Name: isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Bu çalışma IF/01227/2015 ve UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino (Superior MCTES) através de Fundos do Orçamenesta tarafından desteklenmiştir. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (İBB/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) ve R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) FCT'den burs almıştır. Yazarlar mikroskop yardımı için Instituto de Medicina Moleküler João Lobo Antunes de biyogörüntüleme tesisi üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li><li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization.">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Mouse,+Two+Cultures:+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice.">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System.">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+(CB1R)+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures.">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).</li><li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry.">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li><li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population.">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li><li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures.">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities?.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer's+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J+embryonic+mouse+brain.">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage.">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).</li><li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program.">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li><li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis,+Neural+Stem+Cell+Pool,+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats.">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li><li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebasti&#227;o, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis.">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin?.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells.">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

NSPCs in vitro sistemleri hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlar, hangi daha fazla in vivo doğrulanabilir. NSA, üç boyutlu yapısı nedeniyle fizyolojik koşulları taklit etmek için çok güçlü bir yöntemdir. Ayrıca, bu kültür sistemi de teknik olarak kültür10daha kolaydır , monolayer kültür sistemi gibi diğer in vitro sistemleri ile karşılaştırıldığında. Nitekim, NSA ile, hücre gelişimi sırasında maruz kalan dışsal ipuçlarını kontrol etmek kolaydır, genişleme veya farklılaşma aşamasında, medya ilgi faktörlerinin hassas ve değişken miktarlarda ekleyerek yanı sıra diğer hücre tipleri ile nörosferler culturing tarafından6. Ayrıca, nsa monolayer kültürleri ile karşılaştırıldığında, bu doku küçük bir miktar veya hücrelerin az sayıda daha yüksek bir hücre yoğunluğu elde etmek mümkündür, paralel çalışmalar yapılmasına izin, böylece hayvan sayısını azaltmak1.
NSA izole etmek ve NSCs genişletmek için en yaygınyöntemdir 11,12,13, belirli bir doku örneği mevcut öncül hücrelerin sayısını tahmin etmek için kullanılabilir5 ve farklı koşullar arasında öncü hücre frekansı. Ancak, hem nörosferler ve monolayer kültürler quiescence NSCs14için hesap yok. Ayrıca, NSA bazı sınırlamalar vardır11,12,13 ve ortaya çıkan nörosfer frekansı orta bileşenleri de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır, diseksiyon prosedürü, ayrıştırma işlemi11,12,13, ve nörosfer toplama5. Gerçekten de, yüksek yoğunluklu bir kültürde, nörosferler toplama eğilimindedir. Sonuç olarak, bir örnekteki öncül hücrelerin sayısını tahmin ederken dikkatli olunmalıdır. Yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, yalıtılmış NSPC'ler de genişletilebilir ve tek katmanlı5,,15. Daha da önemlisi, öncül hücre frekansını farklı koşullar arasında karşılaştırmak için NSA kullanmak çok yararlı ve doğrudur, çünkü tüm bu sınırlamalar aynı denemede gerçekleştirilen tüm koşullar arasında örtülü ve benzerdir.
Nörosfer kültüründe dikkat gerektiren kritik adımlar vardır. Beyin hasat adım, menenjler ve nörojenik nişler iyi izolasyon tam kaldırılması nsPCs saflık ve verimi maksimize etmek için gereklidir. Doku ayrışması sırasında, tripsinin proteolitik aktivitesi nedeniyle, tripsin aşırı kullanımı veya daha uzun kuluçka süreleri hücre lisise yol açabilir. Ayrıca, geçiş günü nörosferlerin sağlıklı bir nüfus elde etmek için önemlidir. Çapı 200 μm'den yüksek olan passaging nörosferler NSPC'lerin canlılığını, proliferatif ve farklıcı kapasitesini büyük ölçüde etkiler.6 Ayrıca, SVZ ve DG hücreleri için PDL ve PLD/laminin ile kaplama, sırasıyla, farklılaşma sürecinden ödün vermeden nörosferlerden iyi hücre göçünün sağlanması için gereklidir. İmmünositokimya analizi açısından, PFA ile daha uzun kuluçka süreleri antijenleri maskeleyerek ve arka planı artırarak boyamayı tehlikeye atabilir.
NSA nöral gelişim ve farklılaşma in vitro çalışmalar yanı sıra terapötik amaçlar için nspcs tutarlı ve sınırsız bir kaynak sağlamak için güçlü bir araçtır16,17. Nitekim, bu tetki kullanabilirsiniz genetik ve davranışsal modeller daha fazla NSPC proliferasyon ve farklılaşma dahil moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için18,19. Bu test aynı zamanda farklı ilaç ve bileşikler i test etmek için yararlıdır20,21,22 yanı sıra genetik manipülasyonlar gerçekleştirmek için19,23 NSC özellikleri modüle etmek. İmmünositokimyaya ek olarak, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ve Batı leke analizi RNA ve protein ekspresyonuna erişmek için yapılabilirken, elektrofizyolojik çalışmalar ve kalsiyum görüntüleme yeni doğan nöronların işlevini değerlendirmek için kullanılabilir21.

Nörosfer tsay (NSA) ilk olarak 1992yılında1,2 ve hala nöral kök hücre (NSC) araştırma benzersiz ve güçlü bir araç kalır tanımlanmıştır. NSC'lerin ana nörojenik bölgelerden izole edilmesi zorlu sorunlara sahiptir, çünkü fizyolojik koşullarda bu hücreleri koruma gereksinimleri tam olarak anlaşılamamıştır. NSA'de hücreler, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)1,2,3gibi büyüme faktörlerinin varlığı ile kimyasal olarak tanımlanmış serumsuz bir ortamda kültürlenir. Nöral öncül hücreler (kök ve atalar) bu hücreler EGF ve FGF duyarlı aktif çoğalma dönemine girerken diğer hücreler, yani farklılaştırılmış hücreler, ölmek4çünkü bu mitojenler kullanılarak seçilir . Nöral öncül hücreler nörosferler olarak büyür, daha sonra daha fazla bu hücrelerin havuzu genişletmek için geçit edilebilir5. Daha da önemlisi, bu nöral kök progenitor hücreleri (NSPcCs) onlar merkezi sinir sisteminin üç ana hücre tipleri (CNS) içine ayırt edebiliyoruz multipotent olduğundan: nöronlar, oligodendrocytes ve astrositler5.
NSA, NSC proliferasyonu ve kendini yenileme, nöronal ve glial diferansiyasyon gibi çeşitli süreçleri hem fizyolojik hem de hastalık bağlamında incelemek için kullanılabilecek farklılaşmamış CNS öncüllerinin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Ayrıca, in vitro çalışmalar geliştirme sırasında nöral öncüllerde mevcut içsel özelliklerin derecesini değerlendirmek için kullanılabilir, hem de hücrelerin tam potansiyelini incelemek için, normal çevre ile ilişkili ekstrensek ipuçları kaldırarak6. Nörosfer modeli serum yoksun bir ortamda hücreleri koruyarak beri putatif düzenleyicileri değerlendirmek için değerlidir, çevresel ipuçları sadece çevreleyen hücreler tarafından sağlanır6. Ayrıca, NSA, NSPCs kolayca kültür genişletilir, alan başına hücrelerin yoğunluğu yüksek ve nörosferlerin heterojen bileşimi in vivo nişler bazı benzerlik vardır6. Bu köklü avantajlar, bu metodolojinin birçok araştırmacı tarafından yaygın olarak kullanılmasının nedenidir.
Aşağıdaki protokol, postnatal NSPC popülasyonunun iki ana nörojenik bölgeden, subventriküler zonun (SVZ) ve hipokampal dentat girustan (DG) izolasyonundan, bu hücrelerin nörosfer olarak genişlemesine ve nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere ayrıştırılmasına kadar tüm süreçleri ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Son olarak, farklı tahliller de SVZ köklük ve multipotency özellikleri erişmek için açıklanmıştır- ve DG türetilmiş NSPCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira &#38; C&#170; (Irm&#227;o) Sucrs, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion slides, Menzel Gl&#228;ser, SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD140a (PDGFR&#945;) (rat)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558774</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin (chicken)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>326006</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9269-.2ML</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (rabbit)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>78896S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neuronal Nuclei (mouse)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin &#946;3 (rabbit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>802001</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 wide field microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5S Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>53003018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillete Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000 (1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2012-65727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McILWAIN Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 450 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>5707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28794.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO43 - in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 100mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.360.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of neurospheres from postnatal (p1&#8722;3) mouse neurogenic niches

Nörosfer tsay nöral kök / progenitor hücrelerinin doğal özelliklerini incelemek için son derece yararlı bir in vitro tekniktir (NSPCs) çoğalma dahil, kendini yenileme ve multipotency. Postnatal ve yetişkin beyinde, NSPC'ler başlıca iki nörojenik nişlerde bulunur: lateral ventrikülleri ve hipokampal dentat girusunun subgranular zonu (DG) subventriküler zon (SVZ). Nörojenik nişlerin postnatal beyinden izolasyonu, kültürde daha yüksek verim avantajı ile daha yüksek miktarda NSPC elde edilmesine olanak sağlar. Her nörosfer içindeki hücreler arasındaki yakın temas nörojenik nişler benzer bir mikroortam oluşturur. Burada, 1−3 günlük (P1−3) farelerden SVZ ve DG kaynaklı nörosfer kültürlerinin nasıl üretilmeye ve nörosfer genişlemesi için nasıl geçiş yapılacağını ayrıntılı olarak anlatıyoruz. Nörosfer tetki, hızlı bir NSPC klonu üretimine (6−12 gün) izin verdiği nden ve hayvan kullanımının önemli ölçüde azalmasına katkıda bulunmasından bu yana avantajlı bir yaklaşımdır. Farklılaştırıcı koşullarda nörosferleri kaplamak, NSPC'lerden oluşan bir hücre pseudomonolayer ve farklı nöral soyların farklılaştırılmış hücreleri elde edebilirsiniz (nöronlar, astrositler ve oligodendrositler) NSPC proliferasyonu, farklılaşma, hücre sağkalım ve neuritogenez üzerinde içsel veya dışsal faktörlerin eylemlerinin incelenmesine olanak sağlar.

NSA kullanılarak elde edilen SVZ ve DG nörosferleri, farklılaşmamış hücrelerden oluşur, Sox2 pozitif, kendi kendini yenileme kapasitesinde rol oynayan bir transkripsiyon faktörü ve NSPC'lerde ifade edilen bir ara filament proteini olan nestin için pozitiftir (Şekil 1A). Buna ek olarak, SVZ kaynaklı nörosferler DG muadillerine göre daha büyük boyutlara sahiptir (Şekil 1A). Daha da önemlisi, farklısal koşullarda, SVZ- ve DG kaynaklı NSPC'ler hücrelerin psödomonotabakasını oluşturan nörosferlerden göç eder(Şekil 1B).
Kendi kendini yenileme kapasitesine erişmek için, hücre çifti teşrisi Sox2 ve nestin ifadesine göre gerçekleştirilir ve bu da farklılaşma işlemini başlatan hücrelerin bölünmesinde kaybolma eğilimindedir, yani nöronal soyundan bir belirteç ile dcx. Her iki nörojenik bölgede de, Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- simetrik bölünmelerin (kendini yenileme)(Şekil 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/////DCX+/- asimetrik bölünmeler (Şekil 2A1,B2) ve Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ simetrik bölünmeler (farklılaşma) (Şekil 2A2,B1).
Nörosferlerin geçişi NSPC'lerin verimini artırır; ancak DIV2'de hücre ölümü geçişle birlikte değişir. Aslında SVZ'de hücre geçişi ile PI-pozitif hücrelerin yüzdesi arttırılır (P0: %15.6 ± %1.2 % p1: %19.2 ± %2.7 vs P2: %32.35 ± %0.14 vs P3: %39.6 ± % 4.0) ve DG'de (P0: %16,31 ± %0,95 % p1: %32,1 ± %1,7 vs P2: %27,42 vs P3: %32,2 ± % 3,1) (Şekil 3).
Neuritogenez, farklılaşmanın başlangıcında SVZ ve DG NSPC'lerinin farklılaşmasından elde edilen nöronlarda değerlendirilebilir: DIV1 (Şekil 4A,D), DIV2 (Şekil 4B,E) ve DIV3 (Şekil 4C,F). Aslında Şekil 4'tede görüldüğü gibi, nöritlerin uzunluğu ve sonucu farklılaşma ile artar.
Hücre proliferasyonu SVZ ve DG kaynaklı nörosferlerde değerlendirilebilir. DIV1'deki primer farklılaştırılmış nörosferlerin SVZ(Şekil 5A1)ve DG(Şekil 5A2)ile karşılaştırılması, BrdU pozitif hücrelerin yüzdesi SVZ'de DG'ye göre daha yüksektir (SVZ: %6.15 ± %0.64 vs DG: %3.27 ± 0.13% ; p < 0.05; n = 4; Şekil 5A3). Ayrıca, hücre farklılaşması da olgun nöronlar tanımlar nöronal çekirdekleri (NeuN) gibi olgun bir yapıcı ile BrdU boyama birleştirerek erişilebilir(Şekil 5B1,B2). Şekil 5B3, olgun nöronların farklılaşmasını sağlayan çoğalan ataların yüzdesinin SVZ ve DG'de benzer olduğunu göstermektedir (SVZ: %12.04 ± %1.58 vs DG: %13.56 ± 0.48%; p > 0.05; n = 4).
SVZ ve DG kaynaklı NSPC'lerin saplığı ve çok yönlülüğü, farklı farklılaşma günlerinde (DIV2 ve DIV7) farklı belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirerek NSA kullanılarak erişilebilir. Nitekim NSC'ler (nestin- ve glial fibrillary asidik protein [GFAP]-çift pozitif hücreler) her iki nörojenik bölgede de mevcuttur(Şekil 6A,G). Bu hücreler olgunlaşmamış nöronlar (DCX-pozitif hücreler)(Şekil 6B,H),olgun nöronlar (NeuN-pozitif hücreler) (Şekil 6F,L), oligodendrosit öncül hücreleri (nöron-glial antijen 2 [NG2] ve trombosit--- türetilmiş büyüme faktörü reseptörü α [PDGFRα]- pozitif hücreler) (Şekil 6C,I), olgun oligodendrositler (miyelin temel protein [MBP]-pozitif hücreler) (Şekil 6E,K) ve astrositler (GFAP-pozitif hücreler) (Şekil 6D,J).
Farklı substratlar, farklıkoşullar altında hücrelerin psödomonotabakasını oluşturmak için kapakları kaplamak için kullanılabilir. Ek Şekil 1'degösterildiği gibi, örtüler fKÖ veya PDL ile birlikte lamina ekstra kaplamaya sahip olduklarında DG hücreleri sadece PDL'ye göre daha fazla göç eder(Ek Şekil 1B−H). Aslında, PDL ve laminin substrat olarak birlikte kullanıldığında(Ek Şekil 1C,G),DG hücreleri TEK Başına kullanıldığı SVZ hücrelerinden daha etkili bir psödomonolayer oluştururlar (Ek Şekil 1A,E).
Daha da önemlisi, bu sonuçlar NSA'nın iki ana nörojenik nişten elde edilen NSC'lerin kökve çok yönlülük özelliklerini değerlendirme potansiyelini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Şekil 1: Subventriküler zon ve dentat girus türetilmiş NSPC nörosfer ler veya psödomonolayers olarak kültürlü. (A) Temsilcisi brightfield (A1,A3) ve floresan(A2,A4) SVZ görüntüleri- ve DG kaynaklı nörosferler, çekirdekleri Hoechst 33342 ile boyanmış nerede (mavi) ve NSCs Sox2 (yeşil) ve nestin (kırmızı). (B) Farklısal koşullar altında SVZ ve DG kaynaklı nörosferlerden üretilen psödomonolayers'ın temsili parlak alan görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Şekil 2: Hücre çifti teşp. Bir ata hücre bölünmesinden elde edilen hücre çiftlerinin temsili floresan görüntüleri. SVZ ve DG çekirdekleri Hoechst 33342 (mavi), Sox2 (kırmızı) ve nestin (beyaz) için kök benzeri hücrelerin yanı sıra DCX (yeşil) ile olgunlaşmamış nöronlar ile boyandı. A1 ve B1 panellerinde ok uçları Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- simetrik kendi kendini yenileyen bölmeleri gösterir, A1 ve B2 panellerinde oklar Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asimetrik bölmeleri, A2 ve B1 panellerinde kesik çizgi oklarını Gösterir Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ simetrik ayırıcı bölümler gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Şekil 3: Hücre geçişi ile hücre sağkalım analizi. 0, 1, 2 ve 3 pasajdan (P0−P3) sonra, SVZ ve DG kaynaklı farklılaştırılmış nörosfer kültüründe DIV2'deki PI-pozitif hücrelerin kantitatif analizi. Veriler ortalama ± SEM, n = 1−8 olarak ifade edilir. PI = propidium Iodide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Şekil 4: DIV 1, 2 ve 3'te neuritogenez analizi. ΒIII-tubulin sinyali ile tanımlanan nöritlerin temsili konfokal floresan görüntüleri, SVZ ve DG nöronlarında (A,D) DIV1, (B,E) DIV2, ve (C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Şekil 5: Hücre çoğalması tsay. DIV1 in (A1) SVZ ve (A2) DG'deki BrdU-pozitif hücrelerin temsili konfokal görüntüleri. (A3) DG ve SVZ kaynaklı farklılaştırılmış nörosfer kültüründe DIV1'deki BrdU-pozitif hücrelerin kantitatif analizi. Veriler ortalama ± SEM, n = 4 olarak ifade edilir. *p < 0.05 t-testi ile. (B1) SVZ ve (B2) DG'de DIV7'de BrdU ve NeuN-pozitif hücrelerin temsili floresan görüntüleri. Ok uçları BrdU-/NeuN-pozitif hücreleri gösterir. (B3) Her iki nişte de DIV7'deki BrdU-/NeuN-pozitif hücrelerin kantitatif analizi. Veriler ortalama ± SEM, n = 4 olarak ifade edilir. BrdU: 5-bromo-2'-deoksiuridin, sentetik timidin analogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Şekil 6: SVZ ve DG kaynaklı farklılaştırılmış nörosfer kültüründe bulunan nöral hücre tipleri. Hücre çekirdeklerinin Hoechst 33342 (mavi) ve: (A,G) GFAP (yeşil) ve nestin (kırmızı),(B,H)olgunlaşmamış nöronlar için NSC'ler ile boyandığı 2 ve 7 günlük nörosfer farklılaşmasından (DIV2 ve DIV7) sonra SVZ ve DG kaynaklı hücre tiplerinin temsili floresan görüntüleri DCX (yeşil),(C,I) için oligodendrocyte öncül hücreleri PDGFRα (yeşil) ve NG2 (kırmızı), (D,J)GFAP (yeşil), (E,K) MBP için olgun oligodendrocytes (yeşil) ve(F,L)neuN (kırmızı) için olgun nöronlar için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Ek Şekil 1: Nörosfer ekivesi ve göçü için farklı yüzeylerin test edilip psödomonolayer oluşturması. (A,E) SVZ türetilmiş psödomonolayer'ın poli-D-lizin ilerlizini substrat olarak kullanmasının temsili floresan görüntüleri, (B,F) DG-türetilmiş psödomonolayer bir substrat olarak poli-D-lizin kullanarak poli-D-lizin kullanarak, (C,G) Bir substrat olarak laminin ile poli-D-lizin kullanarak DG-türetilmiş psödomonolayer, ve (DGkaynaklı psödomonolayer astrat olarak poli-L-ornithine kullanarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1Ã¢Ë†'3 Mouse Neurogenic Niches at JoVE.com

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Bu makalede, ayrıntılı olarak, postnatal fare nöral kök hücrelerinden nörosfer kültürlerin üretimi için bir protokol ana fare nörojenik nişler türetilmiştir açıklar. Nörosferler öncühücre sayılarının tahmin ine izin beyin dokusundan nöral kök hücreleri tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, bu 3D yapılar farklıkoşullarda kaplanmış olabilir, nöronlar neden, oligodendrositler ve astrositler, hücre kaderini çalışma sağlayan.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Nörosfer tsay, nöral kök/progenitor hücrelerinin hem fizyolojik hem de patolojik bağlamda çoğalma, kendini yenileme ve çok köse gibi doğal özelliklerini incelemek için in vitro tekniğinde yararlıdır. Üç boyutlu yapısı nedeniyle, bu teknik yetişkin nörogenezi incelemek için güçlü bir araçtır. Ayrıca culturing ve nöral kök / progenitor hücrelerinin daha yüksek verim elde etmek için yararlıdır.Bu nörosfer tsay Alzheimer ve Parkinson hastalıkları veya multipl skleroz gibi beyin bozukluklarının çalışma uygulanabilir. Nörosferler de diğer beyin bölgeleri veya sistemleri elde edilebilir, yağ dokusu veya bağırsak gibi. Filipa Ribeiro ile prosedür gösteren Rita Soares, benim grupta bir doktora öğrencisi olacak.Doğum sonrası gün bir ila üç fare beyinleri hasat için, baş Tabanında vücudun ventral kısmını tutun ve kafatası ortaya çıkarmak için başın tüm uzunluğu üzerinde deride bir orta hat kesi yapmak için küçük sivri makas kullanın. Kafatasının tabanında uzunlamasına bir kesi yapın ve beyin yapılarına zarar vermemek için sagital sütür boyunca mümkün olduğunca sığ bir açıyla kesmeye devam edin. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını yanlara soymak ve beynin tabanına bağlı kranial sinirleri ve kan damarlarını kesmek için beynin altında küçük bir spatula kaydırmak için kavisli forceps kullanın.Antibiyotiklerle birlikte soğuk HBSS bir Petri kabıiçine beyin yerleştirin ve düşük büyütme bir diseksiyon mikroskop altında çanak yerleştirin. Beyni sırt yüzeyine yerleştirin. Beyincik tarafından beyin tutarken, beynin ventral tarafında menenjler ve koku ampuller kaldırmak için ince forceps kullanın.Ventral yönü üzerine beyin döndürün ve menenjler geri kalanı soyma. Sonra beyincik kaldırmak ve bir doku helikopter üstünde 11 mikrometre gözenek ile filtre kağıt üzerine beyin aktarmak için kavisli sivri forceps kullanmak için forceps kullanın. SVZ ve DG mikrodiszeksiyon için, 450 mikrometre koronal kesitler içine beyin doğrama ile başlar.Bir diseksiyon mikroskop altında soğuk antibiyotik takviyeli HBSS ile dolu yeni bir Petri çanak içine kesitli beyin toplamak için ıslak bir lamina kullanın ve lateral ventriküller ile dilimler ulaşılana kadar bir anterior-posterior moda koronal dilimleri ayırmak için forseps kullanın. Striatal parankim ve korpus callosum hariç, ventriatal parankim ve korpus callosum hariç ve svz izole etmek için lateral ventrikül hemen bitişik doku içine forseps bir ucunu yerleştirin ve ventriküllerin lateral ventrikül in ince tabakası nı kesmek için ince forseps kullanın. Lateral ventrikül çevreleyen dokuların küçük bir çizgi kesin ve takviye HBSS çözüm içeren bir örnek tüp içine parçalanmış doku toplamak.Tüm dilimler forceps ve hipokampal formasyon ulaşmış ile mikrodissected edilmiş zaman, Hangi DG hala tanınmaz olduğu hipokampus ile ilk dilim atın. DG kaldırmak için, ilk dilimlerden hipokampus izole ve DG çevresindeki sınırları görselleştirmek için mikroskop yeniden odaklama. DG hasat için, DG ve CA1 bölge arasında bir kesim yapmak için forceps kullanın ve DG ve CA3 bölge arasında dikey bir kesim izledi. Sonra fimbria ve herhangi bir komşu doku kaldırmak ve antibiyotik takviyeLI HBSS çözüm ayrı tüp içine hasat doku yerleştirin.SVZ ve DG örneklerini ayırmak için, 37 santigrat derecede yaklaşık 50 dakikalık bir kuluçka için her tüpe HBSS'de %5-10 oranında ki Trypsin-EDTA%5-10'luk son konsantrasyona Trypsin-EDTA%0,05 ekleyin. Tripsin veya çok uzun kuluçka süresinin tüm kullanımı hücre ölümünün artmasına yol açarak hücre büyümesini olumsuz etkileyebilir. Doku birlikte kümelenmiş olduğunda, yıkama başına taze takviyeLI HBSS bir mililitre ile dört ardışık yıkama için enzim çözeltisi değiştirin.Son yıkamadan sonra, serumsuz orta bir mililitre sindirilmiş dokular epidermal büyüme faktörü mililitre başına 10 nanogram ve tüp başına temel fibroblast büyüme faktörü mililitre başına beş nanogram ile takviye. Daha sonra homojen bir hücre çözeltisi elde edilene kadar p1000 pipet ile 7-10 kez hafif pipetleme ile dokuları mekanik olarak ayrıştırın. Ayrıştırılmış DG veya SVG hücresinin yoğunluğunu belirlemek için, her süspansiyondaki hücreleri hematositometrede sayın.Nörosferler içine hücreleri genişletmek için, büyüme faktörleri ile desteklenen serum içermeyen ortamda mililitre yoğunluğu başına dördüncü hücrelere iki kez on bireysel hücre popülasyonları seyreltmek ve kaplanmamış içine hücre süspansiyon beş mililitre tohum 60 milimetre çapında Petri yemekleri. Daha sonra SVZ hücrelerini altı ila sekiz gün, DG hücrelerini ise primer nörosfer oluşumu için 37 derece santigrat derecede 10 ila 12 gün kuluçkaya yatırın. Nörosferlerin çoğunluğu 150 ila 200 mikrometre çapa sahip olduğunda, kültürlerden hücre süspansiyon hasat ve santrifüj ile nörosferler toplamak.Başka bir santrifüj ile hücreleri toplamadan önce üreticinin talimatlarına göre bir fare kimyasal dissociation kiti ile nörosfer palet resuspend. Supernatant'ı büyüme faktörleri ile desteklenen bir mililitre serumsuz ortamla değiştirin ve peleti yaklaşık 10 kez hafifçe derecelendirmeye çalışın. Gösterildiği gibi ayrıştırılmış nöro hücreleri saymak ve serum içermeyen ortamda mililitre yoğunluğu başına dördüncü hücrelere iki kez 10 hücreleri reseed yeni içine büyüme faktörleri ile takviye 60 mililitre Petri yemekleri.Daha sonra hücreyi hücre kültürünün kuluçka makinesine geri döndürün ve ikincil nörosferleri elde etmek için 6 ila 8 veya 10 ila 12 gün daha geçirin. Nörosfer testi kullanılarak elde edilen SVG ve DG nörosferleri farklılaşmamış Sox2 pozitif, nestin pozitif hücrelerden oluşur. Özellikle, SVG türetilmiş nörosferler Onların DG meslektaşlarına göre daha büyük boyutlara sahip.Daha da önemlisi, farklılaşma koşullarında, SVG ve DG kaynaklı nöral kök/progenitor hücreleri nörosferlerin dışına göç ederek bir hücre pseudomonolayer oluştururlar. Her iki nörojenik bölgede de Sox2 çift pozitif, nestin çift pozitif, çift kortinin çift negatif hücre çiftlerinin varlığını, kendini yenilemeye işaret eden simetrik bölünmelere karşılık gelen gözönünde bulundurabilir. Hücre çiftleri içinde hangi Sox2 pozitif bir hücre, nestin pozitif, ve doublecortin negatif, ve diğer hücre Sox2 negatif, nestin negatif, ve doublecortin pozitif asimetrik bölünmeler gösteren.Ve Sox2 çift negatif, nestin çift negatif, ve çift cortin çift pozitif hücre çiftleri simetrik bölünmelere karşılık gelen farklılaşmayı gösterir. Genel olarak, geçiş in vitro ikinci gün hücre ölüm oranını değiştirir. Neuritogenez, farklılaşmanın başlangıcında SVG ve DG nöral kök/progenitor hücrelerinin farklılaşmasından elde edilen nöronlarda değerlendirilebilir.Görüldüğü gibi, nöritlerin uzunluğu ve sonucu farklılaşma ile artar. SVG'de DG'ye göre yüksek oranda proliferatif hücre yüzdesi gözlenmektedir. Olgun nöronların farklılaşmasına rağmen çoğalan ataların yüzdesi her iki nörojenik nişlerde de benzerdir. Her iki hücre tipi de olgunlaşmamış nöronlar, olgun nötronlar, oligodendrocytes öncühücreleri, olgun oligodendrocytes ve astrositler ayırt edebiliyoruz.Nörosferler elde ettikten sonra, nöral kök/progenitör hücrelerinin köklüğünü ve çok yönlülüğünü incelemek için immünositokimya, kalsiyum görüntüleme, Batı lekeleri ve RT-PCR gibi çeşitli yöntemler uygulanabilir. Nörosfer tsay daha moleküler ve hücresel süreçleri hem çoğalması ve nöral kök / progenitor hücrelerinin farklılaşması dahil değerlendirmek için genetik ve hastalık modelleri uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Postnatal Fare Serebellum prominin-1+ Kök Hücrelerin Safifikasyon

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Yetişkin Çayır Voles Nörojenik Nişler Türetilmiş Nörosferkültürü

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...