Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).

1. Primær screening: cellekultur og pladesåning
<ol><li>Til fremstilling af pll-plader (poly-L-lysin) skal der dispenseres 20 μL/brønd af en 25 μg/ml stamopløsning af PLL i hvide eller sorte 384-brønds optiske bundplader ved hjælp af en elektronisk multikanalpipette eller en reagensdispenser. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 0,5-2 timer. BEMÆRK: Hvis du bruger de sorte 384-brøndsplader, skal baggrundssignalet være lavere sammenlignet med de hvide plader. Sorte plader anbefales for at reducere udbl?...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

De konformationsdynamiske GPCR'er er kraftcentre for signaltransduktion. De fysiokemiske egenskaber af de bindende lommer af disse heptahelical receptorer, samt deres fysiologiske relevans understreger behovet for GPCR ligand screening værktøjer. Som præsenteret ovenfor, presto-Tango assay er hurtig, følsom og brugervenlig, udlån sig til udvikling af narkotika. Ikke alene denne analyse foranstaltning agonist-induceret aktivering, men det kan også bruges til at kvantificere aktiviteten af antagonister og allosteric ...

G-protein-koblede receptorer (GPCR' er) udgør den største og mest forskelligartede familie af transmembranproteiner, der fungerer som kommunikationsgrænseflader mellem en celle og dens miljø1. Alsidigheden af GPCRs er fremhævet af deres evne til at opdage en bred vifte af ligander-fra neurotransmittere til nukleotider, peptider til fotoner, og mange flere-samt deres evne til at regulere mange downstream signalering kaskader involveret i cellulære vækst, migration, differentiering, apoptose, cellefyring, etc.2,3. I betragtning af deres allestedsnærværende og engagement i et væld af fysiologiske processer, denne receptor familie er af allerstørste terapeutiske betydning, fremvist af det faktum, at mere end en tredjedel af de aktuelt tilgængelige ordineret medicin mål GPCRs4. Disse eksisterende behandlingsformer er imidlertid kun rettet mod en lille delmængde af superfamilien (anslået 10 %), og farmakologien for mange GPCR'er er fortsat ubelyst. Desuden findes der mere end 100 GPCR'er som forældreløse receptorer, da de ikke er blevet matchet med en endogen ligand5. Således GPCR ligand screening er kritisk i deorphanization og udvikling af lægemidler, da det baner vejen mod bly opdagelse og optimering, og muligvis til det kliniske forsøg fase.
Metoderne til GPCR-ligandscreening er traditionelt faldet i en af to kategorier, G-proteinafhængige eller G-proteinuafhængige funktionelle analyser6. GPCR-signalering reguleres af heterotrimriske G-proteiner (Gαβγ), som aktiveres ved udveksling af GTP for BNP, der er bundet på Gα-underenheden7. Signaler fra den aktiverede receptor transinduceres af G-proteiner via sekundære budbringere, såsom cAMP, Calcium, DAG og IP3, for at mægle nedstrømssignalering ved downstream-effektorer8. Arten af de funktionelle konsekvenser af G-protein signalering er blevet udnyttet til at skabe celle-baserede analyser, der afspejler receptor aktivering. Disse metoder, der måler proksimale (direkte) eller distale (indirekte) hændelser ved G-proteinsignalering, anvendes oftest til GPCR ligandscreening og har hovedsagelig været anvendt i deorphanization-studier6. Eksempler på analyser, der direkte måler GPCR-medieret G-protein aktivering omfatter [35S]GTPγS bindende analyse, som måler bindingen af en radiomærket og ikke-hydrolyseret GTP-analog med Gα-underenheden, og Förster/bioluminescensresonansenergioverførsel (FRET/BRET) til overvågning af GPCR-Gα- og Gα/Gγ-interaktioner, som har vundet mere trækkraft i årene9,10. Analyser, der overvåger distale hændelser er de mest almindeligt anvendte værktøjer til GPCR profilering; f.eks. måler cAMP- og IP1/3-analyser intracellulær akkumulering af G-proteinafhængige sekundære budbringere, mens[Ca. 2+] flux- og reporteranalyser, der involverer specifikke responselementer, der er impliceret i G-proteinaktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), undersøger hændelser længere nede i signalkaskade11. Mens de fleste af ovennævnte analyser kan udføres ved et højt gennemløbsniveau, er temmelig følsomme, og prale af visse analyse-specifikke fordele (f.eks forskelsbehandling mellem fuld / delvis agonists, neutrale antagonister og inverse agonister i tilfælde af GTPγS bindende, eller assay funktionalitet på levende celler som [Ca2 +] og IP1 / 3)6, er der desværre ingen eksisterende G-protein afhængige metoder sømmer sig forhør af hele druggable GPCR-ome. Dette skyldes i høj grad den oprindelige kobling af flere G-protein underfamilier til GPCRs, hvilket resulterer i signalering på flere kaskader og den ukendte G-protein kobling på forældreløse GPCRs. For at afbøde dette problem, assays er blevet udviklet til at tvinge promiskuøs G-protein kobling gennem en enkelt fælles signalering read-out, såsom cAMP, og Ca2 +, selv om de fleste af dem er lav-throughput12.
Et vigtigt aspekt af GPCR livscyklus er ophør af G-protein-afhængige signalering, som forekommer i vid udstrækning gennem rekruttering af β-arrestins, som inducerer dissociation af G-protein, og i sidste ende desensibiliserende receptoren, som er målrettet mod clathrin-belagt internalisering13. De mest allestedsnærværende udtrykt isoformer af β-arrestin er de ikke-visuelle β-arrestin1 og β-arrestin2, også betegnet som arrestin-2 og arrestin-3, henholdsvis14. Indtast G-protein uafhængige celle-baserede analyser, som tilføjer en ny dimension til GPCR ligand screening; receptorhandel, etiketfri hele celle og β-arrestin rekrutteringsanalyser er alle bemærkelsesværdige eksempler. GPCR-menneskesmuglingsanalyser anvender fluorophore-mærkede ligander eller saminternaliserede antistoffer rettet mod receptoren15, mens etiketfrie hele celleanalyser anvender biosensorer, der oversætter cellulære ændringer forårsaget af ligandbinding til kvantificerbare output, såsom elektriske eller optiske signaler16. Især kvintessens GPCR- β-arrestin interaktioner mode β-arrestin rekruttering assay som et attraktivt redskab i repertoiret af funktionelle analyser17. Tango systemet, først udviklet af Barnea et al. kun et årti siden, indebærer indførelse af tre eksogene genetiske elementer: en proteinfusion bestående af β-arrestin2 med et tobaksetchvirusprotease (TEVp), en tetracyklintransaktivator (tTA), der er bundet til en GPCR via et tobakset protease kavalergangssted (TEVcs) og indledes med en sekvens fra C-endeinen af V2-vasopressinreceptoren (V2-hale) for at fremme arrestationi rekruttering, og et reporter luciferase-gen, hvis transskription udløses af tTA transskriptionsfaktortranslokation til kernen, som frigøres fra membranforankringen efter β-arrestin2 rekruttering (figur 1)18. Kvantitative aflæsninger af GPCR aktivering og β-arrestin2 rekruttering kan efterfølgende bestemmes ved læsning for luminescens. En bemærkelsesværdig forskel er, at mens receptor handel og label-fri hele celle metoder er relativt lav-throughput, Tango har flere fordele, herunder selektiv udlæsning, der er specifik for målet receptor og følsomhed på grund af signal integration, hvilket gør det til en egnet kandidat til ligand screening på en større skala18.
I lyset af disse strategiske træk, Kroeze et al. udviklet PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression og Screening via Transskriptionelle Output-Tango), en høj-throughput open source-platform, der bruger Tango tilgang til at profilere den druggable GPCR-ome på en parallel og samtidig måde19. Ved at udnytte den "promiskuøse" rekruttering af β-arrestin2 til næsten alle GPCR'er er PRESTO-Tango den første af sin art med hensyn til cellebaserede funktionelle analyser, der muliggør hurtig "første runde" screening af små molekyleforbindelser ved næsten alle ikke-olfaktoriske GPCR'er, herunder forældreløse, uafhængige af G-protein-underfamiliekoblingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Som den største og mest alsidige gen superfamilie og mæglere af en skala af cellulære signalering veje, G-protein-koblede receptorer (GPCRs) repræsenterer en af de mest lovende mål for den farmaceutiske industri. Ergo, design, implementering og optimering af GPCR ligand screening assays er afgørende, da de repræsenterer fjernbetjening værktøjer til opdagelse af lægemidler og for at manipulere GPCR farmakologi og resultater. Tidligere karakteriserede G-proteinafhængige analyser dette forskningsområde, detekterede ligandinducerede hændelser og kvantificerede genereringen af sekundære budbringere. Men siden fremkomsten af funktionel selektivitet, samt en øget bevidsthed om flere andre G protein-uafhængige veje og de begrænsninger, der er forbundet med G-protein afhængige analyser, der er et større skub i retning af oprettelsen af alternative GPCR ligand screening assays. Mod denne bestræbelse, beskriver vi anvendelsen af en sådan ressource, PRESTO-Tango platform, en luciferase reporter-baseret system, der muliggør parallel og samtidig forhør af den menneskelige GPCR-ome, en bedrift, som tidligere blev overvejet teknisk og økonomisk umuligt. Baseret på en G-protein uafhængig β-arrestin2 rekruttering assay, universalitet β-arrestin2-medieret menneskehandel og signalering på GPCRs gør PRESTO-TANGO en apt værktøj til at studere ca 300 ikke-olfaktoriske menneskelige GPCRs, herunder ca 100 forældreløse receptorer. PRESTO-Tango's følsomhed og robusthed gør det velegnet til primære høj-throughput skærme ved hjælp af sammensatte biblioteker, ansat til at afdække nye GPCR mål for kendte lægemidler eller til at opdage nye ligander til forældreløse receptorer.

Ved hjælp af PRESTO-Tango protokollen præsenteret heri, en kronofin granulat (CG) ekstrakt blev screenet mod 168 ikke-olfaktoriske GPCR mål, med de fleste er forældreløse receptorer. Profilering af nævnte ekstrakt blev udført ved at undersøge β-arrestin2 mobilisering på de valgte receptorer, baseret på princippet designet af Barnea et al.18 (Figur 1). Plasmid cDNA af GPCRs af interesse blev taget fra PRESTO-Tango GPCR Kit og samlet i to 96 godt plader i det...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Da GPCR'er er attraktive mål for lægemidler, er GPCR ligandscreening således nødvendig for identifikation af blyforbindelser og for undersøgelser af forældreløs eller sjældne børn. Mod disse bestræbelser, beskriver vi PRESTO-Tango, en open source ressource platform, der anvendes til samtidig profilering af forbigående β-arrestin2 rekruttering på ca 300 GPCRs ved hjælp af en TEV-baseret reporter assay.

Parallel forhør af β-Arrestin2 Rekruttering til Ligand Screening på en GPCR-wide Scale ved hjælp af PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Presto-Tango-platformen blev udtænkt til at udføre den parallelle og samtidige forhør af alle ikke-olfaktoriske GPCR'er i det menneskelige genom, herunder at forældreløse mål til profil ligand-induceret beta-arrestin 2 rekruttering. Presto-Tango-platformen er den eneste open source-ressource til profilering af hele GPCR-genomet i en parallel tilgang ved hjælp af en G-protein uafhængig beta-arrestin rekrutteringsanalyse. Demonstrere processoren ville være Genevieve Laroche en Research Associate i mit laboratorium, og Manel Zighal, en ph.d.-kandidat i mit laboratorium.Før proceduren påbegyndes, tilsættes 20 mikroliter af en 25 mikrogram pr. milliliter poly-L-lysinopløsning til hver brønd af det relevante forsøgsnummer på 384 optiske bundplader, og pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter til to timer. I slutningen af inkubationen, svirp pladerne over vasken for at fjerne den overskydende poly-L-lysin og tilsæt 40 mikroliter af antibiotisk antimykotisk opløsning til hver brønd. Derefter inkubere pladerne er nødvendige for celle såning ved 37 grader Celsius og placere resten af pladerne på fire grader Celsius for langtidsopbevaring.For at frø HTLA celler til primær screening skylles forsigtigt sammenløbet 150 millimeter cellekulturer med 10 milliliter PBS, før kulturer behandles med seks milliliter 0,05% trypsin EDTA pr. skål. Når cellerne har afmonteret puljen, skal cellesuspensionerne i et konisk rør på 50 milliliter, der indeholder et tilsvarende volumen dmem. Og indsamle cellerne ved centrifugering.Re-suspendere pellet på en 2,2 gange 10 til den femte celler pr milliliter DMEM koncentration og svirp pladerne over vasken for at fjerne antibiotika antimykotisk opløsning. Bank pladerne til tørre og frø 45 mikroliter af celler i hver brønd. Derefter placere pladerne på 37 grader Celsius og 45% kuldioxid natten over.For at forberede 384 godt DNA kilde plade til transfektion distribuere 50 nanogram per milliliter af hver plasmid gratis DNA kodning GPRC Tango konstruere af interesse i 0,1 X Tris-EDTA per godt ind i hver brønd af en 96 brønd plade. Brug en multi-kanalpipette til manuelt at overføre 10 mikroliter AF DNA-opløsning fra hver brønd af 96 brøndpladen til individuelle brønde på en 384 brønd-DNA-kildeplade i firdoblet for hver tilstand som illustreret. Dernæst overføre 40 mikroliter af en 0,313 molar calciumchlorid opløsning til hver brønd af DNA kildepladen og forsigtigt blande indholdet af hver brønd.Tilføj 50 mikroliter af 2x HEPES buffer til hver brønd af 384 brøndEN DNA kilde plade med blid blanding. Efter et minut overføres 10 mikroliter af DNA-transinfektionsblandingen fra 384 brønd-DNA-kildepladen til hver brønd af seedede HTLA-celler og inkubere cellerne i cellekulturkubvøsen natten over. Den næste dag dekantere trans-inficerede celle medium og langsomt tilføje 40 mikroliter af sultende medium til hver godt at passe på ikke at røre cellerne direkte.Derefter tilsættes 20 mikroliter af køretøjets buffer til de skiftende rækker uden forbindelse i 20 mikroliter af interessestoffet ved en tre gange koncentration i de skiftende rækker, før pladen returneres til cellekulturkubvøsen. 16 til 24 timer efter stimulering dekantere transficerede celle medium og tilsæt 20 mikroliter frisklavet glød reagens til hver brønd for en fem til 20 minutters inkubation ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Læs derefter pladerne på en mikroplade luminescenstæller med en integrationstid på et sekund pr. brønd.For en sekundær screening subkultur, subkultur HTLA celler i 100 millimeter retter på en fem gange 10 til de seks celler samlede celletæthed i 11 millimeter komplet medium pr skål i 24 timer ved 37 grader Celsius. Den næste dag blandede 10 mikrogram GPCR gratis DNA med 500 mikroliter tris-EDTA calciumchloridopløsning med vortexing efterfulgt af tilsætning af 500 mikroliter HEPES-buffer. Efter kraftig omrystning inkuberes opløsningen i et minut ved stuetemperatur, og der tilsættes straks en milliliter af opløsningen, der falder klogt på cellerne.Sten forsigtigt for at fordele bundfaldet jævnt og placere pladen ved 37 grader Celsius i 24 timer. Den næste dag, kontrollere transfektion effektivitet under en fluorescerende celle imager. Transaktioner, der er større end 50 %,er ideelle.Skyl forsigtigt de transficerede celler med versenopløsning, før cellerne tages af med tre milliliter 0,05% trypsin EDTA. De dissocierede celler opsamls ved centrifugering, og pelletsen skal genså ved fire gange 10 til de femte celler pr. milliliter sultende mediumkoncentration. Derefter frø 45 mikroliter af celler i hver brønd af en poly-L-lysin kodet 384 godt plade og placere pladen i cellen kultur inkubator i mindst fire timer.For at forberede en halv log dosis-kurve respons plade tilføje 270 mikroliter AF HBSS suppleret med HEPES og antibiotisk antimykotisk til alle, men den sidste række af en 96 brøndplade og tilsæt 30 mikroliter af hver høj og lav lægemiddelopløsning til brøndene i række H.Overfør opløsningen fra hver brønd af række H i den tilsvarende brønd i række G med blanding og fortsætte med at serielt fortynde lægemiddelforbindelserne indtil den sidste række af pladen er nået. Ved hjælp af skematisk som reference blandes 20 mikroliter af de lave kolonnefortyndinger fra række A til G i 96 brøndpladen og 20 mikroliter af de høje søjlefortyndinger til brønde B til H af 96 brøndpladen til den tidligere siddende 384 brøndplade. Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius i mindst 16 timer.16 til 24 timer efter stimulering dekantere den transficerede celle medium og tilsæt 20 mikroliter af glød reagens til hver brønd for en fem til 20 minutters inkubation, før du læser pladerne på en mikroplade luminescens counter med en integration tid på et sekund per brønd. I dette repræsentative eksperiment, ud af de 168 GPCRs, der blev afhørt i den primære screening, kun dopamin receptor D3 og opsin 5 var kandidater som potentielle aktive mål. Dopamin receptor D3 produceret en betydelig log2 fold ændring af 4.7 mens opsin 5 produceret en lidt lavere respons på 2.39.Til sammenligning, dopamin receptor D2, den positive kontrol for den primære skærm produceret en log2 fold ændring af 4.58. Disse responskurver fra den sekundære screening viste, at kromatingranulat ekstrakt producere lignende signal vinduer i halv maksimal effektiv koncentration værdier til quinpirole bekræfter dens gyldighed som et aktivt hit på dopamin receptor D3. En flad dosiskurve svarende til den negative kontrol blev fremstillet for opsin 5, men udelukkede denne receptor som et muligt mål for chromatingranulatekstraktet. Presto-Tango kræver særlig omhu som varia evner i celledistribution, transfektion effektivitet og serielle lægemiddelfortyndinger kan resultere i forværret fejl, som kan påvirke nøjagtigheden af dataene.Ortogonale metoder såsom Radioligand-bindende tilgange, Bioluminescens Resonance Energy Transfer og cyklisk AMP calcium og internalisering funktionelle analyser kan bruges til yderligere at bekræfte og karakterisere ligand receptor interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metode til at bestemme dissociationskonstant Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...