Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).

1. Primaire screening: celcultuur en plaatzaaien
<ol><li>Voor de bereiding van poly-L-lysine (PLL)-gecoate platen, moet 20 μL/put van een 25 μg/mL-oplossing van PLL in witte of zwarte 384-well optische bodemplaten worden voorzien met behulp van een elektronische meerkanaals pipet of een reagensdispenser. Incubeer de platen bij kamertemperatuur voor 0,5-2 uur. LET OP: Als u de zwarte 384-putplaten gebruikt, verwacht dan dat het achtergrondsignaal lager is in vergelijking met de witte platen. Zwarte platen worden aa...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

De conformatiedynamische GPCRs zijn krachtpatsers van signaaltransductie. De fysiochemische eigenschappen van de bindende zakken van deze heptahelical receptoren, evenals hun fysiologische relevantie onderstrepen de noodzaak van GPCR ligand screening tools. Zoals hierboven gepresenteerd, de PRESTO-Tango test is snel, gevoelig en gebruiksvriendelijk, lenen zich aan de ontwikkeling van geneesmiddelen. Niet alleen meet deze test agonist-geïnduceerde activering, maar het kan ook worden gebruikt om de activiteit van antagoni...

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) vormen de grootste en meest diverse familie van transmembraan eiwitten, die werken als communicatie-interfaces tussen een cel en zijn omgeving1. De veelzijdigheid van GPCRs wordt benadrukt door hun vermogen om een divers scala van ligands-detecteren-van neurotransmitters tot nucleotiden, peptiden tot fotonen, en nog veel meer-evenals hun vermogen om tal van downstream signalering cascades die betrokken zijn bij cellulaire groei, migratie, differentiatie, apoptose, cel vuren, etc.2,3te reguleren. Gezien hun alomtegenwoordigheid en betrokkenheid bij een veelheid van fysiologische processen, deze receptor familie is van het grootste therapeutische belang, tentoongesteld door het feit dat meer dan een derde van de momenteel beschikbare voorgeschreven medicijnen richten GPCRs4. Echter, deze bestaande therapieën alleen gericht op een kleine subset van de superfamilie (naar schatting 10%), en de farmacologie van veel GPCRs blijft onopgehelderd. Bovendien bestaan er meer dan 100 GPCRs als weesreceptoren, omdat ze niet zijn gekoppeld aan een endogene ligand5. Zo is GPCR ligand screening van cruciaal belang in deorphanisatie en de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het de weg naar loodontdekking en -optimalisatie, en mogelijk naar de klinische onderzoeksfase, effent.
Methoden voor GPCR ligand screening zijn traditioneel gedaald in een van de twee categorieën, G-eiwit afhankelijk of G-eiwit onafhankelijke functionele testen6. GPCR-signalering wordt geregeld door heterotrimeric G-eiwitten (Gαβγ), die worden geactiveerd door de uitwisseling van GTP voor het BBP gebonden op de Gα-subeenheid7. Signalen van de geactiveerde receptor worden door G-eiwitten via secundaire boodschappers, zoals cAMP, Calcium, DAG en IP3, omgezet om downstream signalering te bemiddelen bij downstream-effectoren8. De aard van de functionele gevolgen van G-eiwitsignalering is benut om celgebaseerde testen te creëren die receptoractivering weerspiegelen. Deze methoden, die proximale (directe) of distale (indirecte) gebeurtenissen in G-eiwitsignalering meten, worden het vaakst gebruikt voor GPCR ligandscreening en zijn voornamelijk werkzaam in deorphanisatiestudies6. Voorbeelden van tests die rechtstreeks gpcr-gemedieerde G-eiwit activering meten zijn de [35S]GTPγS bindende test, die de binding van een radiolabeled en niet-hydrolyzable GTP analoog aan de Gα subunit, en Förster / bioluminescentie resonantie energieoverdracht (FRET / BRET, respectievelijk) sondes meet om GPCR-Gα en Gα/Gγ interacties te monitoren, die in de loop der jaren9,10meer tractie hebben gekregen . Tests dat monitordistale gebeurtenissen de meest gebruikte tools zijn voor GPCR-profilering; cAMP en IP1/3-testen meten bijvoorbeeld intracellulaire accumulatie van G-eiwit afhankelijke secundaire boodschappers, terwijl [Ca2+] flux- en reportertests met specifieke responselementen die betrokken zijn bij de activering van G-eiwit (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) gebeurtenissen verder onderzoeken stroomafwaarts de signaleringscascade11. Hoewel de meeste bovengenoemde tests op een hoog doorvoerniveau kunnen worden uitgevoerd, zijn vrij gevoelig, en beschikken over bepaalde testspecifieke voordelen (bijvoorbeeld discriminatie tussen full/partagonisten, neutrale antagonisten en omgekeerde agonisten in het geval van GTPγS binding, of testfunctionaliteit op levende cellen zoals [Ca2+] en IP1/3)6,er zijn helaas geen bestaande G-eiwit afhankelijke methoden die passen bij de ondervraging van de gehele druggable GPCR-ome. Dit is grotendeels te wijten aan de inheemse koppeling van meerdere G-eiwit subfamilies aan GPCRs, wat resulteert in signalering bij verschillende cascades en de onbekende G-eiwit koppeling bij wees-GPCRs. Om dit probleem te verzachten, zijn tests ontwikkeld om promiscue G-eiwitkoppeling te dwingen door middel van een gemeenschappelijke signaleringsuitlezing, zoals cAMP, en Ca2+, zij het dat de meeste van hen een lage doorvoer hebben12.
Een belangrijk aspect van de GPCR-levenscyclus is de beëindiging van G-eiwitafhankelijke signalering, die voor een groot deel plaatsvindt door de aanwerving van β-arrestinen die dissociatie van het G-eiwit induceert, en uiteindelijk de receptor desensibiliseren, die is gericht op clathrin-coated internalisatie13. De meest alomtegenwoordig uitgedrukte isovormen van β-arrestinzijn de niet-visuele β-arrestin1 en β-arrestin2, ook aangeduid als arrestin-2 en arrestin-3, respectievelijk14. Voer G-eiwit onafhankelijke cel-gebaseerde tests, die een nieuwe dimensie toe te voegen aan GPCR ligand screening; receptor handel, label-vrije hele cel, en β-arrestin werving testen zijn allemaal opmerkelijke voorbeelden. GPCR-smokkeltests maken gebruik van fluorophore-gelabelde liganden of co-geïnternaliseerde antilichamen gericht op de receptor15, terwijl labelvrije hele celtesten biosensoren gebruiken die cellulaire veranderingen vertalen die door ligandbinding worden veroorzaakt in kwantificeerbare uitgangen, zoals elektrische of optische signalen16. Met name, typische GPCR-β-arrestin interacties mode de β-arrestin recruitment test als een aantrekkelijk instrument in het repertoire van functionele testen17. Het Tango-systeem, voor het eerst ontwikkeld door Barnea et al. slechts tien jaar geleden, omvat de introductie van drie exogene genetische elementen: een eiwitfusie bestaande uit β-arrestin2 met een tabak etch virus protease (TEVp), een tetracycline transactivator (tTA) die via een tabak aan een GPCR is gebonden etsvirus protease decolleté site (TEVcs) en wordt voorafgegaan door een sequentie uit de C-terminus van de V2 vasopressine receptor (V2 staart) om arrestaties bij werving te bevorderen, en een reporter luciferase gen waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door de tTA transcriptiefactor translocatie naar de kern, die na β-arrestin2 aanwerving(figuur 1) 18 wordt bevrijd van de membraanverankering ( figuur 1 )18. Kwantitatieve metingen van GPCR-activering en β-arrestin2-rekrutering kunnen vervolgens worden bepaald door te lezen voor luminescentie. Een opmerkelijk onderscheid is dat, terwijl receptorhandel en labelvrije hele celmethoden relatief lage doorvoer zijn, de Tango verschillende voordelen heeft, waaronder selectieve uitlezing die specifiek is voor de doelreceptor en gevoeligheid als gevolg van signaalintegratie, waardoor het een geschikte kandidaat is voor ligandscreening op grotere schaal18.
Met het oog op deze strategische kenmerken ontwikkelden Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), een high-throughput open-source platform dat de Tango-aanpak gebruikt om de druggable GPCR-ome parallel en gelijktijdig te profileren19. PreSTO-Tango maakt gebruik van de "promiscue" rekrutering van β-arrestin2 voor bijna alle GPCRs, en is de eerste-van-zijn-soort in termen van op cellen gebaseerde functionele testen, waardoor snelle "eerste ronde" screening van kleine molecuulverbindingen bij bijna alle niet-reukgvr's, inclusief wezen, onafhankelijk van de G-eiwit subfamiliekoppeling mogelijk is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Als de grootste en meest veelzijdige gensuperfamilie en bemiddelaars van een gamma van cellulaire signaleringstrajecten vormen G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) een van de meest veelbelovende doelstellingen voor de farmaceutische industrie. Ergo, het ontwerp, de uitvoering, en optimalisatie van GPCR ligand screening tests is van cruciaal belang, omdat ze afstandsbediening tools voor de ontdekking van geneesmiddelen en voor het manipuleren van GPCR farmacologie en resultaten vertegenwoordigen. In het verleden typeerde G-eiwitafhankelijke testen dit onderzoeksgebied, detecteerde ligand-geïnduceerde gebeurtenissen en kwantificeerde de generatie secundaire boodschappers. Echter, sinds de komst van functionele selectiviteit, evenals een toegenomen bewustzijn van een aantal andere G-eiwit-onafhankelijke trajecten en de beperkingen in verband met G-eiwit afhankelijke testen, is er een grotere druk op het creëren van alternatieve GPCR ligand screening testen. In de richting van deze inspanning beschrijven we de toepassing van een dergelijke bron, de PRESTO-Tango platform, een luciferase reporter-based systeem dat de parallelle en gelijktijdige ondervraging van de menselijke GPCR-ome mogelijk maakt, een prestatie die eerder werd beschouwd technisch en economisch onhaalbaar. Op basis van een G-eiwit onafhankelijke β-arrestin2 recruitment test, de universaliteit van β-arrestin2-gemedieerde handel en signalering bij GPCRs maakt PRESTO-TANGO een geschikt instrument voor het bestuderen van ongeveer 300 niet-olfactorische menselijke GPCRs, waaronder ongeveer 100 weesreceptoren. PreSTO-Tango's gevoeligheid en robuustheid maken het geschikt voor primaire high-throughput schermen met behulp van samengestelde bibliotheken, gebruikt om nieuwe GPCR-doelen voor bekende geneesmiddelen te ontdekken of om nieuwe liganden voor weesreceptoren te ontdekken.

Met behulp van de PRESTO-Tango protocol hierin gepresenteerd, een chromafinegranulaat (CG) extract werd gescreend tegen 168 niet-reukGPCR doelen, met de meerderheid wezen weesreceptoren. Profilering van dit extract werd uitgevoerd door het onderzoeken van β-arrestin2 mobilisatie op de gekozen receptoren, gebaseerd op het principe ontworpen door Barnea et al.18 (Figuur 1). Plasmid cDNA van de GPCRs van belang werd genomen uit de PRESTO-Tango GPCR Kit en gemonteerd in ...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Het Presto-Tango platform is ontworpen om de parallelle en gelijktijdige ondervraging van alle niet-reuk-GPCRs in het menselijk genoom uit te voeren, inclusief dat weesdoelen om ligand-geïnduceerde bèta-arresten te profileren in 2 rekrutering. Het Presto-Tango platform is de enige open source bron voor het profileren van het gehele GPCR genoom in een parallelle aanpak, met behulp van een G-eiwit onafhankelijke bèta-arrestin recruitment test. Het aantonen van de processor zou Genevieve Laroche een Research Associate in mijn lab zijn, en Manel Zighal, een promovendus in mijn lab.Voeg voor aanvang van de procedure 20 microliter van een 25 microgram per milliliter poly-L-lysineoplossing toe aan elke put van het juiste experimentele getal van 384 optische bodemplaten en broed de platen gedurende 30 minuten tot twee uur bij kamertemperatuur uit. Aan het einde van de incubatie, flick de platen over de gootsteen om de overtollige poly-L-lysine te verwijderen en voeg 40 microliters van antibiotica antimycotische oplossing aan elke put. Dan incubeer de platen die nodig zijn voor cel zaaien op 37 graden Celsius en plaats de rest van de platen op vier graden Celsius voor langdurige opslag.Om HTLA-cellen te zaaien voor primaire screening, spoel dan voorzichtig 150 millimeter celculturen met 10 milliliter PBS voordat ze de culturen behandelen met zes milliliters van 0,05% trypsine EDTA per gerecht. Wanneer de cellen zijn losgemaakt pool de cel suspensies in een 50 milliliter conische buis met een gelijk volume van DMEM. En verzamel de cellen door centrifugatie.Stel de pellet opnieuw op met een 2,2 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter DMEM-concentratie en veeg de platen over de gootsteen om de antimycotische oplossing van antibiotica te verwijderen. Tik op de platen te drogen en zaad 45 microliter cellen in elke put. Plaats dan de platen op 37 graden Celsius en 45% kooldioxide 's nachts.Ter voorbereiding van de 384 goed DNA-bronplaat voor transfectie distribueren 50 nanogram per milliliter van elke plasmide gratis DNA codering van de GPRC Tango constructie van belang in 0.1X Tris-EDTA per goed in elke put van een 96 put plaat. Gebruik een multi-channel pipet om handmatig overdracht 10 microliter van DNA-oplossing van elke put van de 96 put plaat naar individuele putten van een 384 goed DNA-bronplaat in viervoudige voor elke aandoening zoals geïllustreerd. Breng vervolgens 40 microliter van een 0,313 molaire calciumchlorideoplossing over naar elke put van de DNA-bronplaat en meng voorzichtig de inhoud van elke put.Voeg 50 microliter van 2x HEPES buffer toe aan elke put van de 384 goed DNA bronplaat met zachte menging. Na één minuut overdracht 10 microliters van het mengsel van de transfectie van DNA van de 384 goed de bronplaat van DNA aan elke put van gezaaide cellen HTLA en incubbateren de cellen in de incubator van de celkweek 's nachts. De volgende dag decanteren de transfected cell medium en langzaam toe te voegen 40 microliters van hongeren medium om elke goed zorg niet direct aan te raken de cellen.Voeg vervolgens 20 microliter van de voertuigbuffer toe voor de afwisselende rijen zonder verbinding in 20 microliter van de verbinding van belang bij een driemaal concentratie in de afwisselende rijen, voordat de plaat terugkeert naar de celkweek incubator. 16 tot 24 uur na de stimulatie decanteert het transfected cellmedium en voeg 20 microliter vers bereide gloeireagens toe aan elke put voor een vijf tot 20 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Lees vervolgens de platen op een micro-plaat luminescentie teller met een integratietijd van een seconde per put.Voor een secundaire screening, subcultuur de HTLA cellen in 100 millimeter schotels op een vijf keer 10 tot de zes cellen totale celdichtheid in 11 millimeter van het volledige medium per schotel voor 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag, gemengd 10 microgram GPCR gratis DNA met 500 microliters van Tris-EDTA calciumchloride oplossing met vortexing, gevolgd door de toevoeging van 500 microliters van HEPES buffer. Na krachtig schudden, incubeer de oplossing voor een minuut bij kamertemperatuur en onmiddellijk voeg een milliliter van de oplossing laten vallen verstandig op de cellen.Zachtjes rocken om het neerslag gelijkmatig te verdelen en plaats de plaat op 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Controleer de volgende dag de transfectie-efficiëntie onder een fluorescerende celafbeelding. Transacties groter dan 50% dekking zijn ideaal.Spoel de doorsneden cellen voorzichtig af met verseneoplossing voordat u de cellen losmaakt met drie milliliters van 0,05% trypsin EDTA. Verzamel de gescheiden cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op met een vier keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter uitgehongerde gemiddelde concentratie. Dan zaad 45 microliter cellen in elke put van een poly-L-lysine gecodeerde 384 put plaat en plaats de plaat in de cel cultuur incubator voor ten minste vier uur.Voor het opstellen van een half log dosis-curve responsplaat voeg 270 microliters van HBSS aangevuld met HEPES en antibioticum antimycoticum voor alle, maar de laatste rij van een 96 put plaat en voeg 30 microliter van elke hoge en lage drug oplossing aan de putten van rij H.Transfer de oplossing van elke put van rij H in de overeenkomstige put van rij G met mengen en blijven serieel verdunnen van de drug verbindingen tot de laatste rij van de plaat is bereikt. Met behulp van de schematische als referentie, meng 20 microliter van de lage kolom verdunningen van rijen A tot en met G van de 96 put plaat en 20 microliter van de hoge kolom verdunningen tot putten B door H van de 96 put plaat aan de eerder zittende 384 put plaat. Dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius voor een minimum van 16 uur.16 tot 24 uur na de stimulatie decanteren de transfected cell medium en voeg 20 microliter van gloeireagemiddel aan elke put voor een vijf tot 20 minuten incubatie voor het lezen van de platen op een microplaat luminescentie teller met een integratietijd van een seconde per goed. In dit representatieve experiment, van de 168 GPCRs die werden ondervraagd in de primaire screening, alleen dopamine receptor D3 en opsin 5 waren kanshebbers als potentiële actieve doelen. Dopamine receptor D3 produceerde een significante log2 voudige verandering van 4,7 terwijl opsin 5 een iets lagere respons van 2.39 geproduceerd.Ter vergelijking, dopamine receptor D2, de positieve controle voor het primaire scherm produceerde een log2 vouw verandering van 4.58. Deze responscurven van de secundaire screening toonden aan dat chromatine granulaatextract vergelijkbare signaalvensters produceren in half maximaal effectieve concentratiewaarden tot quinpirole die de geldigheid ervan bevestigt als een actieve hit bij dopaminereceptor D3. Een vlakke dosis-curve vergelijkbaar met de negatieve controle werd geproduceerd voor opsin 5 echter uitsluiten van deze receptor als een mogelijk doelwit voor de chromatine granulaat extract. Presto-Tango vereist speciale zorg omdat variabiliteiten in celdistributie, transfectie-efficiëntie en seriële verdunningen kunnen leiden tot een samengestelde fout, die de nauwkeurigheid van de gegevens kan beïnvloeden.Orthogonale methoden zoals Radioligand-bindende benaderingen, Bioluminescent resonance resonance energy transfer en cyclische AMP calcium en internalisatie functionele testen kunnen worden gebruikt om ligand receptor interacties verder te bevestigen en te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...