Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

这项工作得到了加拿大卫生研究所（CIHR赠款#MOP142219）的支持。

1. 初级筛选：细胞培养和板播种
<ol><li>要制备聚-L-赖因 （PLL） 涂层板，请使用电子多通道移液器或试剂分配器在白色或黑色 384 孔光学底板上分配 25 μg/mL PLL 的 20 μL/mL 库存溶液。在室温下孵育板 0.5~2 小时。 注：如果使用黑色 384 孔板，则预计背景信号比白色板低。建议使用黑色板来减少相邻井之间的发光。</li>
	<li>要保留涂层板并洗掉多余的 PLL，请将其轻拂到水槽上，用纸巾轻点干燥，并?...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

构象动态 GPCR 是信号转导的强大动力。这些七边螺旋受体结合口袋的物理化学特性及其生理相关性强调了GPCR配体筛选工具的需求。如上所述，PRESTO探戈测定是快速、敏感和方便用户，适合药物开发。这种测定不仅测量了激动剂引起的活化，还可以用来量化拮抗剂和利器调制器19的活性。鉴于功能选择性，一个概念，表明不同的药物结构可以引起不同的受体信号级联在一个单一的?...

G-蛋白质耦合受体（GPCRs）是最大、最多样化的跨膜蛋白系列，作为细胞与环境之间的通信接口运行。GPCR 的多功能性因它们能够检测各种配体（从神经递质到核苷酸、肽到光子等）的能力，以及它们调节大量涉及细胞生长、迁移、分化、凋亡、细胞激发等的下游信号级联的能力。考虑到它们无处不在和参与多种生理过程，这种受体家族具有最重要的治疗意义，目前超过三分之一的处方药针对GPCRs4。然而，这些现有的治疗只针对一小部分的超级家族（估计10%），和许多GPCR的药理学仍然未被阐明。此外，100多个GPCRs作为孤儿受体存在，因为它们没有与内源配体5相匹配。因此，GPCR配体筛选在脱化和药物开发中至关重要，因为它为铅发现和优化铺平了道路，并可能进入临床试验阶段。
GPCR配体筛选方法传统上属于两类之一，即G蛋白依赖或G蛋白独立功能测定6。GPCR 信号由异质 G-蛋白质 （G+） 调节，通过将 GTP 交换到 G# 子单元7上的 GDP 激活。来自激活受体的信号由G蛋白通过二次信使（如cAMP、钙、DAG和IP3）传递，以调解下游效应器8的下游信号。G蛋白信号的功能后果的性质已被利用来创建反映受体活化的基于细胞的检测。这些方法测量G蛋白信号中的近端（直接）或远端（间接）事件，最常用于GPCR配体筛选，主要用于脱化研究6。直接测量GPCR介导G蛋白活化的测定示例包括 [35S]GTP_S 结合测定， 测量与G+子单元模拟的放射性标记和非水解GTP的绑定，以及Fürster/生物发光共振能量转移（分别为FRET/BRET）探测器，以监测GPCR-G+和G+/G®相互作用，这些相互作用在9、10年间获得了更大的牵引力。分析监视器远端事件是 GPCR 分析最常用的工具;例如，cAMP和IP1/3测定测量G蛋白依赖性辅助信使的细胞内积累，而[Ca2]通量和报告器检测涉及与G蛋白活化相关的特定响应元素（CRE、NFAT-RE、SRE、SRF-RE）检查信号级联11下游事件。虽然上述大多数检测都可以在高吞吐量级别执行， 是相当敏感的，并夸耀某些测定特异性的优点（例如，在GTP_S结合的情况下，全/偏激动剂、中性拮抗剂和反向激动剂之间的歧视，或对活细胞（如[Ca2]和IP1/3）6的检测功能，不幸的是，没有现有的G蛋白依赖方法适合对整个可摄药GPCR-ome的询问。这主要是由于多个G蛋白子家族与GPCR的本机耦合，导致多个级联的信号和孤儿GPCR未知G蛋白耦合。为了缓解此问题，已开发出一种测定方法，通过单个通用信令读出（如 cAMP 和 Ca2+）强制混合 G 蛋白耦合，尽管大多数是低通量12。
GPCR生命周期的一个重要方面是G-蛋白依赖性信号的终止，这在很大程度上是通过招募β-逮捕素，导致G蛋白分离，并最终使受体脱敏，这是针对克拉林涂层内化13。最普遍表达的β-逮捕形式是非视觉β-逮捕1和β-逮捕2，也分别表示为逮捕-2和逮捕-3，分别为14。输入G蛋白独立细胞基测定，为GPCR配体筛选增加新的维度;受体贩运、无标签全细胞和β-逮捕招募检测都是值得注意的例子。GPCR贩运测定使用氟磷标记配体或联合内化抗体针对受体15，而无标签全细胞检测使用生物传感器，将配体结合引起的细胞变化转化为可量化输出，如电信或光学信号16。值得注意的是，典型的GPCR-β-逮捕互动时尚β-逮捕在招聘检测作为一个有吸引力的工具，在功能测定的剧目17。探戈系统，最初由巴内亚等人开发，直到十年前， 涉及引入三种外源遗传元素：由β-卡丁2与烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）组成的蛋白质融合，一种通过烟草蚀刻与GPCR相连的四环素转导剂（tTA）。 病毒蛋白酶裂解部位（TEVcs），前面是V2血管加压素受体（V2尾部）的C端序，以促进逮捕招募，和记者卢卡皮基因的转录是由tTA 转录因子转移到核，在β-逮捕2招募后从膜锚定中释放出来（图1）18。GPCR 激活和 β-逮捕2 招聘的定量读数随后可以通过读数来确定为发光。一个值得注意的区别是，虽然受体贩运和无标签全细胞方法的通量相对较低，探戈有几个优点，包括选择性读出是特定于目标受体和灵敏度由于信号集成，这使得它适合选择配体筛选在更大规模18。
鉴于这些战略特征，Kroeze等人开发了PRESTO-Tango（通过转录输出探戈进行平行受体-渗透表达和筛选），这是一个高通量开源平台，使用探戈方法以并行和同时的方式对可的药物GPCR-ome进行剖面分析。PRESTO-Tango 利用"混杂性"招募 β-逮捕2到几乎所有 GPCRs，在基于细胞的功能测定方面是首创的，几乎可以在所有非嗅觉性 GPCRs（包括孤儿）中快速"第一轮"筛选小分子化合物，而与 G-蛋白子家族耦合无关。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

作为最大和最通用的基因超级家族和一系列细胞信号通路的中介，G-蛋白质耦合受体（GPCRs）是制药行业最有希望的目标之一。Ergo，GPCR配体筛选测定的设计、实施和优化至关重要，因为它们代表了用于药物发现和操纵GPCR药理学和结果的远程控制工具。过去，G蛋白依赖性测定是这一研究领域的典型化，它检测了配体引起的事件，并量化了二次信使的生成。然而，由于功能选择性的出现，以及对其他几个与G蛋白无关途径的认识，以及与G蛋白依赖性测定相关的局限性的增强，在创造替代方法方面有了更大的推动GPCR 配体筛选测定。为了这一努力，我们描述了一个这样的资源，PRESTO-Tango平台的应用，一个基于荧光酶的记者系统，能够并行和同时询问人类GPCR-ome，这一壮举以前被认为是技术和经济上不可行。基于G蛋白独立β-逮捕2招募测定，在GPCR中，β-逮捕2中介贩运和信号的普遍性使PRESTO-TANGO成为研究大约300个非嗅觉人类全球活动能力（包括约100种）的合适工具。孤儿受体。PRESTO-Tango 的灵敏度和鲁棒性使其适用于使用复合库的主要高通量屏幕，用于发现已知药物的新 GPCR 靶点或发现用于孤儿受体的新配体。

使用本文介绍的PRESTO-Tango协议，对168个非嗅觉GPCR靶点筛选了一种色胺素颗粒（CG）提取物，其中大多数是孤儿受体。根据Barnea等人18所设计的原则（图1），通过检查所选受体的β-arrestin2动员，对上述提取物进行分析。感兴趣的GPCCr的质粒体cDNA取自PRESTO-Tango GPCR套件，并组装成两个96孔板，在所需的布局。总共，用HTLA细胞种子的四个384孔板被转染，因为96孔DNA...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

鉴于全球化学品资源是有吸引力的可药物靶点，因此GPCR配体筛查对于确定铅化合物和脱化研究是必不可少的。为了这些努力，我们描述了PRESTO-Tango，一个开源资源平台，用于使用基于TEV的记者分析，同时分析在大约300个全球资源中的瞬态β-逮捕2招募。

使用 PRESTO-Tango Assay 在 GPCR-宽范围范围内对 β-Arrestin2 进行配制筛查的平行审讯

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Presto-Tango平台旨在对人类基因组中所有非植物GPCRs进行平行和同时的审讯，包括将2个招募中配体诱导的β-逮捕的孤立目标剖面。Presto-Tango 平台是使用 G 蛋白独立 β-arrestin 招募检测以并行方法分析整个 GPCR 基因组的唯一开源资源。演示处理器的将是吉纳维夫·拉罗什，我实验室的研究员，以及我实验室的博士生马内尔·齐加尔。在开始手术之前，将每毫升聚L-莱辛溶液20微升添加到384个光学底板的适当实验编号的每个孔中，并在室温下孵育板30分钟至两个小时。在孵育结束时，在水槽上轻拂板，去除多余的聚L-lysine，并在每孔中加入40微升抗生素抗霉菌溶液。然后在37摄氏度下孵育细胞种子所需的板，将其余板放在4摄氏度，以长期储存。要播种HTLA细胞进行初级筛选，在每盘用6毫升0.05%的三丁鱼EDTA治疗培养物之前，用10毫升PBS轻轻冲洗150毫米细胞培养物。当细胞分离池时，细胞悬浮在含有相同容积的50毫升圆锥管中。通过离心收集细胞。每毫升DMEM浓度的2.2倍至第5个细胞重新悬浮颗粒，并在水槽上轻拂板，以去除抗生素抗霉菌溶液。敲击板干燥，将45微升的细胞播种到每口井中。然后将板在37摄氏度和45%的二氧化碳过夜。为了准备384井DNA源板的转染分配50毫微克每毫升每个质粒免费DNA编码GPRC探戈结构感兴趣的0.1X三叶-EDTA每个井到96井板的每一个井。使用多通道移液器，将 96 孔板的每个孔的 10 微升 DNA 溶液手动转移到 384 孔 DNA 源板的单个孔中，每个条件都使用四重奏，如图所示。接下来，将 0.313 摩尔氯化钙溶液的 40 微升转移到 DNA 源板的每个井中，轻轻混合每个井的含量。将 50 微升 2 倍 HEPES 缓冲液加入 384 井 DNA 源板的每个井中，轻轻混合。一分钟后，将10微升的DNA转染混合物从384井DNA源板转移到每个种子HTLA细胞的井中，并孵育细胞培养箱中的细胞过夜。第二天，将转染细胞培养，慢慢将40微升的饥饿介质添加到每井中，注意不要直接接触细胞。然后将20微升的车辆缓冲液加入，用于在20微升的复合物中，在20微升的复合物中，以三倍浓度将交替行，然后将板返回细胞培养箱。刺激后16至24小时，将转染细胞培养棒化，并在每井中加入20微升新鲜准备的发光试剂，在室温下孵育5至20分钟，不受光线影响。然后读取微板发光计数器上的板，每孔一秒的集成时间。对于二次筛选，将 100 毫米培养皿中的 HTLA 细胞以 5 倍 10 到 6 个细胞的总细胞密度，每盘 11 毫米完整介质，在 37 摄氏度下 24 小时进行。第二天，将10微克GPCR免费DNA与500微升的Tris-EDTA氯化钙溶液与涡流混合，然后加入500微升的 HEPES 缓冲液。剧烈摇晃后，在室温下孵育溶液一分钟，并立即将溶液的一毫升滴到细胞上。轻轻岩石均匀分布沉淀物，并将板在 37 摄氏度下放置 24 小时。第二天，检查荧光细胞成像器下的转染效率。超过 50% 覆盖率的交易是理想的交易。用三毫升0.05%的三叶草EDTA分离细胞之前，用诗句溶液轻轻冲洗转染细胞。通过离心收集分离的细胞，并在每毫升饥饿的中等浓度的四倍十至五分之五的细胞中重新悬浮颗粒。然后将45微升细胞种子播种到多L-lysine编码的384井板的每个井中，并在细胞培养培养箱中放置该板至少4小时。准备半日志剂量曲线响应板添加270微升HPSS补充HPES和抗生素抗霉菌到所有，但最后一行96井板，并添加30微升的每个高和低药物溶液到行H.转移溶液从每一行H到相应的井的行G混合，并继续连续稀释药物化合物，直到最后一行的板到达。使用原理图作为参考，将 96 孔板的 A 行至 G 行中的 20 微升低柱稀释液和高柱稀释的 20 微升混合到 96 孔板的 B 至 H 孔中，以先前坐落的 384 孔板。然后在37摄氏度下孵育板，至少16小时。刺激后16至24小时，将转染细胞培养试剂化，并在每孔中加入20微升发光试剂，孵育5至20分钟，然后读取微板发光计数器上的板，每次孔的整合时间为1秒。在这个具有代表性的实验中，在初级筛查中被询问的168个GPCR中，只有多巴胺受体D3和opsin5是作为潜在活动目标的竞争者。多巴胺受体D3产生4.7的日志2折叠变化，而opsin5产生2.39的轻微低反应。相比之下，多巴胺受体D2，对主屏的正对照产生了4.58的对数2折变化。来自二次筛选的这些反应曲线表明，染色质颗粒提取物产生的信号窗口在一半最大有效浓度值中达到五皮醇，以确认其作为多巴胺受体D3的主动打击的有效性。一个类似于阴性对照的平面剂量曲线被生产给opsin5，但是排除了这种受体作为染色质颗粒提取物的可能靶点。前探戈需要特别小心，因为细胞分布、转染效率和连续药物稀释的变异性可能导致复合误差，从而影响数据的准确性。正交方法，如放射性结合方法，生物发光共振能量转移和循环AMP钙和内化功能测定可用于进一步确认和描述配体受体相互作用。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

使用新型不溶性生色底物检测试剂盒碳水化合物降解酶的高通量筛选

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

科研

生物化学

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

一种简单的高通量化学筛选方法在秀丽线虫中的应用

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

化学感受器配体结合域的高效复用与纯化方法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

滴定 ELISA 法测定受体配体相互作用的离解常数

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

利用病毒衍生系统在大肠杆菌中大规模生产圆形脚手架上的重组 rna

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

用于筛选小分子抑制剂的NADH耦合ATPase分析的半高通量自适应

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

使用基于细胞的雌激素受体对植物雌激素进行筛查β记者分析

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...