Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Detta arbete stöddes av IF/01227/2015 och UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) och R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fick ett stipendium från FCT. Författarna vill tacka medlemmarna i bioimaging anläggningen vid Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes för mikroskopi hjälp.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

In vitro-system för NSPC möjliggör en bättre förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna, som kan valideras ytterligare in vivo. NSA är en mycket kraftfull metod för att efterlikna fysiologiska tillstånd på grund av deras tredimensionella struktur. Dessutom är detta kultursystem också tekniskt lättare att odla10, jämfört med andra in vitro-system som monolayer kultursystemet. Faktum är att med NSA, är det lätt att kontrollera de exponerade intrinsikalt signaler under cellutveckling, antingen under expansionen eller differentieringsfasen, genom att lägga till exakta och varierande mängder av faktorer av intresse för media samt genom att odling av neurosfärer med andra celltyper6. Jämfört med monolayerkulturer är det dessutom möjligt att få en högre celltäthet från en liten mängd vävnad eller med ett litet antal celler, vilket gör det möjligt att utföra parallella studier, vilket minskar antalet djur1.
NSA är den vanligaste metoden för att isolera och expandera NSCs11,12,13, kan användas för att uppskatta antalet prekursorceller som finns i ett visst vävnadsprov5 och prekursorcellfrekvensen mellan olika förhållanden. Men både neurospheres och monolayer kulturer tar inte hänsyn till quiescence NSCs14. Dessutom har NSA vissa begränsningar11,12,13 och den resulterande neurosfären frekvens beror på många faktorer, inklusive de medelstora komponenterna, dissekering förfarandet, dissociation processen11,12,13, och neurosfär aggregering5. I en hög densitet kultur, neurospheres tenderar att aggregera. Därför måste försiktighet iakttas vid uppskattning av antalet prekursorceller i ett prov. För att övervinna ovanstående begränsningar kan isolerade NSPC också utökas och passage i en monolayer5,15. Viktigt, att använda NSA för att jämföra prekursor cellfrekvens mellan olika villkor är mycket användbart och korrekt eftersom alla dessa begränsningar är implicita och liknande bland alla villkor som utförs i samma experiment.
Det finns kritiska steg i neurosfärkulturen som behöver uppmärksammas. I hjärnan skörd steg, fullständigt avlägsnande av hjärnhinnor och god isolering av neurogena nischer är viktiga för att maximera renhet och avkastning av NSPCs. Under vävnad dissociation, på grund av proteolytisk aktivitet av trypsin, överdriven användning av trypsin eller längre inkubationstider kan leda till celllys. Dessutom är dagen för passagen avgörande för att få en frisk population av neurosfärer. Passaging neurospheres med en diameter högre än 200 μm påverkar kraftigt livskraft, proliferative och differentiative kapacitet NSPCs. Viktigt, längre cykler av passager, mer än 10 kan öka genetisk instabilitet6. Dessutom är beläggning med PDL och PLD/laminin för SVZ respektive DG-celler avgörande för att säkerställa god cellmigration ut ur neurosfärerna utan att kompromissa med differentieringen. När det gäller immunocytokemi analys, längre inkubationstider med PFA kan äventyra färgning genom att maskera antigener och öka bakgrunden.
NSA är ett kraftfullt verktyg för att tillhandahålla en konsekvent och obegränsad källa till NSPCs för in vitro-studier av neural utveckling och differentiering samt för terapeutiska ändamål16,17. Faktum är att denna analys kan tillämpas på genetiska och beteendemässiga modeller för att ytterligare förstå de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i NSPC spridning och differentiering18,19. Denna analys är också användbart för att testa olika läkemedel och föreningar20,21,22 samt att utföra genetiska manipulationer19,23 att modulera NSC egenskaper. Förutom immunocytokemi kan omvänd transkriptionspolylasked reaktion och western blot-analys utföras för att komma åt RNA och proteinuttryck, medan elektrofysiologiska studier och kalciumavbildning kan användas för att utvärdera funktionen hos de nyfödda nervcellerna21.

Neurosfären analysen (NSA) beskrevs först i 19921,2 och är fortfarande ett unikt och kraftfullt verktyg i neurala stamceller (NSC) forskning. Isoleringen av NSC från de viktigaste neurogena regionerna har utmanande problem eftersom kraven för att upprätthålla dessa celler i fysiologiska förhållanden fortfarande dåligt förstås. I NSA odlas celler i ett kemiskt definierat serumfritt medium med förekomst av tillväxtfaktorer, inklusive epidermala tillväxtfaktorn (EGF) och den grundläggande fibroblasttillväxtfaktorn (bFGF)1,2,3. Neurala prekursorceller (stamceller och stamfader) väljs genom att använda dessa mitogener eftersom dessa celler är EGF och FGF-lyhörda in i en period av aktiv spridning medan andra celler, nämligen differentierade celler, dör4. Neurala prekursorceller växer som neurosfärer, som sedan kan passage för att ytterligare expandera poolen av dessa celler5. Viktigt, eftersom dessa neurala stamceller stamceller (NSPCs) är multipotenta de kan skilja in i de tre stora celltyperna i centrala nervsystemet (CNS): nervceller, oligodendrocyter och astrocyter5.
NSA ger en förnybar källa till odifferentierade CNS prekursorer, som kan användas för att studera flera processer inklusive NSC spridning och självförnyelse, och neuronal och glial differentiering, i både fysiologiska och sjukdom sammanhang. Dessutom, in vitro-studier kan användas för att utvärdera graden av inneboende specifikation som finns i neurala prekursorer under utveckling, samt att studera den fulla potentialen av cellerna, genom att ta bort yttre ledtrådar i samband med deras normala miljö6. Neurosfärmodellen är värdefull för att utvärdera förmodade regulatorer eftersom genom att upprätthålla cellerna i ett medium saknar serum, är de miljömässiga ledtrådar endast tillhandahålls av de omgivande cellerna6. Dessutom, i NSA, NSPCs är lätt expanderas i kultur, tätheten av celler per område är hög och den heterogena sammansättningen av neurosfärerna har vissa likheter med in vivo nischer6. Dessa väletablerade fördelar är anledningen till att denna metod har använts i stor utsträckning av många forskare.
Följande protokoll beskriver i detalj alla processer från isolering av postnatala NSPC befolkningen från de två viktigaste neurogena regionerna, den subventricular zonen (SVZ) och hippocampus dentate gyrus (GD), till expansion av dessa celler som neurospheres, samt till differentiering i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Slutligen beskrivs också olika analyser för att få tillgång till stamhet och multipotensegenskaper hos SVZ- och DG-härledda NSPC.Lastly, different assays are also described to access stemness and multipotency properties of SVZ- and DG-derived NSPCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

Neurosfären analysen är en mycket användbar in vitro-teknik för att studera de inneboende egenskaperna hos neurala stamceller / stamceller (NSPCs) inklusive spridning, självförnyelse och multipotens. I den postnatala och vuxna hjärnan, NSPCs är främst närvarande i två neurogena nischer: den subventricular zonen (SVZ) foder de laterala ventriklarna och den subgranular zonen i hippocampus dentate gyrus (DG). Isoleringen av de neurogena nischerna från postnatala hjärnan gör det möjligt att få en högre mängd NSPC i kultur med en därav följande fördel av högre avkastning. Den nära kontakten mellan cellerna inom varje neurosfär skapar en mikromiljö som kan likna neurogena nischer. Här beskriver vi i detalj hur man skapar SVZ- och DG-härledda neurosfärkulturer från 1−3-dagars-gamla (P1−3) möss, samt passaging, för neurosfärexpansion. Detta är ett fördelaktigt tillvägagångssätt eftersom neurosfären analysen möjliggör en snabb generation av NSPC kloner (6−12 dagar) och bidrar till en betydande minskning av antalet djuranvändning. Genom att pläta neurospheres i differentiativa förhållanden, kan vi få en pseudomonolayer av celler som består av NSPCs och differentierade celler av olika neurala härstamningar (nervceller, astrocyter och oligodendrocyter) gör det möjligt att studera åtgärder av inneboende eller intrinsikala faktorer på NSPC spridning, differentiering, cellöverlevnad och neuritogenesis.

SVZ och GD Neurosfärer, som erhålls med hjälp av NSA, består av odifferentierade celler, positiva för Sox2, en transkriptionsfaktor som är involverad i självförnyelsekapaciteten och positiv för nestin, ett mellanliggande glödtrådsprotein uttryckt i NSPC(figur 1A). Dessutom har SVZ-härledda neurosfärer större dimensioner än sina motsvarigheter i GD (figur 1A). Viktigt, i differentiative förhållanden, SVZ- och GD-härledda NSPCs migrera ut ur neurosfärer bildar en pseudomonolayer av celler (figur 1B).
För att komma åt självförnyelsekapaciteten utförs cellparanalysen baserat på uttrycket av Sox2 och nestin som tenderar att försvinna i att dela celler som startar differentieringen med en kombination av en markör för neuronal härstamning nämligen DCX. I båda neurogena regioner det är möjligt att observera förekomsten av Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriska indelningar (självförnyelse) (figur 2A1, B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetriska indelningar (figur 2A1, B2) och Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriska indelningar (differentiering) (figur 2A2,B1).
Passaging de neurospheres ökar avkastningen av NSPCs; celldöd vid DIV2 ändras dock med passaging. I själva verket ökas andelen PI-positiva celler med cellpassering i SVZ (P0: 15,6 % ± 1,2 % jämfört med P1: 19,2 % ± 2,7 % jämfört med P2: 32,35 % ± 0,14 % jämfört med P3: 39,6 % ± 4,0 %) och i GD (P0: 16,31 % ± 0,95 % jämfört med P1: 32,1 % ± 1,7 % jämfört med P2: 27,42 % jämfört med P3: 32,2 % ± 3,1 %) (Figur 3).
Neuritogenesis kan utvärderas i nervceller som erhållits från differentiering av SVZ och DG NSPCs i början av differentiering: DIV1(Figur 4A, D),DIV2(Figur 4B, E) och DIV3 ( Figur4C, F). I själva verket, som observerats i figur 4, ökar längden och förgreningen av neuriterna med differentiering.
Cellproliferation kan utvärderas i SVZ- och DG-härledda neurosfärer. Om man jämför primärdifferentierade neurosfärer vid DIV1 från SVZ (figur 5A1) och GD (figur 5A2) är andelen BrdU-positiva celler högre i SVZ än i GD (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % jämfört med GD: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Bild 5A3). Dessutom kan celldifferentiering också nås genom att kombinera BrdU-färgning med en mogen tillverkare som neuronala kärnor (NeuN) som identifierar mogna nervceller (Figur 5B1,B2). Figur 5B3 visar att andelen prolifererande stamfader som skiljer sig till mogna nervceller är likartad i SVZ och GD (SVZ: 12,04 % ± 1,58 % jämfört med GD: 13,56 % ± 0,48 %; p > 0,05; n = 4).
Stammen och multipotensen hos SVZ- och DG-härledda NSPC kan nås med hjälp av NSA genom att utvärdera uttrycket av olika markörer vid olika differentieringsdagar (DIV2 och DIV7). I själva verket är NSCs (nestin- och glia fibrillary sura protein [GFAP]-dubbel-positiva celler) närvarande i båda neurogena regioner(Figur 6A, G). Dessa celler kan differentiera till omogna nervceller (DCX-positiva celler) (figur 6B,H), mogna nervceller (NeuN-positiva celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte prekursorceller (neuron-glia antigen 2 [NG2] och trombocyt-de härledd tillväxtfaktorreceptor α [PDGFRα]- positiva celler) ( figur6C,I), mogna oligodendrocyter (myelin grundläggande protein [MBP]-positiva celler) (figur 6E,K) och astrocyter (GFAP-positiva celler) (figur 6D,J).
Olika substrat kan användas för att belägga täcken för att bilda pseudomonolayer av celler under olika förhållanden. Som framgår av tilläggs figur 1migrerar GD-celler mer när täcken har extra beläggning med laminin kombinerat med PLO eller PDL än med enbart PDL(tilläggs figur 1B−H). Faktum är att när PDL och laminin används tillsammans som substrat(Tilläggs figur 1C,G), bildar GD-celler en mer flytande pseudomonolayer än SVZ-celler för vilka PDL används ensamt (tilläggsfigur 1A,E).
Viktigt, dessa resultat visar potentialen hos NSA att utvärdera stamhet och multipotens egenskaper NSCs härrör från de två viktigaste neurogena nischer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figur 1: Subventricular zon och dentate gyrus härledda NSPC odlade som neurosfärer eller som pseudomonolayers. a) Representativa ljusfält(A1,A3)och fluorescens(A2,A4)bilder av SVZ- och DG-härledda neurosfärer, där kärnor har färgats med Hoechst 33342 (blå) och NSCs för Sox2 (grön) och nestin (röd). b)Representativa ljusfältsbilder av pseudomonolayers som genereras från SVZ- och DG-härledda neurosfärer under olika förhållanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Bild 2: Cellparanalysen. Representativa fluorescensbilder av cellpar som härrör från en stamcellsdelning. SVZ och DG-kärnor färgades med Hoechst 33342 (blå), stamcellerliknande celler för Sox2 (röd) och nestin (vit) samt omogna nervceller med DCX (grön). Pilspetsar i panelerna A1 och B1 anger Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriska självförnyande indelningar, pilar i panelerna A1 och B2 indikerar Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetriska indelningar, streckade linjepilar i panelerna A2 och B1 visar Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriska differentieringsdivisioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figur 3: Cellöverlevnadsanalys med cellpassering. Kvantitativ analys av PI-positiva celler vid DIV2 i SVZ- och DG-härledd differentierad neurosfärkultur, efter 0, 1, 2 och 3 passager (P0−P3). Data uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 1−8. PI = propidium jodid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figur 4: Neuritogenesanalys vid DIV 1, 2 och 3. Representativa konfokalfluorescensbilder av neuriter, identifierade med βIII-tubulinsignalen, i SVZ- och DG-nervceller vid(A,D)DIV1, (B,E) DIV2 och (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figur 5: Cellspridningsanalys. Representativa konfokala bilder av BrdU-positiva celler vid DIV1 i (A1) SVZ och (A2) GD. (A3) Kvantitativ analys av BrdU-positiva celler vid DIV1 i GD- och SVZ-härledda differentierade neurosfärkultur. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 4. * p < 0,05 av t-test. Representativa fluorescensbilder av BrdU- och NeuN-positiva celler vid DIV7 i(B1)SVZ och (B2) GD. Pilspetsar anger BrdU-/NeuN-positiva celler. (B3) Kvantitativ analys av BrdU-/NeuN-positiva celler vid DIV7 i båda nischerna. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridin, syntetisk tymidin analog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figur 6: Neurala celltyper som finns i SVZ- och DG-härledda differentierade neurosfärkultur. Representativa fluorescensbilder av SVZ- och DG-härledda celltyper efter 2 och 7 dagars neurosfärdifferentiering (DIV2 och DIV7), där cellkärnor färgades med Hoechst 33342 (blå) och:(A,G)NSCs för GFAP (grön) och nestin (röd), (B,H) omogen neuron för DCX (grön), (C,I) oligodendrocyte prekursorceller för PDGFRα (grön) och NG2 (röd), (D,J) astrocyter för GFAP (grön), (E, K) mogna oligodendrocyter för MBP (grön), och (F,L) mogna nervceller för NeuN (röd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Tilläggs figur 1: Testa olika substrat för neurosfärens följsamhet och migration för att bilda en pseudomonolayer. Representativa fluorescensbilder av(A,E)SVZ-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin som substrat.(B,F)GD-härledd pseudomonolayer med poly-D-lysin som substrat, (C,G) GD-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin med laminin som substrat, och (D,H) GD-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin med poly-L-ornitin som substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll för generering av neurosfärkulturer från postnatala mus neurala stamceller som härrör från de viktigaste mus neurogena nischer. Neurosfärer används för att identifiera neurala stamceller från hjärnvävnad som gör det möjligt att uppskatta prekursorcellnummer. Dessutom kan dessa 3D-strukturer pläteras i differentiativa förhållanden, vilket ger upphov till nervceller, oligodendrocyter och astrocyter, vilket gör det möjligt att studera cellöde.

Isolering och expansion av neurosfärer från Postnatala (P1−3) Mus neurogena nischer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neurosfären assay är användbar in vitro-teknik för att studera de inneboende egenskaperna hos neurala stam/progenitor celler inklusive proliferation, självförnyelse och multipotens i både fysiologiska och patologiska sammanhang. På grund av dess tredimensionella struktur, denna teknik är ett kraftfullt verktyg för att studera vuxna neurogenes. Det är också användbart för odling och erhålla högre avkastning av neurala stam /progenitor celler.Denna neurosfäranalys kan appliceras på studien av hjärnsjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar eller multipel skleros. Neurosfärer kan också erhållas från andra hjärnregioner eller system, såsom fettvävnad eller tarmen. Demonstrera förfarandet med Filipa Ribeiro kommer att Rita Soares, en doktorand i min grupp.För att skörda postnatal dag ett till tre mus hjärnor, håll den ventrala delen av kroppen vid basen av huvudet och använda små spetsiga saxar för att göra en mittlinjen snitt i huden över hela längden av huvudet för att exponera skallen. Gör ett längsgående snitt vid skallbasen och fortsätt skära längs den sagittala suturen i en grund vinkel som möjligt för att undvika att skada hjärnstrukturerna. Använd böjda tärna för att skala skallen till sidorna för att exponera hjärnan och skjut en liten spatel under hjärnan för att skära kranialnerven och blodkärl som är anslutna till basen av hjärnan.Placera hjärnan i en petriskål av kall HBSS kompletterad med antibiotika och placera skålen under ett dissekerande mikroskop vid låg förstoring. Placera hjärnan på dess ryggyta. Medan du håller hjärnan vid lillhjärnan, använd fina tång för att ta bort hjärnhinnor från den ventrala sidan av hjärnan och luktlökar.Rotera hjärnan på den ventrala aspekten och skala av resten av hjärnhinnorna. Använd sedan tärnarna för att ta bort lillhjärnan och använd böjda spetsiga tyckor för att överföra hjärnan på ett stycke filterpapper med en 11 mikrometer por ovanpå en vävnadshacka. För SVZ och GD mikrodissektion, börja med att hugga hjärnan i 450 mikrometer koronal sektioner.Använd en våt lamina för att samla in den sektionerade hjärnan i en ny Petri skålen fylld med kallt antibiotikum kompletteras HBSS under en dissekera mikroskop och använda forceps för att separera koronala skivor i en främre-till-posterior mode tills skivor med laterala ventriklar nås. Använd fina tång för att skära det tunna lagret av vävnaderna som omger ventriklarnas laterala vägg, utom den striatala parenkymen och corpus callosum och placera den ena spetsen av tångarna omedelbart under corpus callosum och den andra i vävnaden omedelbart intill det ventrala området i den laterala ventrikeln för att isolera SVZ. Skär en liten linje av vävnader som omger den laterala ventrikeln och samla den dissekerade vävnaden i ett provrör som innehåller kompletterad HBSS-lösning.När alla skivor har mikroupptäckts med tuppar och hippocampusbildning har uppnåtts, kasta den första biten med hippocampus där GENERALDIREKTORATET fortfarande är oigenkännligt. För att ta bort GD, först isolera hippocampus från skivor och fokusera mikroskopet för att visualisera gränserna runt DG. För att skörda generaldirektoratet, använd forceps för att göra en nedskärning mellan GD och CA1-regionen följt av ett vertikalt snitt mellan GD och CA3-regionen. Ta sedan bort fimbria och eventuell intilliggande vävnad och placera den skördade vävnaden i separat rör av antibiotika kompletterad HBSS-lösning.För att ta isär SVZ- och GD-proverna, lägg trypsin-EDTA 0,05%till en slutlig koncentration av 5-10%av Trypsin-EDTA 0,05%i HBSS till varje rör för en cirka 50 minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Hela användningen av trypsin eller för lång inkubationstid kan leda till ökad celldöd, negativt påverkar celltillväxt. När vävnaden har klumpat ihop, ersätta enzymlösningen för fyra på varandra följande tvättar med en milliliter färsk kompletterad HBSS per tvätt.Efter den sista tvätten, resuspend de rötade vävnaderna i en milliliter av serumfritt medium kompletterat med 10 nanogram per milliliter av epidermal tillväxtfaktor och fem nanogram per milliliter av grundläggande fibroblast tillväxtfaktor per rör. Därefter tar man mekaniskt isär vävnaderna med skonsam pipettering sju till tio gånger med en P1000 pipet tills en homogen celllösning har erhållits. För att bestämma densiteten för den dissocierade DG- eller SVG-cellen, räkna cellerna i varje suspension på en hematocytometer.För att expandera cellerna till neurosfärer, späd de enskilda cellpopulationerna på en två gånger tio till de fjärde cellerna per milliliter densitet i serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer och frö fem milliliter av cellen suspensionen i obestruket 60 millimeter diameter Petri rätter. Sedan inkubera SVZ-cellerna i sex till åtta dagar och GD-cellerna i 10 till 12 dagar vid 37 grader Celsius för primär neurosfärbildning. När majoriteten av neurosfärerna har 150 till 200 mikrometerdiameterdiameter diameter, skörda cellen suspension från kulturerna och samla in neurosfärerna genom centrifugeringen.Resuspend neurosfären pall med en mus kemisk dissociation kit enligt tillverkarens anvisningar innan samla in cellerna med en annan centrifugeringen. Ersätt supernatanten med en milliliter serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer och försök försiktigt att betygsätta pelleten ca 10 gånger. Räkna de dissocierade neurocellerna som visats och reseed cellerna på en två gånger 10 till den fjärde celler per milliliter densitet i serum-free medium kompletteras med tillväxtfaktorer till nya 60 milliliter Petri rätter.Sedan tillbaka cellen till cellodlingen inkubator för ytterligare sex till åtta eller 10 till 12 dagar som lämpligt att erhålla sekundära neurosfärer. SVG och GD neurosfärer som erhålls genom att använda neurosfären analysen består av odifferentierade Sox2 positiva, nestin positiva celler. Noterbart är att SVG-härledda neurosfärer har större dimensioner än sina GD-motsvarigheter.Viktigt, under differentiering villkor, SVG och DG-härledda neurala stam/stamceller migrera ut ur neurosfärer, bildar en pseudomonolayer av celler. I båda neurogenic regioner, är det möjligt att observera förekomsten av Sox2 dubbel positiv, nestin dubbel positiv, doublecortin dubbel negativ cell par som motsvarar symmetriska divisioner som tyder på självförnyelse. Cellpar där en cell av Sox2 positiva, nestin positiva och doublecortin negativ, och den andra cellen Sox2 negativ, nestin negativ, och doublecortin positiva visar asymmetriska divisioner.Och Sox2 dubbel negativ, nestin dubbel negativ, och doublecortin dubbel positiva cellpar som motsvarar symmetriska divisioner som tyder på differentiering. Totalt sett ändrar passaging celldödsfrekvensen vid andra dagen in vitro. Neuritogenesis kan utvärderas i nervceller som erhållits från differentiering av SVG och GD neurala stamceller/progenitor celler i början av differentiering.Som observerats ökar längden och förgreningen av neuriterna med differentiering. En hög andel proliferativa celler observeras i SVG jämfört med GD. Även om andelen proliferering progenitors som differentierar till mogna nervceller är liknande i både neurogena nischer. Båda celltyperna är också kunna differentiera till omogna nervceller, mogna neutroner, oligodendrocytes prekursorceller, mogna oligodenadtrocyter, och astrocyter.Efter erhållande av neurospheresna, kan flera metoder däribland immunocytochemistry, calciumavbildning, västra blottor och RT-PCR utföras för att studera stemnessen och multipotencyen av de neurala stemen/progenitorcellerna. Neurosfären assay kan tillämpas på genetiska och sjukdomsmodeller för att ytterligare utvärdera de molekylära och cellulära processer innebär både spridning och differentiering av neurala stamceller / stamceller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic Transplantation av Interneuron prekursorer i tidig Postnatal mus hjärnor

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantation av Chemogenetiskt konstruerade kortikala Interneuron progenitorer till tidiga postnatal mus hjärnor

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generering av Neurosfärer från blandade primära hippocampal och kortikala neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rening av Prominin-1+ stamceller från Postnatal Mus Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur av neurosfärer som härrör från neurogena nischer i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...