG-avledede nevrale stamceller / stamceller ut av nevrosfærene, og danner en pseudomonolayer av celler. I begge nevrogene regioner er det mulig å observere tilstedeværelsen av Sox2 dobbel positiv, nestin dobbel positiv, doublecortin doble negative cellepar som tilsvarer symmetriske divisjoner som indikerer selvfornyelse. Cellepar der en celle sox2 positiv, nestin positiv og dobbelkortin negativ, og den andre cellen Sox2 negative, nestin negative, og doublecortin positive demonstrere asymmetriske divisjoner.Og Sox2 dobbel negativ, nestin dobbel negativ, og doublecortin doble positive cellepar tilsvarende symmetriske divisjoner som indikerer differensiering. Samlet sett endrer passaging celledødsraten på den andre dagen in vitro. Neuritogenesis kan evalueres i nevroner hentet fra differensiering av SVG og DG nevrale stamceller / stamceller i begynnelsen av differensiering.Som observert øker lengden og konsekvensen av neurittene med differensiering. En høy prosentandel av proliferative celler observeres i SVG sammenlignet med DG. Selv om prosentandelen av prolifererende forfedre som differensierer til modne nevroner, er lik i begge nevrogene nisjer. Begge celletyper er også i stand til å skille seg til umodne nevroner, modne nøytroner, oligodendrocytter forløperceller, modne oligodendrocytter og astrocytter.Etter å ha oppnådd nevrosfærene, kan flere metoder, inkludert immunocytochemistry, kalsiumavbildning, vestlige flekker og RT-PCR utføres for å studere stemness og multipotency av nevrale stamceller / stamceller. Den nevrosfæreanalysen kan brukes på genetiske og sykdomsmodeller for å evaluere de molekylære og cellulære prosessene involverer i både spredning og differensiering av nevrale stamceller / stamceller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolasjon og utvidelse av Human glioblastoma multiforme kreftceller Bruke Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantasjon av Interneuron forløpere til tidlig Postnatal musen hjerner

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantasjon av Chemogenetically utviklet kortikale Interneuron forfedre inn tidlig postnatal Mouse hjerner

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generering av Neurospheres fra Mixed Primary hippocampus og kortikale neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rensing av Prominin-1+ stamceller fra postnatal mus cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur av neurosfærer avledet fra nevrogene nisjer i Voksen Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...