Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR-Stipendium #MOP142219) unterstützt.

1. Primäres Screening: Zellkultur und Plattenaussaat
<ol><li>Zur Herstellung von Poly-L-Lysin(PLL)-beschichteten Platten 20 l/well einer 25-g/ml-Stammlösung pLL in weißen oder schwarzen 384-Well-optischen Bodenplatten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette oder einem Reagenzienspender. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 0,5-2 h. HINWEIS: Wenn Sie die schwarzen 384-Well-Platten verwenden, erwarten Sie, dass das Hintergrundsignal niedriger ist als die weißen Platten. Schwarze Platten werden empf...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Die konformdynamischen GPCRs sind Kraftpakete der Signaltransduktion. Die physiochemischen Eigenschaften der Bindungstaschen dieser heptahelischen Rezeptoren sowie ihre physiologische Relevanz unterstreichen die Notwendigkeit von GPCR-Ligand-Screening-Tools. Wie oben dargestellt, ist der PRESTO-Tango-Assay schnell, sensibel und benutzerfreundlich und verleiht sich der Arzneimittelentwicklung. Dieser Assay misst nicht nur die agonistisch-induzierte Aktivierung, sondern kann auch zur Quantifizierung der Aktivität von Anta...

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und vielfältigste Familie von Transmembranproteinen, die als Kommunikationsschnittstellen zwischen einer Zelle und ihrerUmgebung1 funktionieren. Die Vielseitigkeit von GPCRs wird durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Liganden zu erkennen – von Neurotransmittern bis zu Nukleotiden, Peptide bis hin zu Photonen und vielem mehr – sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschussusw.beteiligt sind, sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss usw. beteiligt sind,werden. Angesichts ihrer Allgegenwart und Beteiligung an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen ist diese Rezeptorfamilie von größter therapeutischer Bedeutung, was durch die Tatsache belegt wird, dass mehr als ein Drittel der derzeit verfügbaren verordneten Medikamente auf GPCRs4abzielen. Diese bestehenden Therapeutika zielen jedoch nur auf eine kleine Teilmenge der Überfamilie ab (schätzungsweise 10 %), und die Pharmakologie vieler GPCRs bleibt ungeklärt. Darüber hinaus existieren mehr als 100 GPCRs als Orphan-Rezeptoren, da sie nicht mit einem endogenen Ligand5abgeglichen wurden. Daher ist das GPCR-Ligand-Screening entscheidend für die Entwaistisierung und Arzneimittelentwicklung, da es den Weg zur Lead-Entdeckung und -Optimierung und möglicherweise zur klinischen Testphase ebnet.
Methoden für das GPCR-Ligand-Screening sind traditionell in eine von zwei Kategorien gefallen, G-Protein-abhängige oder G-Protein-unabhängige funktionelle Assays6. Die GPCR-Signalisierung wird durch heterotrimere G-Proteine (G- und -Proteine) reguliert, die durch den Austausch von GTP gegen BIP aktiviert werden, die an die Untereinheit7gebunden sind. Signale des aktivierten Rezeptors werden von G-Proteinen über sekundäre Botenstoffe wie cAMP, Calcium, DAG und IP3 transduziert, um nachgeschaltete Signalisierung an downstreameffekten8zu vermitteln. Die Art der funktionellen Folgen der G-Protein-Signalisierung wurde genutzt, um zellbasierte Assays zu erstellen, die die Rezeptoraktivierung reflektieren. Diese Methoden, die proximale (direkte) oder distale (indirekte) Ereignisse in der G-Protein-Signalisierung messen, werden am häufigsten für das GPCR-Liganden-Screening verwendet und wurden hauptsächlich in Deorphanisierungsstudien eingesetzt6. Beispiele für Assays, die die GPCR-vermittelte G-Protein-Aktivierung direkt messen, sind der [35S]GTP-Bindungstest, der die Bindung eines radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren GTP analog zur G-Untereinheit misst, und Förster/Biolumineszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET/BRET) zur Überwachung von GPCR-G- und G-/G-Wechselwirkungen, die in den Jahren9,10, an Zugkraft gewonnen haben. Assays, die distale Ereignisse überwachen, sind die am häufigsten verwendeten Tools für die GPCR-Profilerstellung; Z. B. messen cAMP- und IP1/3-Assays die intrazelluläre Akkumulation von G-proteinabhängigen Sekundärbotenstoffen, während [Ca2+] Fluss- und Reporter-Assays mit spezifischen Reaktionselementen, die an der G-Protein-Aktivierung beteiligt sind (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), Ereignisse weiter nach der Signalkaskade11untersuchen. Während die meisten der oben genannten Assays auf einem hohen Durchsatzniveau durchgeführt werden können, sind ziemlich empfindlich und rühmen sich bestimmter assayspezifischer Vorteile (z.B. Diskriminierung zwischen Voll-/Teilagonisten, neutralen Antagonisten und inversen Agonisten im Falle der GTP-Bindung oder Assay-Funktionalität auf lebenden Zellen wie [Ca2+] und IP1/3)6, es gibt leider keine vorhandenen G-Protein-abhängigen Methoden, die der Abfrage des gesamten medikamentösen GPCR-Ome sausen. Dies ist weitgehend auf die native Kopplung mehrerer G-Protein-Unterfamilien mit GPCRs zurückzuführen, was zu Signalisierungen an mehreren Kaskaden und der unbekannten G-Protein-Kopplung bei verwaisten GPCRs führt. Um dieses Problem zu mildern, wurden Assays entwickelt, um die promiscuous G-Protein-Kopplung durch eine einzige gemeinsame Signalisierungsauslesung wie cAMP und Ca2+zu erzwingen, obwohl die meisten von ihnen einen niedrigen Durchsatz12sind.
Ein wichtiger Aspekt des GPCR-Lebenszyklus ist die Beendigung der G-Protein-abhängigen Signalisierung, die zu einem großen Teil durch die Rekrutierung von S-Arrestinen erfolgt, die eine Dissoziation des G-Proteins induziert und letztlich den Rezeptor desensizipiert, das für die clathrinbeschichtete Internalisierung13bestimmt ist. Die allgegenwärtigsten Isoformen von '-arrestin sind die nicht-visuellen '-arrestin1 und '-arrestin2, auch als arrestin-2 und arrestin-3 bzw.14bezeichnet. Geben Sie G-Protein-unabhängige zellbasierte Assays ein, die dem GPCR-Liganden-Screening eine neue Dimension verleihen; Rezeptorenhandel, etikettenfreie ganze Zelle und Rekrutierungs-Assays sind bemerkenswerte Beispiele. GPCR-Handelstests verwenden fluorophormarkierte Liganden oder ko-internalisierte Antikörper, die auf den Rezeptorabzielen 15, während etikettenfreie Ganzzell-Assays Biosensoren verwenden, die zelluläre Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, in quantifizierbare Ausgänge wie elektrische oder optische Signale16übersetzen. Bemerkenswert ist, dass die Quintessenz der GPCR---Arrestin-Interaktionen den Rekrutierungs-Assay von '-arrestin als attraktives Werkzeug im Repertoire der funktionalen Assays17. Das Tango-System, das erst vor einem Jahrzehnt von Barnea et al. entwickelt wurde, beinhaltet die Einführung von drei exogenen genetischen Elementen: eine Proteinfusion, bestehend aus dem "-arrestin2" mit einem Tabak-Ätzvirus-Protease (TEVp), einem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der über ein Tabak-Etch-Virus an einen GPCR gebunden ist Protease-Spaltungsstelle (TEVcs) und wird von einer Sequenz aus dem C-Terminus des V2-Vasopressinrezeptors (V2-Schwanz) zur Förderung der Verhaftung bei der Rekrutierung und einem Reporter-Luziferase-Gen, dessen Transkription durch die tTA-Transkriptionsfaktor-Translokation in den Kern, der nach der Rekrutierung von A-arrestin2 aus der Membranverankerung befreit wird (Abbildung 1)18. Quantitative Messwerte der GPCR-Aktivierung und der Rekrutierung von '-arrestin2 können anschließend durch Lesen auf Lumineszenz bestimmt werden. Ein bemerkenswerter Unterschied ist, dass der Tango zwar den Rezeptorhandel und die etikettenfreien Ganzzellmethoden relativ gering ist, aber mehrere Vorteile hat, einschließlich des selektiven Auslesens, das spezifisch für den Zielrezeptor ist, und der Empfindlichkeit aufgrund der Signalintegration, die ihn zu einem geeigneten Kandidaten für das Liganden-Screening in größerem Maßstabmachen 18.
Angesichts dieser strategischen Merkmale entwickelten Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), eine Open-Source-Plattform mit hohem Durchsatz, die den Tango-Ansatz nutzt, um das medikamentöse GPCR-Ome parallel und gleichzeitig zu profilieren19. PRESTO-Tango nutzt die "promiscuous" Rekrutierung von '-arrestin2 für fast alle GPCRs und ist die erste seiner Art in Bezug auf zellbasierte funktionelle Assays, die ein schnelles "Erstrunden"-Screening von kleinen Molekülverbindungen an fast allen nicht-olfaktorischen GPCRs, einschließlich Waisen, unabhängig von der G-Protein-Unterfamilie ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Als größte und vielseitigste Gen-Superfamilie und Vermittler einer Bandbreite zellulärer Signalwege stellen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eines der vielversprechendsten Ziele für die pharmazeutische Industrie dar. Ergo, das Design, die Implementierung und die Optimierung von GPCR-Liganden-Screening-Assays, ist von entscheidender Bedeutung, da sie Fernsteuerungstools für die Arzneimittelentdeckung und die Manipulation der GPCR-Pharmakologie und -Ergebnisse darstellen. In der Vergangenheit haben G-Protein-abhängige Assays diesen Forschungsbereich typisiert, Liganden-induzierte Ereignisse erkannt und die Erzeugung von sekundären Botenstoffen quantifiziert. Seit dem Aufkommen der funktionellen Selektivität sowie einem erhöhten Bewusstsein für mehrere andere G-proteinunabhängige Pfade und die Einschränkungen im Zusammenhang mit G-proteinabhängigen Assays gibt es jedoch einen größeren Schub für die Schaffung alternativer GPCR Liganden-Screening-Assays. Zu diesem Unterfangen beschreiben wir die Anwendung einer solchen Ressource, der PRESTO-Tango-Plattform, einem luziferase-Reporter-basierten System, das die parallele und gleichzeitige Abfrage des menschlichen GPCR-Omeermöglicht, eine Leistung, die zuvor in Betracht gezogen wurde technisch und wirtschaftlich nicht machbar. Basierend auf einem G-Protein-unabhängigen Rekrutierungstest für die Rekrutierung von G-Protein-Arrestin2 macht die Universalität des von der GPCR vermittelten Handels und der Signalisierung von '-arrestin2- und Signalisierungs-Atier-Medien PRESTO-TANGO zu einem geeigneten Werkzeug für die Untersuchung von ca. 300 nicht-olfaktorischen menschlichen GPCRs, darunter etwa 100 Orphan-Rezeptoren. Die Empfindlichkeit und Robustheit von PRESTO-Tango machen es für primäre Hochdurchsatzbildschirme geeignet, die zusammengesetzte Bibliotheken verwenden, um neue GPCR-Ziele für bekannte Medikamente aufzudecken oder neue Liganden für Orphan-Rezeptoren zu entdecken.

Mit dem hier vorgestellten PRESTO-Tango-Protokoll wurde ein Chromaffin-Granulat (CG)-Extrakt mit 168 nicht-olfaktorischen GPCR-Zielen abgeschirmt, wobei die Mehrheit Waisenrezeptoren waren. Die Profilierung dieses Extraktes erfolgte durch die Untersuchung der Mobilisierung von '-arrestin2 an den gewählten Rezeptoren, basierend auf dem von Barnea et al.18 entworfenen Prinzip (Abbildung 1). Plasmid cDNA der GPCRs wurde aus dem PRESTO-Tango GPCR Kit entnommen und in zwe...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Die Presto-Tango-Plattform wurde entwickelt, um die parallele und gleichzeitige Abfrage aller nicht-olfaktorischen GPCRs im menschlichen Genom durchzuführen, einschließlich der verwaisten Ziele, um Ligand-induzierte Beta-Arrestin-2-Rekrutierung zu profilieren. Die Presto-Tango-Plattform ist die einzige Open-Source-Ressource zur Profilierung des gesamten GPCR-Genoms in einem parallelen Ansatz, indem ein G-Protein-unabhängiger Beta-Arrestin-Rekrutierungstest verwendet wird. Den Prozessor zu demonstrieren wären Genevieve Laroche, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, und Manel Zighal, ein Doktorand in meinem Labor.Vor Beginn des Verfahrens 20 Mikroliter einer 25 Mikrogramm pro Milliliter Poly-L-Lysin-Lösung in jeden Brunnen der entsprechenden experimentellen Anzahl von 384 optischen Bodenplatten hinzufügen und die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis zwei Stunden inkubieren. Am Ende der Inkubation die Platten über die Spüle ziehen, um das überschüssige Poly-L-Lysin zu entfernen und jedem Brunnen 40 Mikroliter antimykotische Lösung hinzuzufügen. Dann inkubieren Sie die Platten für die Zellsaat bei 37 Grad Celsius benötigt und legen Sie den Rest der Platten bei vier Grad Celsius für die langfristige Lagerung.Um HTLA-Zellen für das primäre Screening auszusäen, spülen Sie konfluente 150-Millimeter-Zellkulturen mit 10 Milliliter PBS vorsichtig ab, bevor Sie die Kulturen mit sechs Millilitern 0,05% Trypsin EDTA pro Schale behandeln. Wenn die Zellen abgetrennt haben Pool die Zellsuspensionen in einem 50 Milliliter konischen Rohr mit einem gleichen Volumen von DMEM. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie das Pellet mit 2,2 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter DMEM-Konzentration wieder auf und ziehen Sie die Platten über die Spüle, um die antimykotische Lösung zu entfernen. Tippen Sie auf die Teller, um zu trocknen und säen Sie 45 Mikroliter Zellen in jedem Brunnen. Dann legen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 45% Kohlendioxid über Nacht.Zur Vorbereitung der 384 Well DNA-Quellenplatte für die Transfektion verteilen Sie 50 Nanogramm pro Milliliter jedes Plasmids, die für das GPRC Tango-Konstrukt von Interesse in 0.1X Tris-EDTA pro Bohrgut einer 96-Well-Platte kodiert. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um 10 Mikroliter DNA-Lösung von jedem Brunnen der 96-Well-Platte manuell auf einzelne Bohrungen einer 384-Well-DNA-Quellplatte in Quadruplikat für jeden Zustand zu übertragen, wie dargestellt. Als nächstes 40 Mikroliter einer 0,313 Molaren-Calciumchloridlösung auf jeden Brunnen der DNA-Quellenplatte übertragen und den Inhalt jedes Brunnens vorsichtig mischen.Fügen Sie 50 Mikroliter 2x HEPES Puffer zu jedem Brunnen der 384 Well DNA-Quellenplatte mit sanfter Mischung hinzu. Nach einer Minute übertragen Sie 10 Mikroliter der DNA-Transfektionsmischung aus der 384 Well DNA-Quellenplatte auf jeden Brunnen von gesäten HTLA-Zellen und inkubieren die Zellen im Zellkultur-Inkubator über Nacht. Am nächsten Tag dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie langsam 40 Mikroliter verhungerndes Medium zu jedem Brunnen hinzu, wobei darauf geachtet wird, die Zellen nicht direkt zu berühren.Dann 20 Mikroliter des Fahrzeugpuffers für die abwechselnden Reihen ohne Verbindung in 20 Mikroliter der Zinsverbindung in einer dreifachen Konzentration in die abwechselnden Reihen geben, bevor die Platte in den Zellkultur-Inkubator zurückgebracht wird. 16 bis 24 Stunden nach der Stimulation dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie jedem Brunnen 20 Mikroliter frisch zubereitetes Glühreagenz für eine fünf- bis 20-minütige Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur hinzu. Dann lesen Sie die Platten auf einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler mit einer Integrationszeit von einer Sekunde pro Brunnen.Für ein sekundäres Screening, Subkultur die HTLA-Zellen in 100-Millimeter-Schalen bei einem fünf mal 10 bis die sechs Zellen Gesamtzelldichte in 11 Millimeter n gesamten Medium pro Schale für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag gemischt 10 Mikrogramm GPCR-Komplementär-DNA mit 500 Mikroliter NghAs-Calciumchloridlösung mit Wirbel, gefolgt von der Zugabe von 500 Mikroliter HEPES-Puffer. Nach kräftigem Schütteln die Lösung für eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und sofort einen Milliliter der Lösung auf die Zellen tropfen lassen.Sanft schaukeln, um den Niederschlag gleichmäßig zu verteilen und die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius zu platzieren. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Transfektionseffizienz unter einem fluoreszierenden Zellbildbild. Transaktionen mit einer Abdeckung von mehr als 50 % sind ideal.Spülen Sie die transfizierten Zellen vorsichtig mit Versenlösung ab, bevor Sie die Zellen mit drei Millilitern 0,05%Trypsin EDTA lösen. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet viermal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter verhungernder mittlerer Konzentration wieder auf. Dann säen Sie 45 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer Poly-L-Lysin codierten 384 WellPlatte und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator für mindestens vier Stunden.Zur Vorbereitung einer halben Log-Dosis-Kurve-Ansprechplatte fügen Sie 270 Mikroliter HBSS ergänzt mit HEPES und Antimycotic antimycotic zu allen außer der letzten Reihe einer 96 Well Platte und fügen Sie 30 Mikroliter jeder hohen und niedrigen Wirkstofflösung zu den Brunnen der Reihe H.Übertragen Sie die Lösung aus jedem Brunnen der Reihe H in den entsprechenden Brunnen der Reihe G mit Mischen und weiterhin seriell verdünnen erreicht ist. Unter Verwendung des Schaltplans als Referenz mischen Sie 20 Mikroliter der niedrigen Säulenverdünnungen aus den Reihen A bis G der 96-Wellplatte und 20 Mikroliter der hochsäulenverdünnungsmittels zu den Brunnen B bis H der 96-Wellplatte zur zuvor sitzenden 384-Wellplatte. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens 16 Stunden.16 bis 24 Stunden nach der Stimulation dekantieren Sie das transfizierte Zellmedium und fügen Sie jedem Bohrkörper 20 Mikroliter Glühreagenz für eine inkubation von fünf bis 20 Minuten hinzu, bevor Sie die Platten auf einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler mit einer Integrationszeit von einer Sekunde pro Brunnen lesen. In diesem repräsentativen Experiment waren von den 168 GPCRs, die im Primärscreening abgefragt wurden, nur Dopaminrezeptor D3 und Opsin 5 Anwärter als potenzielle aktive Ziele. Dopamin-Rezeptor D3 produzierte eine signifikante Log2-Faltenänderung von 4,7, während Opsin 5 eine etwas geringere Reaktion von 2,39 produzierte.Im Vergleich dazu, Dopamin-Rezeptor D2, die positive Kontrolle für den primären Bildschirm produziert eine log2 Faltenänderung von 4,58. Diese Ansprechkurven aus dem sekundären Screening zeigten, dass Chromatingranulatextrakt ähnliche Signalfenster in halbso maximalen effektiven Konzentrationswerten erzeugt, um Quinpirol zu bestätigen, das seine Gültigkeit als aktiver Treffer am Dopaminrezeptor D3 bestätigt. Für Opsin 5 wurde eine flache Dosiskurve ähnlich der Negativkontrolle erzeugt, die diesen Rezeptor jedoch als mögliches Ziel für den Chromatin-Granulatextrakt ausschließt. Presto-Tango erfordert besondere Sorgfalt, da Variabilitäten in der Zellverteilung, Transfektionseffizienz und seriellen Arzneimittelverdünnungen zu zusammengesetzten Fehlern führen können, die die Genauigkeit der Daten beeinflussen können.Orthogonale Methoden wie Radioligand-Bindungsansätze, Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer und Cyclic AMP-Calcium- und Internalisierungs-Funktionsassays können verwendet werden, um Ligandenrezeptor-Wechselwirkungen weiter zu bestätigen und zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...