Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
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Ces travaux ont été appuyés par les Instituts de recherche en santé du Canada (subvention des IRSC #MOP142219).

1. Dépistage primaire : culture cellulaire et ensemencement des plaques
<ol><li>Pour préparer des plaques recouvertes de poly-L-lysine (PLL), distribuez 20 L/puits d’une solution de stock de 25 g/mL de PLL dans des plaques de fond optique blanches ou noires de 384 puits à l’aide d’une pipette multicanal électronique ou d’un distributeur de réactifs. Incuber les plaques à température ambiante pendant 0,5 à 2 h. REMARQUE : Si vous utilisez les plaques noires de 384 puits, attendez-vous à ce que le sig...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. 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S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Les GPCR dynamiques sont des centrales de la transduction du signal. Les propriétés physiochimiques des poches liantes de ces récepteurs héptéliriques, ainsi que leur pertinence physiologique soulignent la nécessité d’outils de dépistage de ligand GPCR. Tel que présenté ci-dessus, l’essai PRESTO-Tango est rapide, sensible et convivial, se prêtant au développement de médicaments. Non seulement cet essai mesure-t-il l’activation induite par l’agoniste, mais il peut également être utilisé pour quanti...

Les récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) constituent la famille la plus importante et la plus diversifiée de protéines transmémbranées, fonctionnant comme interfaces de communication entre une cellule et son environnement1. La polyvalence des GPCRs est mise en évidence par leur capacité à détecter un large éventail de ligands, des neurotransmetteurs aux nucléotides, peptides aux photons, et beaucoup plus, ainsi que leur capacité à réguler de nombreuses cascades de signalisation en aval impliquées dans la croissance cellulaire, la migration, la différenciation, l’apoptose, la mise à feu cellulaire,etc. 2,3. Compte tenu de leur ubiquité et de leur implication dans une multitude de processus physiologiques, cette famille de récepteurs est de la plus haute importance thérapeutique, mise en évidence par le fait que plus d’un tiers des médicaments prescrits actuellement disponibles ciblent les GPCR4. Cependant, ces thérapies existantes ne ciblent qu’un petit sous-ensemble de la superfamille (environ 10%), et la pharmacologie de nombreux GPCRs reste non polluée. En outre, plus de 100 GPCRs existent comme récepteurs orphelins, car ils n’ont pas été jumelés avec une ligand endogène5. Ainsi, le dépistage de ligand GPCR est essentiel dans la déorphanasisation et le développement de médicaments, car il ouvre la voie à la découverte et à l’optimisation des plombs, et peut-être à la phase d’essai clinique.
Les méthodes de dépistage du ligand GPCR sont traditionnellement tombées dans l’une des deux catégories, les essais fonctionnels indépendants de G-protein ou de G-protein6. La signalisation GPCR est réglementée par des protéines G hétérotrimeriques (G), qui sont activées par l’échange de GTP contre le PIB lié sur le sous-unitéG 7. Les signaux du récepteur activé sont transduits par des protéines G via des messagers secondaires, tels que cAMP, Calcium, DAG et IP3, pour servir de médiateur en aval aux effecteurs en aval8. La nature des conséquences fonctionnelles de la signalisation de protéine G a été exploitée pour créer des essais cellulaires qui reflètent l’activation des récepteurs. Ces méthodes, qui mesurent les événements proximal (directs) ou distal (indirects) dans la signalisation des protéines G, sont le plus fréquemment utilisées pour le dépistage du ligand GPCR et ont été principalement utilisées dans des études de désorphanasisation6. Parmi les exemples d’essais qui mesurent directement l’activation de la protéine G négociée par le GPCR, mentionnons l’essai de liaison [35S]GTP-S, qui mesure la liaison d’un TPL GTP par radiolacs et non hydrolysable analogique au sous-unité de G, et les sondes de transfert d’énergie par résonance de la société de développement et de bioluminescence (FRET/BRET, respectivement) pour surveiller les interactions GPCR-G ET Gô/G, qui ont gagné plus de traction au cours des années9,10. Les essais qui surveillent les événements distal sont les outils les plus couramment utilisés pour le profilage du GPCR; par exemple, les essais de cAMP et d’IP1/3 mesurent l’accumulation intracellulaire des messagers secondaires dépendants de la protéine G, tandis que [Ca2 ]flux et essais de reporter impliquant des éléments de réponse spécifiques impliqués dans l’activation de la protéine G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinent les événements plus en aval de la cascade de signalisation11. Alors que la plupart des essais susmentionnés peuvent être effectués à un niveau de haut débit, sont assez sensibles, et se vantent de certains avantages spécifiques à l’analyse (par exemple, la discrimination entre les agonistes complets/partiels, les antagonistes neutres et les agonistes inverses dans le cas de la liaison GTP-S, ou la fonctionnalité d’analyse sur les cellules vivantes telles que [Ca2] et IP1/3)6, il n’y a malheureusement pas de méthodes existantes dépendantes de la protéine G qui s’agencent à l’interrogatoire de l’ensemble du GPCR-ome. Cela est en grande partie dû à l’accouplement indigène de plusieurs sous-familles de protéines G aux GPCRs, ce qui entraîne la signalisation à plusieurs cascades et le couplage inconnu de G-protéine au GPCRs orphelins. Pour atténuer ce problème, des essais ont été développés pour forcer le couplage promiscuité de la protéine G par le biais d’une seule lecture commune de signalisation, comme le cAMP, et le Ca2MD,bien que la plupart d’entre eux soient à faible débit12.
Un aspect important du cycle de vie du GPCR est l’arrêt de la signalisation dépendante de la protéine G, qui se produit en grande partie par le recrutement de 'arrestins qui induit la dissociation de la protéine G, et finalement désensibilisant le récepteur, qui est ciblé pour l’internalisation enduite de clathrine13. Les isoformes les plus omniprésents exprimés de l’arrêt sont les non-visuels 'arrestin1 et 'arrestin2, également désignés comme arrestin-2 et arrestin-3, respectivement14. Entrez les essais à base de cellules indépendantes de G-protein, qui ajoutent une nouvelle dimension au dépistage de ligand DE GPCR ; le trafic de récepteurs, la cellule entière sans étiquette et les essais de recrutement d’arrestation sont tous des exemples notables. Les essais de trafic GPCR emploient des ligands étiquetés fluorophore ou des anticorps co-intériorisés ciblant le récepteur15,tandis que les essais de cellules entières sans étiquette utilisent des biocapteurs qui traduisent les changements cellulaires induits par la liaison ligand en sorties quantifiables, telles que les signaux électriques ou optiques16. Notamment, la quintessence GPCR- -arrestin interactions façon de l’essai de recrutement '-arrestin comme un outil attrayant dans le répertoire des essais fonctionnels17. Le système Tango, développé pour la première fois par Barnea et coll. il y a seulement dix ans, implique l’introduction de trois éléments génétiques exogènes : une fusion protéique consistant en un 2e jour avec une protéase du virus de l’échage du tabac (TEVp), un transactivateur de tétracycline (TTA) qui est attaché à un GPCR par l’intermédiaire d’un virus de l’échage du tabac le site de clivage de protease (TEVcs) et est précédé d’une séquence du C-terminus du récepteur de vasopressine V2 (queue V2) pour favoriser le recrutement d’arrestin, et d’un gène de luciferase reporter dont la transcription est déclenchée par le translocation du facteur de transcription tTA au noyau, qui est libéré de l’ancrage de la membrane à la suite du recrutement de 'arrestin2 ' (figure 1)18. Les lectures quantitatives de l’activation du GPCR et du recrutement de l’arrêt2 peuvent ensuite être déterminées par la lecture pour la luminescence. Une distinction notable est que si le trafic de récepteurs et les méthodes cellulaires entières sans étiquette sont relativement faible débit, le Tango a plusieurs avantages, y compris la lecture sélective qui est spécifique au récepteur cible et la sensibilité due à l’intégration du signal, qui en font un candidat approprié pour le dépistage de ligand sur une plus grande échelle18.
Compte tenu de ces caractéristiques stratégiques, Kroeze et coll. ont développé PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), une plate-forme open-source à haut débit qui utilise l’approche Tango pour profiler le GPCR-ome médicamentable d’une manière parallèle et simultanée19. Exploitant le recrutement « promiscuité » de l’arrêt2 à presque tous les GPCR, PRESTO-Tango est le premier de son genre en termes d’essais fonctionnels à base de cellules, permettant un dépistage rapide « de premier tour » des composés de petites molécules dans presque tous les GPCRs non olfactifs, y compris les orphelins, indépendamment du couplage sous-familial de la G-protéine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

En tant que superfamille génique la plus grande et la plus polyvalente et les médiateurs d’une gamme de voies de signalisation cellulaires, les récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) représentent l’une des cibles les plus prometteuses pour l’industrie pharmaceutique. Ergo, la conception, la mise en œuvre et l’optimisation des essais de dépistage de ligand GPCR est cruciale, car ils représentent des outils de contrôle à distance pour la découverte de médicaments et pour manipuler la pharmacologie et les résultats du GPCR. Dans le passé, les essais dépendants de la protéine G caractérisaient ce domaine de recherche, détectant les événements induits par le ligand et quantifiant la génération de messagers secondaires. Cependant, depuis l’avènement de la sélectivité fonctionnelle, ainsi qu’une prise de conscience accrue de plusieurs autres voies indépendantes des protéines G et des limites associées aux essais dépendants de la protéine G, il y a une plus grande poussée vers la création d’alternatives Essais de dépistage de ligand GPCR. Vers cette entreprise, nous décrivons l’application d’une telle ressource, la plate-forme PRESTO-Tango, un système luciferase basé sur un journaliste qui permet l’interrogatoire parallèle et simultané du GPCR-ome humain, un exploit qui était auparavant considéré techniquement et économiquement irréalisable. Sur la base d’un essai de recrutement indépendant de G-protein ' 'arrestin2, l’universalité de la traite et de la signalisation à médiation de la protéine G2 fait de PRESTO-TANGO un outil approprié pour étudier environ 300 GPCR humains non olfactifs, dont environ 100 récepteurs orphelins. La sensibilité et la robustesse de PRESTO-Tango le rendent approprié pour les écrans primaires à haut débit utilisant des bibliothèques composées, employés pour découvrir de nouvelles cibles de GPCR pour les médicaments connus ou pour découvrir de nouveaux ligands pour les récepteurs orphelins.

À l’aide du protocole PRESTO-Tango présenté ici, un extrait de granule de chromaffin (CG) a été examiné contre 168 cibles GPCR non olfactives, la majorité étant des récepteurs orphelins. Le profilage de l’extrait dit a été effectué en examinant la mobilisation d’arrestation dans les récepteurs choisis, sur la base du principe conçu par Barnea et coll.18 (figure 1). Plasmid cDNA des GPCRs d’intérêt a été tiré de la trousse PRESTO-Tango GPCR e...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Étant donné que les RPGC sont des cibles médicamenteuses attrayantes, le dépistage du ligand GPCR est donc indispensable pour l’identification des composés de plomb et pour les études de désorphanisation. À l’égard de ces efforts, nous décrivons PRESTO-Tango, une plate-forme de ressources open-source utilisée pour le profilage simultané du recrutement transitoire d’un PGS2 à environ 300 GPCR à l’aide d’un essai de journaliste basé sur TEV.

Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

La plate-forme Presto-Tango a été conçue pour exécuter l’interrogatoire parallèle et simultané de tous les RPG non olfactifs dans le génome humain, y compris les cibles orphelines pour profiler le recrutement bêta-arrestin 2 induit par ligand. La plate-forme Presto-Tango est la seule ressource open source pour le profilage de l’ensemble du génome du GPCR dans une approche parallèle, en utilisant une protéine G indépendante bêta-arrestin analyse de recrutement. Geneviève Laroche, associée de recherche dans mon laboratoire, et Manel Zighal, doctorante dans mon laboratoire, feraient la démonstration du processeur.Avant de commencer la procédure ajouter 20 microlitres d’une solution poly-L-lysine de 25 microgrammes par millilitre à chaque puits du nombre expérimental approprié de 384 plaques de fond optiques et incuber les plaques à température ambiante pendant 30 minutes à deux heures. À la fin de l’incubation, feuilleter les plaques sur l’évier pour enlever l’excès de poly-L-lysine et ajouter 40 microlitres de solution antimycotique antibiotique à chaque puits. Ensuite, incuber les plaques nécessaires à l’ensemencement cellulaire à 37 degrés Celsius et placer le reste des plaques à quatre degrés Celsius pour le stockage à long terme.Pour semer les cellules HTLA pour le dépistage primaire, rincer délicatement les cultures cellulaires confluentes de 150 millimètres avec 10 millilitres de PBS avant de traiter les cultures avec six millilitres de 0,05% trypsine EDTA par plat. Lorsque les cellules se sont détachées de la piscine, les suspensions cellulaires dans un tube conique de 50 millilitres contenant un volume égal de DMEM. Et recueillir les cellules par centrifugation.Suspendre à nouveau la pastille à 2,2 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de DMEM et feuilleter les plaques sur l’évier pour enlever la solution antibiotique antimycotique. Appuyez sur les plaques pour sécher et ensemencer 45 microlitres de cellules dans chaque puits. Placez ensuite les plaques à 37 degrés Celsius et 45 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.Pour préparer la plaque source d’ADN de puits 384 pour la transfection distribuer 50 nanogrammes par millilitre de chaque adn plasmide gratuit codant la construction GPRC Tango d’intérêt dans 0,1X Tris-EDTA par puits dans chaque puits d’une plaque de puits 96. Utilisez une pipette multicanal pour transférer manuellement 10 microlitres de solution d’ADN de chaque puits de la plaque de puits 96 à des puits individuels d’une plaque source d’ADN de 384 puits en quadruplicate pour chaque condition, comme illustré. Ensuite, transférez 40 microlitres d’une solution molaire de chlorure de calcium de 0,313 molaire à chaque puits de la plaque source d’ADN et mélangez doucement le contenu de chaque puits.Ajouter 50 microlitres de tampon HEPES 2x à chaque puits de la plaque source d’ADN du puits 384 avec mélange doux. Après un transfert d’une minute, 10 microlitres du mélange de transfection de l’ADN de la plaque source d’ADN de 384 puits à chaque puits de cellules HTLA ensemencées et d’incubation des cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain décanter le milieu cellulaire transfecté et ajouter lentement 40 microlitres de milieu affamé à chaque puits en prenant soin de ne pas toucher les cellules directement.Ajouter ensuite 20 microlitres du tampon du véhicule pour les rangées alternées sans composé dans 20 microlitres du composé d’intérêt à une concentration de trois fois dans les rangées alternées, avant de retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. 16 à 24 heures après le décantation de la stimulation du milieu cellulaire transfecté et ajouter 20 microlitres de réapprovisionnement lumineux fraîchement préparé à chaque puits pendant une incubation de cinq à 20 minutes à température ambiante protégée de la lumière. Lisez ensuite les plaques sur un compteur de luminescence à micro-plaques avec un temps d’intégration d’une seconde par puits.Pour un dépistage secondaire, sous-culture des cellules HTLA dans des plats de 100 millimètres à cinq fois 10 à la densité cellulaire totale des six cellules en 11 millimètres de milieu complet par plat pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, mélangé 10 microgrammes d’ADN gratuit GPCR avec 500 microlitres de tris-EDTA solution de chlorure de calcium avec vortex suivi de l’ajout de 500 microlitres de tampon HEPES. Après avoir secoué vigoureusement, incuber la solution pendant une minute à température ambiante et ajouter immédiatement un millilitre de la solution goutte sage sur les cellules.Bercer doucement pour répartir uniformément le précipité et placer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, vérifiez l’efficacité de la transfection sous un imageur de cellule fluorescente. Les transactions supérieures à 50 % sont idéales.Rincer doucement les cellules transfectées avec la solution versène avant de détacher les cellules avec trois millilitres de 0,05% trypsine EDTA. Recueillir les cellules dissociées par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille à quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration moyenne affamée. Puis ensemencer 45 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de puits codée poly-L-lysine 384 et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins quatre heures.Pour préparer une demi-plaque de réponse dose-courbe de notation ajouter 270 microlitres de HBSS complétés avec HEPES et antibiotique antimycotique à tous sauf la dernière rangée d’une plaque de puits 96 et ajouter 30 microlitres de chaque solution médicamenteuse haute et basse aux puits de la rangée H.Transférer la solution de chaque puits de la rangée H dans le puits correspondant de la rangée G avec mélange et continuer à diluer périodiquement les composés médicamenteuses jusqu’à la dernière rangée de la plaque est atteint. En utilisant le schéma comme référence, mélanger 20 microlitres des dilutions à basse colonne des rangées A à G de la plaque de puits 96 et 20 microlitres des dilutions de la colonne haute aux puits B à H de la plaque de puits 96 à la plaque de puits précédemment assise 384. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins 16 heures.16 à 24 heures après le décantation de la stimulation du milieu cellulaire transfecté et ajouter 20 microlitres de réaccent de lueur à chaque puits pendant une incubation de cinq à 20 minutes avant de lire les plaques sur un compteur de luminescence de micro plaque avec un temps d’intégration d’une seconde par puits. Dans cette expérience représentative, sur les 168 RPG qui ont été interrogés lors du dépistage primaire, seuls les récepteurs dopaminergiques D3 et opsin 5 étaient des prétendants comme cibles actives potentielles. Le récepteur de dopamine D3 a produit un changement significatif de pli de log2 de 4.7 tandis que l’opsin 5 a produit une réponse légèrement inférieure de 2.39.En comparaison, le récepteur de dopamine D2, le contrôle positif pour l’écran primaire a produit un changement de pli de log2 de 4.58. Ces courbes de réponse du criblage secondaire ont démontré que l’extrait de granule de chromatine produisent les fenêtres semblables de signal dans la moitié des valeurs efficaces maximales de concentration au quinpirole confirmant sa validité en tant que coup actif au récepteur de dopamine D3. Une dose-courbe plate semblable au contrôle négatif a été produite pour opsin 5 cependant excluant ce récepteur comme cible possible pour l’extrait de granule de chromatine. Presto-Tango nécessite des soins spéciaux car les variabilités de la distribution cellulaire, de l’efficacité de la transfection et des dilutions de médicaments en série peuvent entraîner des erreurs aggravées, ce qui peut affecter l’exactitude des données.Des méthodes orthogonales telles que les approches radioligand-contraignantes, le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence et le calcium cyclique d’AMP et les analyses fonctionnelles d’internalisation peuvent être employées pour confirmer et caractériser davantage des interactions de récepteur de ligand.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Criblage à haut débit d&#39;Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Dépistage cinétique de l'activité nucléane à l'aide de sondes d'acide nucléique

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...