Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR منحة #MOP142219).

1. الفحص الأولي: زراعة الخلايا وبذر الصفيحة
<ol><li>لإعداد لوحات بولي-L-ليسين (PLL)، الاستغناء 20 ميكرولتر/بئر من 25 ميكروغرام/مل من محلول الأسهم PLL في الأبيض أو الأسود 384-well لوحات القاع البصرية باستخدام ماصة متعددة القنوات الإلكترونية أو موزع كاشف. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5-2 ساعة. ...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

وGPCRs ديناميكية تشكيلية هي القوى من نقل الإشارات. الخصائص الفيزيوكيميائية للجيوب الملزمة لهذه المستقبلات heptahelical، فضلا عن أهميتها الفسيولوجية تؤكد الحاجة إلى أدوات فحص جي بي سي آر ليغاند. وكما هو موضح أعلاه، فإن اختبار PRESTO-Tango سريع وحساس وسهل الاستخدام، ويضفي نفسه على تطوير المخدرات. ليس فق...

تشكل مستقبلات البروتين G-المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة وأكثرها تنوعًا من البروتينات عبر الغشاء ، وتعمل كواجهات اتصال بين الخلية وبيئتها1. ويبرز براعة GPCRs من خلال قدرتها على الكشف عن مجموعة متنوعة من ligands - من الناقلات العصبية إلى النيوكليوتيدات ، والببتيدات إلى الفوتونز ، وغيرها الكثير ، فضلا عن قدرتها على تنظيم العديد من الشلالات إشارات المصب المشاركة في النمو الخلوي ، والهجرة ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، وإطلاق الخلايا ، وما إلى ذلك2،3. وبالنظر إلى انتشارها ومشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية ، فإن هذه العائلة المستقبلة ذات أهمية علاجية قصوى ، ويتضح ذلك من خلال حقيقة أن أكثر من ثلث الأدوية الموصوفة المتاحة حاليًا تستهدف GPCRs4. ومع ذلك، تستهدف هذه العلاجات الموجودة فقط مجموعة فرعية صغيرة من الأسرة الخارقة (ما يقدر بـ 10٪)، ولا يزال علم الأدوية للعديد من وحدات المعالجة بالأدوية الوراثية غير مُستوضح. وعلاوة على ذلك، أكثر من 100 GPCRs موجودة كمستقبلات اليتيم، كما أنها لم تكن مطابقة مع ligand الذاتية5. وبالتالي ، فإن فحص GPCR ligand أمر بالغ الأهمية في إزالة التيتم وتطوير الدواء ، لأنه يمهد الطريق نحو اكتشاف الرصاص والتحسين ، وربما إلى مرحلة التجربة السريرية.
وقد انخفضت أساليب فحص جي بي سي جي ليغاند تقليديا في واحدة من فئتين، G-البروتين تعتمد أو G-البروتين مستقل مقالات وظيفية6. يتم تنظيم إشارات GPCR من قبل البروتينات G-البروتينات الغيرية (Gααα) ، والتي يتم تنشيطها من خلال تبادل GTP للناتج المحلي الإجمالي المقيد على الوحدة الفرعية Gα7. يتم نقل الإشارات من المستقبلات المنشطة بواسطة G-proteins عبر الرسل الثانوية ، مثل cAMP ، الكالسيوم ، DAG ، و IP3 ، للتوسط في إشارات المصب في المؤثرات المصب8. وقد استغلت طبيعة العواقب الوظيفية للإشارة G-البروتين لإنشاء الخلايا القائمة على المقالات التي تعكس تنشيط مستقبلات. هذه الأساليب، التي تقيس الأحداث القريبة (المباشرة) أو البعيدة (غير المباشرة) في إشارات G-protein، تستخدم في أغلب الأحيان لفحص GPCR ligand وقد استخدمت بشكل رئيسي في دراسات إزالة التيتم6. أمثلة على الاختبارات التي تقيس مباشرة GPCR بوساطة تنشيط G-البروتين تشمل [35S] GTPаS ملزمة للتحليل، الذي يقيس ملزمة من التسمية الإشعاعية وغير hydrolyzable GTP التناظرية إلى الوحدة الفرعية Gα، وFörster / bioluminescence نقل الطاقة بالرنين (FRET / بريت، على التوالي) تحقيقات لرصد GPCR-Gα وGα / Gα التفاعلات، والتي تم كسب المزيد من الجر على مدى السنوات9،10. المقالات التي ترصد الأحداث البعيدة هي الأدوات الأكثر استخدامًا لتنميط GPCR؛ على سبيل المثال، يقيس cAMP وIP1/3 التراكم داخل الخلايا للرسل الثانويين المعتمدين على G-protein، في حين أن [Ca2+]التدفق ومقالات المراسل ة التي تنطوي على عناصر استجابة محددة متورطة في تنشيط G-protein (CRE، NFAT-RE، SRE، SRF-RE) تفحص الأحداث بشكل أكبر في اتجاه التعاقب الالإشارات11. في حين أن معظم المقالات المذكورة أعلاه يمكن أن يتم إجراؤها على مستوى الإنتاجية العالية، حساسة إلى حد ما ، وتتباهى ببعض المزايا الخاصة بالقياس (على سبيل المثال ، التمييز بين الناهضات الكاملة / الجزئية ، والخصوم المحايدين والمناهضين العكسيين في حالة ربط GTPаS ، أو وظيفة القياس على الخلايا الحية مثل [Ca2 +] و IP1/3)6، للأسف لا توجد طرق تعتمد على البروتين G تناسب استجواب GPCR-ome القابل للتخدير بالكامل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى اقتران الأصلي من الأسر الفرعية G-البروتين متعددة إلى GPCRs، مما أدى إلى إشارات في العديد من السلاسل التعاقبية واقتران البروتين G غير معروف في GPCRs اليتيم. للتخفيف من هذه المسألة، وقد وضعت المقالات لفرض مشوش G-البروتين اقتران من خلال إشارة واحدة مشتركة القراءة، مثل cAMP، وكاليفورنيا2 +، وإن كان معظمهم من الإنتاجية المنخفضة12.
أحد الجوانب الهامة في دورة حياة GPCR هو إنهاء الإشارات المعتمدة على البروتين G ، والتي تحدث في جزء كبير منها من خلال تجنيد α-arrestins الذي يؤدي إلى تفكك بروتين G ، وفي نهاية المطاف إزالة الحساسية من المستقبل ، والتي تستهدف الاستيعاب الداخلي المغلف بالكلاترين13. الأشكال المتساوية الأكثر تعبيراً في كل مكان من α-arrestin هي α-arrestin1 و α-arrestin2 غير البصرية، المشار إليها أيضاً باسم arrestin-2 وarrestin-3، على التوالي14. أدخل G-البروتين المستقلة الخلايا القائمة على المقالات, التي تضيف بعدا جديدا لفحص LIGAND GPCR; مستقبلات الاتجار، خلية كاملة خالية من التسمية، ومقال التوظيف α-arrestin كلها أمثلة بارزة. اختبارات الاتجار GPCR تستخدم الليغاند المسمى الفلوروفورأو الأجسام المضادة المشتركة التي تستهدفالمستقبلات 15، في حين تستخدم اختبارات الخلايا الكاملة الخالية من التسمية أجهزة الاستشعار الحيوية التي تترجم التغيرات الخلوية الناجمة عن الربط بالليجة إلى مخرجات قابلة للقياس الكمي ، مثل الإشارات الكهربائية أو البصرية16. وتجدر الإشارة إلى أن تفاعلات GPCR-α-arrestin الجوهرية تُعنى بعملية اختبار التوظيف باعتبارها أداة جذابة في ذخيرة المقالات الجوهرية17. نظام التانغو، الذي طوره بارينا وآخرون قبل عقد واحد فقط، ينطوي على إدخال ثلاثة عناصر وراثية خارجية: مزيج البروتين يتكون من α-arrestin2 مع بروتياز فيروس حفر التبغ (TEVp)، وهو محول التتراسيكلين (tTA) الذي يرتبط GPCR عن طريق فيروس حفر التبغ موقع انشقاق البروتياز (TEVcs) ويسبقه تسلسل من C-terminus من مستقبلات V2 فاسوبريسين (V2 الذيل) لتعزيز تجنيد arrestin، وجين لوسيفيراز المراسل الذي يتم تشغيل النسخ من قبل tTA نسخ عامل نقل إلى نواة، والتي يتم تحريرها من رسو الغشاء بعد تجنيد α-arrestin2(الشكل 1)18. ويمكن بعد ذلك تحديد القراءات الكمية لتفعيل GPCR وتجنيد α-arrestin2 من خلال القراءة للتلأل. وثمة تمييز ملحوظ هو أنه في حين أن الاتجار بالمستقبلات وطرق الخلايا الكاملة الخالية من التسمية منخفضة الإنتاجية نسبيًا ، فإن التانغو له العديد من المزايا ، بما في ذلك القراءة الانتقائية الخاصة بالمستقبل المستهدف والحساسية بسبب تكامل الإشارة ، مما يجعله مرشحًا مناسبًا لفحص ligand على نطاق أوسع18.
في ضوء هذه الميزات الاستراتيجية ، طورت Kroeze وآخرون PRESTO-Tango (التعبير المتوازي للمستقبلات -ome والفرز عبر النسخ الإخراج -Tango) ، وهي منصة مفتوحة المصدر عالية الإنتاجية تستخدم نهج Tango لتوصيف GPCR-ome القابل للتخدير بطريقة متوازية ومتزامنة19. استغلال "مشوش" تجنيد α-arrestin2 إلى ما يقرب من جميع GPCRs، PRESTO-Tango هو الأول من نوعه من حيث الاختبارات الوظيفية القائمة على الخلية، مما يتيح الفحص السريع "الجولة الأولى" من مركبات الجزيئات الصغيرة في جميع GPCRs تقريبا غير الشمية، بما في ذلك الأيتام، مستقلة عن اقتران الأسرة الفرعية G-البروتين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

باعتبارها أكبر وأكثر تنوعا الجينات superfamily والوسطاء من سلسلة من مسارات الإشارات الخلوية، G-البروتين مقرونة مستقبلات (GPCRs) تمثل واحدة من الأهداف الواعدة لصناعة الأدوية. Ergo ، وتصميم وتنفيذ وتحسين GPCR ligand فحص المقالات أمر بالغ الأهمية ، لأنها تمثل أدوات التحكم عن بعد لاكتشاف المخدرات والتلاعب الدوائية GPCR والنتائج. في الماضي ، كانت المقالات المعتمدة على البروتين G تجسد هذا المجال من البحث ، واكتشاف الأحداث الناجمة عن ligand وتحديد عدد الرسل الثانويين. ومع ذلك ، منذ ظهور الانتقائية الوظيفية ، فضلا عن زيادة الوعي بعدة مسارات أخرى G المستقلة عن البروتين والقيود المرتبطة بمقالات G-البروتين تعتمد ، هناك دفعة أكبر نحو خلق بديل GPCR ligand فحص المقالات. نحو هذا المسعى ، ونحن نصف تطبيق واحد من هذه الموارد ، ومنصة PRESTO - Tango ، وهو نظام قائم على مراسل luciferase التي تمكن من الاستجواب المتوازي والمتزامن للGPCR -ome الإنسان ، وهو إنجاز كان ينظر فيه سابقا من الناحية الفنية والاقتصادية غير مجدية. واستناداً إلى اختبار تجنيد مستقل من نوع G-protein-ed-arrestin2، فإن عالمية الاتجار ببوساطة α-arrestin2 والإشارة في GPCRs تجعل PRESTO-TANGO أداة ملائمة لدراسة ما يقرب من 300 من وحدات GPCRs البشرية غير الشمية، بما في ذلك ما يقرب من 100 مستقبلات اليتيم. حساسية PRESTO-Tango وقوتها تجعلها مناسبة للشاشات الأولية عالية الإنتاجية باستخدام المكتبات المركبة ، وتستخدم للكشف عن أهداف GPCR جديدة للأدوية المعروفة أو لاكتشاف ليغاند جديدة للمستقبلات اليتيمة.

باستخدام بروتوكول PRESTO-Tango المعروض هنا ، تم فحص مستخلص حبيبات الكرومافين (CG) مقابل 168 هدفًا من أهداف GPCR غير الشمية ، وغالبيتها هي مستقبلات يتيمة. تم تنفيذ التنميط من استخراج وقال من خلال فحص تعبئة α-arrestin2 في المستقبلات المختارة، استنادا إلى المبدأ الذي صممه بارنيا وآخرون18 <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

وبالنظر إلى أن الـ GPCRs أهداف جذابة قابلة للتخدير، فإن فحص GPCR ligand أمر لا غنى عنه لتحديد مركبات الرصاص ودراسات إزالة التيتم. نحو هذه الجهود، ونحن نصف PRESTO-Tango، منصة موارد مفتوحة المصدر تستخدم للتنميط المتزامن للتجنيد العابر في حوالي 300 GPCRs باستخدام تقييم مراسل TEV.

استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

وقد وضعت منصة بريستو تانجو لتنفيذ استجواب بالتوازي وفي وقت واحد من جميع GPCRs غير مُعدة في الجينوم البشري، بما في ذلك أن الأهداف اليتيمة لفرز الاعتقال بيتا-2 الناجمة عن اللغمة. منصة بريستو تانجو هي المورد الوحيد المفتوح المصدر لتوصيف الجينوم GPCR بأكمله في نهج مواز، وذلك باستخدام اختبار التوظيف بيتا-الاعتقال المستقلة بروتين G. مما يدل على المعالج سيكون جنفياف لاروش باحث مشارك في مختبري ، ومانيل Zighal ، وهو مرشح دكتوراه في مختبري.قبل البدء في العملية إضافة 20 ميكرولتر من 25 ميكروغرام لكل ملليلتر بولي-L-lysine حل لكل بئر من العدد التجريبي المناسب من 384 لوحات القاع البصرية واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. في نهاية الحضانة، نفض الغبار لوحات على الحوض لإزالة الزائدة بولي-L-ليسين وإضافة 40 ميكرولترات من محلول مضاد للمضادات الحيوية لكل بئر. ثم احتضان اللوحات اللازمة لبذات الخلايا في 37 درجة مئوية ووضع بقية لوحات في أربع درجات مئوية لتخزين على المدى الطويل.لذر بذور خلايا HTLA للفحص الأولي، شطف بلطف التقاء 150 ملليمتر الثقافات الخلية مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل معالجة الثقافات مع ستة ملليلتر من 0.05٪التربسين EDTA لكل طبق. عندما يكون الخلايا منفصلة تجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على وحدة تخزين متساوية من DMEM. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق بيليه في 2.2 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز DMEM ونفض الغبار لوحات على الحوض لإزالة محلول مضاد للمضادات الحيوية. انقر على لوحات لتجف والبذور 45 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر. ثم ضع اللوحات عند 37 درجة مئوية و 45٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.لإعداد 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة لtransfection توزيع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من كل بلازميد ترميز الحمض النووي مجانا 96 96 جيدا 96 لوحة. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل يدويا 10 ميكرولترات من حل الحمض النووي من كل بئر من 96 بئر لوحة إلى آبار فردية من واحد 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة في رباعية لكل حالة كما هو موضح. بعد ذلك، نقل 40 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم 0.313 المولر إلى كل بئر من صحن مصدر الحمض النووي وخلط محتويات كل بئر بلطف.إضافة 50 ميكرولترات من 2x HEPES العازلة إلى كل بئر من 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة مع خلط لطيف. بعد نقل دقيقة واحدة 10 ميكرولترات من خليط الحمض النووي من 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة إلى كل بئر من خلايا HTLA المصنفة واحتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي decant الخلية العابرة المتوسطة وإضافة ببطء 40 microliters من المتوسط تجويع إلى كل بئر مع الحرص على عدم لمس الخلايا مباشرة.ثم إضافة 20 ميكرولترات من العازلة السيارة للصفوف بالتناوب دون مركب في 20 ميكرولترات من مجمع الفائدة في تركيز ثلاث مرات في الصفوف بالتناوب، قبل أن يعود لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. 16 إلى 24 ساعة بعد التحفيز 1000000 10000 1000000 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ثم قراءة لوحات على منضدة الإنارة لوحة صغيرة مع وقت التكامل من ثانية واحدة في بئر.للفحص الثانوي، وزراعة فرعية الخلايا HTLA في أطباق 100 ملليمتر في خمس مرات 10 إلى الخلايا الستة إجمالي كثافة الخلايا في 11 ملليمتر من المتوسط الكامل لكل طبق لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، مختلطة 10 ميكروغرام من الحمض النووي GPCR مجانية مع 500 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم تريس-EDTA مع دوامة تليها إضافة 500 ميكرولترات من العازلة HEPES. بعد اهتزاز قوي، احتضان الحل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وعلى الفور إضافة ملليلتر واحد من الحل إسقاط الحكمة على الخلايا.صخرة بلطف لتوزيع الترسبات بالتساوي ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، تحقق من كفاءة النقل تحت صورة خلية فلورية. المعاملات التي تزيد عن 50٪ من التغطية مثالية.شطف بلطف الخلايا المصابة مع حل الآية قبل فصل الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من 0.05٪تريبسين EDTA. جمع الخلايا المتفككة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من التركيز المتوسط الجائع. ثم بذور 45 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من بولي L-ليسين مشفرة 384 لوحة جيدا ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات على الأقل.لإعداد نصف سجل لوحة استجابة الجرعة منحنى إضافة 270 microliters من HBSS تستكمل مع HEPES والمضادات الحيوية المضادة للمضادات الحيوية للجميع ولكن الصف الأخير من لوحة 96 جيدا وإضافة 30 ميكرولترات من كل محلول المخدرات عالية ومنخفضة لآبار الصف H.Transfer الحل من كل بئر من الصف H في بئر المقابلة من الصف G مع خلط والاستمرار في تخفيف المسلسل مركبات المخدرات حتى الصف الأخير من لوحة يتم الوصول. باستخدام التخطيطي كمرجع، مزيج 20 ميكرولترات من التخفيفات العمود المنخفض من الصفوف A إلى G من لوحة 96 بئر و 20 ميكرولترات من التخفيفات العمود عالية إلى الآبار B خلال H من لوحة البئر 96 إلى لوحة البئر 384 الجالسة سابقا. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 16 ساعة.16 إلى 24 ساعة بعد التحفيز 1100000 1200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 في هذه التجربة التمثيلية، من أصل 168 GPCRs التي تم استجوابهم في الفحص الأولي، فقط مستقبلات الدوبامين D3 وOPSIN 5 كانت المتنافسين كأهداف نشطة محتملة. أنتجت مستقبلات الدوبامين D3 تغيير log2 أضعاف كبيرة من 4.7 في حين أن opsin 5 أنتجت استجابة أقل قليلا من 2.39.على سبيل المقارنة, الدوبامين مستقبلات D2, التحكم الإيجابي للشاشة الأساسية أنتجت تغيير log2 أضعاف 4.58. وأظهرت منحنيات الاستجابة تلك من الفحص الثانوي أن استخراج حبيبات الكروماتين تنتج نوافذ إشارة مماثلة في قيم تركيز فعالة نصف قصوى إلى quinpirole تؤكد صحتها كضربة نشطة في مستقبلات الدوبامين D3. تم إنتاج منحنى جرعة مسطحة مماثلة للسيطرة السلبية لopsin 5 ولكن استبعاد هذا المستقبل كهدف ممكن لاستخراج حبيبات الكروماتين. Presto-Tango يتطلب عناية خاصة كما variabilities في توزيع الخلايا، كفاءة transfection والتخفيفات المخدرات المسلسل يمكن أن يؤدي إلى خطأ مركب، والتي يمكن أن تؤثر على دقة البيانات.يمكن استخدام الطرق المتعامدة مثل نهج الربط الإشعاعي ، ونقل الطاقة الرنين الحيوي والكالسيوم المتفاعل AMP واستيعاب الخضوع الوظيفي لتأكيد تفاعلات مستقبلات الليغمة ووصفها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...