Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (מענק CIHR #MOP142219).

1. הקרנה ראשונית: תרבית תאים וזריעת צלחות
<ol><li>כדי להכין פולי-L-ליזין (PLL) לוחות מצופים, לוותר 20 μL/טוב של 25 μg/mL פתרון מניות של PLL ב לבן או שחור 384-היטב אופטי לוחות באמצעות פיפטה מרב-ערוצי אלקטרוניים או מנפק מגיב. מודב את הצלחות בטמפרטורת החדר עבור 0.5 – 2 h. הערה: אם השימוש בלוחות הצבע השחור 384-היט?...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

הGPCRs הדינמיים הם בתים. מכוח הקליטה המאפיינים הפיזיוכימיים של כיסי הכריכה של קולטני האלה, כמו גם הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם מדגישים את הצורך בכלי הסינון של GPCR. כפי שהוצג לעיל, שיטת הטנגו פרסטו מהירה, רגישה וידידותית למשתמש, ומשאילה את עצמה לפיתוח סמים. לא רק שאלה מדידה הפעלה אגוניסט המושרה,...

G-חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה והמגוונת ביותר של חלבונים transממברני, הפעלה כממשקי תקשורת בין תא לסביבתו1. רב-תכליתיות של GPCRs מודגשת על ידי היכולת שלהם לזהות מגוון מגוון של ליגנדס – מ נוירוטרנסמיטורים כדי נוקלאוטידים, פפטידים לפוטונים, ועוד רבים – כמו גם היכולת שלהם להסדיר מפלים רבים במורד הזרם מעורב בצמיחה תאית, הגירה, בידול, אפופטוזיס, תא ירי, וכו '2,3. בהתחשב הייתה שלהם ומעורבות בהמון תהליכים פיסיולוגיים, משפחת הקולטן הזאת היא בעלת חשיבות טיפולית מירבית, לראווה על ידי העובדה כי יותר משליש של כרגע זמין תרופות מרשם היעד GPCRs4. עם זאת, הtherapeutics הקיימים האלה מכוונים רק לקבוצת משנה קטנה של סופרמשפחה (מוערך של 10%), והפרמקולוגיה של GPCRs רבים נותרה ללא מובהר. יתר על כן, יותר מ 100 GPCRs להתקיים כמו קולטנים יתומים, כפי שהם לא התאימו עם ליגני אנדוגניים5. כך, gpcr ליגנד הקרנה היא קריטית בדאוראנזציה ופיתוח התרופה, כפי שהוא מפעיל את הדרך לקראת גילוי המוביל ואופטימיזציה, ואולי לשלב ניסוי קליני.
שיטות ל-gpcr ליגנד ההקרנה באופן מסורתי נפלו באחת משתי קטגוריות, g-חלבון תלוי או g-חלבון בלתי תלוי תפקודית מספר6. האיתות gpcr מוסדר על ידי heterotrimeric G-חלבונים (Gαβγ), אשר מופעלים על ידי חילופי gtp עבור התוצר המאוגד על gα יחידת7. אותות מן הקולטן המופעל הם התמרה ידי G-חלבונים באמצעות שליחים משניים, כגון מחנה, סידן, דאג, ו IP3, כדי לתווך איתות במורד הזרם במורד הזרם8. האופי של ההשלכות הפונקציונליות של מאותת G-חלבון נוצל כדי ליצור תא מבוסס בחני כי לשקף את הפעלת הקולטן. שיטות אלה, אשר למדוד הקרובות (ישיר) האירועים (עקיף) מערכת איתות G-חלבון, הם בשימוש התכוף ביותר GPCR ליגיון ו כבר המועסקים בעיקר במחקרים deהניניזציה6. דוגמאות של בחני אומר כי באופן ישיר למדוד gpcr-מתווך G-חלבון הפעלה כוללים את שיטת הכריכה של [35s] GTPγS, אשר מודד את הכריכה של רדיויניום ו-hydrolyzable gtp אנלוגי ליחידת המשנה gα, ו förster/ביולומינסנציה העברת אנרגיה (לדאוג/ברט, בהתאמה) רגשים כדי לנטר gpcr-gα ו gα/Gγ אינטראקציות, אשר כבר צובר המתיחה על השנים9,10. Assays כי ניטור האירועים הם הכלים הנפוצים ביותר עבור פרופיל GPCR; לדוגמה, מחנה ו IP1/3 בחני למדוד תאיים הצטברות של G-חלבון שליחים משניים תלויים, בעוד [Ca2 +] השטף הכתב בחני מעורבים אלמנטים תגובה ספציפיים מעורב בהפעלת G-חלבון (היצור, nfat-RE, sre, srf-re) לבחון את האירועים עוד במורד הזרם איתות1 בעוד שרוב האמור לעיל ניתן לבצע ברמת תפוקה גבוהה, הם רגישים למדי, ומתגאים ביתרונות מסוימים של שיטה מסוימת (למשל, הפליה בין האגוניסטים מלאים/חלקיים, אנטוניסטים ניטרליים ו אגוניסטים הופכי במקרה של איגוד GTPγS, או לספק פונקציונליות על תאים חיים כגון [Ca2 +] ו IP1/3)6, למרבה הצער לא קיים שיטות התלויות g-חלבון ההולם את החקירה זה בעיקר בשל צימוד מקורי של משפחות משנה G-חלבון GPCRs, וכתוצאה מכך איתות על מפלי מספר וצימוד G-חלבון לא ידוע ב GPCRs יתום. כדי להמתיק את הבעיה, שפותחה כדי לכפות צימוד G-חלבון מופקר באמצעות איתות יחיד משותף הקריאה-out, כגון מחנה, ו-Ca2 +, למרות שרובם הם תפוקה נמוכה12.
היבט חשוב של מחזור החיים GPCR הוא לסיום של האיתות התלוי בחלבון G, אשר מתרחשת בחלק הגדול באמצעות גיוס של β-הפיגור אשר מעורר את הדיסוציאציה של G-חלבון, ובסופו של דבר הפחתת הרגישות של הקולטן, אשר מיועדת עבור הפנמה מצופה קלטרין13. הבלתי-מβ ביותר בעלי הצורה האוביייתית ביותר, הם הβ-arrestin1 וβ-arrestin2, מסומנים גם כפיגור של 2 ופיגור-3, בהתאמה ל-14. הזן G-חלבון עצמאי מבוסס תא המבוסס, אשר מוסיפים ממד חדש GPCR ליגיון והקרנה; הקולטן הסחר, תא שלם ללא תווית, ו β מפיגור הגיוס מוסר הם כל הדוגמאות הבולטות. Gpcr סחר בחני מעסיקים שימוש fluorophore מתויג ליגטים או שיתוף הפניהפנטים מיקוד הקולטן15, ואילו התווית של תא שלם חינם השימוש בביוחיישנים לתרגם שינויים סלולריים המושרה על ידי ligands קשירה לתוך כימות תפוקות, כגון אותות חשמליים או אופטיים16. בעיקר, התמציתי gpcr-β-מפיגור האינטראקציות אופנה הβ מפיגור שיטת הגיוס ככלי אטרקטיבי ברפרטואר של בחני פונקציונלי17. מערכת הטנגו, שפותחה לראשונה על ידי ברנע ואח '. רק לפני עשור, כרוכה המבוא של שלושה אלמנטים גנטיים אקסוסוגני: היתוך חלבון המורכב β-arrestin2 עם וירוס איכול הטבק פרוטאז (tevp), טטרציקלין transactivator (tTA) כי הוא קשור gpcr באמצעות וירוס איכול הנגיף פרוטאז באתר (בטביה) והוא לפניו על ידי רצף מ-C הטרמינוס של הקולטן v2 וזופרסין סין (v2 זנב) כדי לקדם את הגיוס הפיגור, ואת הכתב הגן לוציפראז אשר שעתוק מופעלות על ידי ה tTA שעתוק גורם הטרנסלוקציה לגרעין, אשר שוחרר מן הקרום עיגון בעקבות גיוס β-arrestin2 (איור 1)18. קריאות כמותי של הפעלה GPCR ו-β-arrestin2 ניתן לקבוע לאחר מכן על ידי קריאה לאור. הבחנה בולטת היא שבזמן הסחר בקולטן ושיטות התא ללא תווית שלמות הם בעלי תפוקה נמוכה יחסית, לטנגו יש מספר יתרונות, כולל לקריאה סלקטיבית כי הוא ספציפי קולטן היעד ואת הרגישות בשל שילוב אותות, מה שעושה את זה מועמד מתאים עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה גדול יותר18.
לאור התכונות האסטרטגיות הללו, Kroéet al. פיתח-טנגו (קולטן מקבילי-ביטוי ome והקרנה דרך Transcript פלט-טנגו), פלטפורמת הקוד הפתוח של תפוקה גבוהה המשתמשת בגישה טנגו לפרופיל druggable GPCR-ome באופן מקבילי וסימולטני19. ניצול "מופקר" הגיוס של β-arrestin2 כמעט כל GPCRs, פרסטו-טנגו הוא הראשון-של-שלה מסוג במונחים של מבוסס התא assays, הפעלת מהירה "בסיבוב הראשון" הקרנה של תרכובות מולקולה קטנה בכמעט כל הריח הGPCRs, כולל יתומים, עצמאית של G-חלבון צימוד משפחה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

כמו הגדול ביותר ואת המגוונת ביותר גן המשפחה ומגשרים של סולם הצבעים של מסלולים איתות סלולרי, G-חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs) מייצגים אחד היעדים המבטיחים ביותר עבור תעשיית התרופות. מכאן, העיצוב, יישום, אופטימיזציה של gpcr ליגנד הקרנת ההקרנה הוא קריטי, כפי שהם מייצגים כלי בקרה מרחוק עבור גילוי סמים ולטיפול בפרמקולוגיה gpcr ותוצאות. בעבר, ה-G-חלבון התלוי מאופיין בתחום זה של מחקר, גילוי אירועים המושרה וכימות הדור של שליחים משניים. עם זאת, מאז הופעתו של בסלקטיביות תפקודית, כמו גם מודעות מוגברת של מסלולים אחרים חלבון בלתי תלוי בחלבונים והמגבלות הקשורות ל-G-חלבון תלוי assays, יש דחיפה גדולה יותר לקראת יצירת חלופה GPCR ליגיון. לקראת מאמץ זה, אנו מתארים את היישום של משאב כזה, פלטפורמת הטנגו פרסטו, מערכת מבוססת כתבת לוציפראז המאפשרת את החקירה המקבילה והזמנית של GPCR של האדם, הישג שנחשב בעבר . טכנית ובלתי אפשרי מבחינה כלכלית מבוסס על מערכת הגיוס העצמאית של G-חלבון β-arrestin2, אוניברסליות של β-arrestin2 בתיווך הסחר ואיתות ב GPCRs עושה פרסטו-טנגו כלי מתאים ללמוד כ 300 האדם שאינו הריח, כולל כ 100 קולטנים יתומים. לפרסטו-רגישות של טנגו וחוסן להפוך אותו מתאים מסכי תפוקה גבוהה הראשי באמצעות ספריות מורכבות, מועסק לחשוף מטרות GPCR חדש עבור סמים ידועים או כדי לגלות ליגטים חדשים עבור קולטנים יתומים.

באמצעות פרוטוקול הטנגו פרסטו הציג לעיל, chromaffin גרגר עושה (CG) תמצית הוקרן נגד 168 מטרות gpcr לא הריח, עם רוב להיות קולטנים יתומים. יצירת פרופיל של תמצית שנאמר בוצעה על ידי בחינת β-arrestin2 הגיוס על הקולטנים שנבחרו, על בסיס העיקרון שתוכנן על ידי ברנע ואח '18 (איור 1). פלמיד cDNA ...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

פלטפורמת פרסטו-טנגו הומצאה כדי לבצע את החקירה המקבילה בו זמנית של כל GPCRs שאינם חוש הריח בגנום האנושי, כולל כי מטרות יתומות פרופיל בטא-arrestin הנגרמת על ידי ליגנד 2 גיוס. פלטפורמת פרסטו-טנגו היא משאב קוד פתוח היחיד לפרופיל הגנום GPCR כולו בגישה מקבילה, באמצעות בדיקה עצמאית לגיוס בטא-arrestin חלבון G. הוכחת המעבד תהיה ז'נבייב לארוש עמית מחקר במעבדה שלי, ומנאל זיגאל, מועמד לדוקטורט במעבדה שלי.לפני תחילת ההליך להוסיף 20 microliters של 25 מיקרוגרם לכל פתרון פולי-L-ליסין מיליליטר לכל באר של המספר הניסיוני המתאים של 384 לוחות תחתונים אופטיים דגירה הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד שעתיים. בסוף הדגירה, להעיף את הצלחות מעל הכיור כדי להסיר את עודף פולי L-ליסין ולהוסיף 40 microliters של פתרון אנטי מיקוטי אנטיביוטי לכל באר. לאחר מכן הדגירה את הצלחות הדרושות לזרוע תאים ב 37 מעלות צלזיוס ומנחים את שאר הצלחות בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.כדי לזרוע תאי HTLA להקרנה ראשונית, יש לשטוף בעדינות תרבויות תאים של 150 מילימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לפני הטיפול בתרבויות עם שישה מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA למנה. כאשר התאים יש בריכה מנותקת מתלי התא בצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל נפח שווה של DMEM. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.להשעות מחדש את גלולה ב 2.2 פעמים 10 לתאים החמישי לכל מיליליטר של ריכוז DMEM ולהעיף את הצלחות מעל הכיור כדי להסיר את הפתרון האנטימיקוטי אנטיביוטי. הקש על הצלחות לייבוש וזרע 45 מיקרוליטרים של תאים לתוך כל באר. ואז למקם את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 45% פחמן דו חמצני לילה.כדי להכין את צלחת מקור DNA 384 היטב עבור transfection להפיץ 50 ננוגרם למיליליטר של כל פלסמיד חינם DNA קידוד מבנה טנגו GPRC של עניין 0.1X טריס-EDTA לתוך כל באר של צלחת 96 היטב. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר באופן ידני 10 microliters של פתרון DNA מכל באר של 96 צלחת גם בארות בודדות של אחד 384 גם צלחת מקור DNA מרובע עבור כל מצב כפי שמודגם. לאחר מכן, מעבירים 40 מיקרוליטרים של תוסף סידן כלורי טוחן 0.313 לכל באר של צלחת מקור הדנ"א ומערבבים בעדינות את התוכן של כל באר.הוסף 50 מיקרוליטרים של חיץ HEPES 2x לכל באר של צלחת מקור DNA 384 היטב עם ערבוב עדין. לאחר העברה של דקה אחת 10 microliters של תערובת transfection DNA מ 384 צלחת מקור DNA היטב לכל באר של תאי HTLA זרעים דגירה התאים באינקובטור תרבות התא לילה. למחרת decant מדיום התא מנומק לאט להוסיף 40 microliters של בינוני מורעב לכל טוב דואג לא לגעת בתאים ישירות.לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של חיץ הרכב לשורות המתחלפות ללא תרכובת ב-20 מיקרוליטרים של מתחם הריבית בריכוז של פי שלושה לשורות המתחלפות, לפני החזרת הצלחת לאנקובטור תרבות התאים. 16 עד 24 שעות לאחר גירוי decant את מדיום התא מנוכה ולהוסיף 20 microliters של reagent זוהר מוכן טרי לכל באר עבור דגירה חמש עד 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. ואז לקרוא את הצלחות על מונה זוהר מיקרו צלחת עם זמן אינטגרציה של שנייה אחת לגם.עבור הקרנה משנית, תת תרבות תאי HTLA ב 100 מילימטר מנות ב חמש פעמים 10 לשש תאים צפיפות התא הכוללת ב 11 מילימטרים של מדיום מלא לכל צלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, מעורב 10 מיקרוגרם של GPCR חינם DNA עם 500 microliters של פתרון סידן כלורי Tris-EDTA עם מערבולת ואחריו תוספת של 500 microliters של מאגר HEPES. לאחר רעידות נמרצות, הדגירה את הפתרון במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ומיד להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון טיפה חכם על התאים.מתנדנדים בעדינות כדי להפיץ את המשקעים באופן שווה ולה מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת, לבדוק את יעילות transfection תחת תמונה תא פלואורסצנטי. תנועות הגדולות מ- 50%כיסוי הן אידיאליות.יש לשטוף בעדינות את התאים המהותיים בתווית פסוק לפני ניתוק התאים בשלושה מיליליטר של 0.05%trypsin EDTA. לאסוף את התאים ניתוק על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בארבע פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני מורעב. ואז זרעים 45 microliters של תאים לתוך כל באר של פולי L-ליסין מקודד 384 צלחת גם למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא לפחות ארבע שעות.כדי להכין צלחת תגובה חצי יומן מינון עקומת להוסיף 270 microliters של HBSS בתוספת HEPES ואנטיביוטיקה antimycotic לכל אבל השורה האחרונה של צלחת 96 גם ולהוסיף 30 microliters של כל פתרון תרופה גבוהה ונמוכה לתוך בארות של שורה H.Transfer הפתרון מכל באר של שורה H לתוך באר המתאימה של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של H לתוך באר המתאימה של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של H לתוך באר תואמת של שורה G עם ערבוב ולהמשיך לדלל באופן סדרתי את תרכובות התרופה עד השורה האחרונה של הוא הגיע. באמצעות סכמטי כהפניה, לערבב 20 microliters של דילול עמודות נמוך משורות A עד G של צלחת 96 גם ו 20 microliters של דילול עמוד גבוה בארות B דרך H של צלחת 96 גם לצלחת 384 באר יושב בעבר. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך מינימום של 16 שעות.16 עד 24 שעות לאחר decant גירוי מדיום התא מנוכה ולהוסיף 20 microliters של reagent זוהר לכל באר במשך חמש עד 20 דקות דגירה לפני קריאת הצלחות על מונה זוהר צלחת מיקרו עם זמן אינטגרציה של שנייה אחת ל הבאר. בניסוי מייצג זה, מתוך 168 GPCRs שנחקרו בהקרנה העיקרית, רק קולטן דופמין D3 ואופסין 5 היו מתמודדים כיתרים פעילים פוטנציאליים. קולטן דופמין D3 הפיק שינוי משמעותי קיפול log2 של 4.7 ואילו opsin 5 הפיק תגובה מעט נמוכה יותר של 2.39.לשם השוואה, קולטן דופמין D2, השליטה החיובית עבור המסך הראשי הפיק שינוי קיפול log2 של 4.58. עקומות תגובה אלה מן ההקרנה המשנית הראו כי תמצית גרנול כרומטין לייצר חלונות אות דומים בערכי ריכוז יעילים חצי מקסימלית כדי quinpirole המאשר את תוקפו כמו להיט פעיל קולטן דופמין D3. עקומת מינון שטוח דומה לשליטה השלילית הופק עבור opsin 5 עם זאת שולל קולטן זה כמטרה אפשרית עבור תמצית גרנול כרומטין. Presto-טנגו דורש טיפול מיוחד כמו variabilities בהפצת תאים, יעילות transfection ודילול תרופות סדרתי יכול לגרום לשגיאה מורכבת, אשר יכול להשפיע על הדיוק של הנתונים.שיטות אורתוגונליות כגון גישות מחייבות רדיוליגנד, העברת אנרגיה תהודה Bioluminescence ו סידן AMP מחזורי בדיקות תפקודיות הפנמה ניתן להשתמש כדי לאשר עוד יותר לאפיין אינטראקציות קולטן ligand.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...