Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

इस काम को कनाडा के इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर ग्रांट #MOP142219) ने सपोर्ट किया ।

1. प्राथमिक स्क्रीनिंग: सेल संस्कृति और प्लेट सीडिंग
<ol><li>पॉली-एल-लाइसिन (PLL) कोटेड प्लेटें तैयार करने के लिए, इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट या रिएजेंट डिस्पेंसर का उपयोग करके सफेद या काले ३८४-अच्छी तरह से...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

सहमति से गतिशील जीपीसीआरएस सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन के पावरहाउस हैं। इन हेप्टाहेलिक रिसेप्टर्स की बाध्यकारी जेब के शारीरिक गुण, साथ ही उनकी शारीरिक प्रासंगिकता जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग टूल की आ?...

जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के सबसे बड़े और सबसे विविध परिवार का गठन करते हैं, जो कोशिका और उसके पर्यावरण1के बीच संचार इंटरफेस के रूप में काम करते हैं। जीपीसीआरएस की बहुमुखी प्रतिभा को लिगांड की एक विविध सरणी का पता लगाने की उनकी क्षमता से प्रकाश डाला जाता है- न्यूरोट्रांसमीटर से न्यूक्लियोटाइड्स तक, पेप्टाइड्स से फोटॉन, और कई औरअधिक - साथ ही सेलुलर विकास, प्रवास, भेदभाव, एपोप्टोसिस, सेल फायरिंग आदि में शामिल कई डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को विनियमित करने की उनकीक्षमता। उनकी सर्वव्यापकता और शारीरिक प्रक्रियाओं की एक भीड़ में शामिल होने को ध्यान में रखते हुए, इस रिसेप्टर परिवार अत्यंत चिकित्सीय महत्व का है, इस तथ्य से प्रदर्शित किया गया है कि वर्तमान में उपलब्ध दवाओं के एक तिहाई से अधिक GPCRs4लक्ष्य । हालांकि, ये मौजूदा चिकित्सा विज्ञान केवल सुपरफैमिली (अनुमानित 10%) के एक छोटे सबसेट को लक्षित करते हैं, और कई जीपीसीआरएस की फार्माकोलॉजी असंबंधित बनी हुई है। इसके अलावा, 100 से अधिक जीपीसीआरएस अनाथ रिसेप्टर्स के रूप में मौजूद हैं, क्योंकि उनका मिलान एक एंडोजेनस लिगांड5से नहीं किया गया है। इस प्रकार, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग अनाथीकरण और दवा विकास में महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लीड खोज और अनुकूलन की दिशा में मार्ग प्रशस्त करता है, और संभवतः नैदानिक परीक्षण चरण के लिए।
जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए तरीके पारंपरिक रूप से दो श्रेणियों में से एक में गिर गए हैं, जी-प्रोटीन निर्भर या जी-प्रोटीन स्वतंत्र कार्यात्मक परख6। जीपीसीआर सिग्नलिंग को विषमतात्मक जी-प्रोटीन (Gαο) द्वारा विनियमित किया जाता है, जो जीएलपी के लिए जीटीपी के आदान-प्रदान से सक्रिय होते हैं जो Gα उपइकान7पर बाध्य होते हैं। सक्रिय रिसेप्टर से संकेतों को सीएमपी, कैल्शियम, डेग और आईपी 3 जैसे माध्यमिक दूतों के माध्यम से जी-प्रोटीन द्वारा स्थानांतरित किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीमप्रभावकों 8पर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग में मध्यस्थता करने के लिए होता है। जी प्रोटीन सिग्नलिंग के कार्यात्मक परिणामों की प्रकृति का दोहन सेल आधारित परख बनाने के लिए किया गया है जो रिसेप्टर सक्रियण को प्रतिबिंबित करते हैं । ये तरीके, जो जी-प्रोटीन सिग्नलिंग में समीपस्थ (प्रत्यक्ष) या डिस्टल (अप्रत्यक्ष) घटनाओं को मापते हैं, का उपयोग अक्सर जीपीसीआर लिगलैंड स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है और मुख्य रूप से डीलमोथेशन स्टडीज6में नियोजित किया गया है। परख ों के उदाहरण जो सीधे जीपीसीआर-मध्यस्थता जी-प्रोटीन सक्रियण को मापते हैं, उनमें [35S] GTPοS बाध्यकारी परख शामिल है, जो Gα उपइकाई के लिए एक रेडियोलेबल और गैर हाइड्रोलाइजेबल जीटीपी एनालॉग के बाध्यकारी उपाय, और Förster/bioluminescence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET/BRET, क्रमशः) जांच GPCR-Gα और Gα/Gο बातचीत है, जोपिछले कुछवर्षों में अधिक कर्षण प्राप्त कर रहा है की निगरानी के लिए 9,10। Asकहते हैं कि जिला घटनाओं की निगरानी जीपीसीआर प्रोफाइलिंग के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं; उदाहरण के लिए, सीएएमपी और IP1/3 परख जी-प्रोटीन निर्भर माध्यमिक दूतों के इंट्रासेलर संचय को मापते हैं, जबकि [सीए2 + ]प्रवाह और रिपोर्टर परखों में जी-प्रोटीन सक्रियण (सीआरई, NFAT-RE, एसआरई, एसआरएफ-आरई) में फंसाए गए विशिष्ट प्रतिक्रिया तत्वशामिल हैं, जो सिग्नलिंग कैस्केड11को और डाउनस्ट्रीम करते हैं । जबकि उपरोक्त अधिकांश परखों को उच्च-थ्रूपुट स्तर पर किया जा सकता है, काफी संवेदनशील हैं, और कुछ परख-विशिष्ट लाभों का दावा करते हैं (उदाहरण के लिए, GTPοS बाध्यकारी, या लाइव कोशिकाओं पर परख कार्यक्षमता जैसे [सीए2 +] और IP1/3)6के मामले में पूर्ण/आंशिक agonists, तटस्थ विरोधी और विलोम agonists के बीच भेदभाव, दुर्भाग्य से कोई मौजूदा जी-प्रोटीन निर्भर तरीके हैं जो पूरे दवाजी जीपीसीआर-ओम की पूछताछ के लिए उपयुक्त हैं। यह काफी हद तक जीपीसीआरएस के लिए कई जी प्रोटीन उपपरिवारों के देशी युग्मन के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कई झरने और अनाथ GPCRs पर अज्ञात जी प्रोटीन युग्मन पर संकेत है । इस मुद्दे को कम करने के लिए, परखों को एक आम सिग्नलिंग रीड-आउट के माध्यम से संकीर्ण जी-प्रोटीन युग्मन को मजबूर करने के लिए विकसित किया गया है, जैसे सीएएमपी, और सीए2 +,हालांकि उनमें से अधिकांश कम थ्रूपुट12हैं।
जीपीसीआर जीवनचक्र का एक महत्वपूर्ण पहलू जी-प्रोटीन-निर्भर सिग्नलिंग की समाप्ति है, जो बड़े हिस्से में जी-प्रोटीन के विसोशन को प्रेरित करने वाले गिरफ्तारकरने के माध्यम से होता है, और अंततः रिसेप्टर को हतोत्साहित करता है, जिसे क्लैथरिन-लेपित आंतरिककरण13के लिए लक्षित किया जाता है। 1 में गिरफ्तार किए गए अदृश्य और गिरफ्तार 2 में क्रमश: गिरफ्तारी-2 और गिरफ्तार-3 के रूप में भी दर्शाया गयाहै। जी-प्रोटीन स्वतंत्र सेल आधारित परख दर्ज करें, जो जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग में एक नया आयाम जोड़ते हैं; रिसेप्टर तस्करी, लेबल मुक्त पूरे सेल, और भर्ती परख में गिरफ्तार सभी उल्लेखनीय उदाहरण हैं । जीपीसीआर ट्रैफिकिंग परखों में फ्लोरोफोर-लेबल वाले लिगांडया को रिसेप्टर15को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जबकि लेबल-फ्री साबुत सेल परखबायोसेंसर का उपयोग करते हैं जो लिगांड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित सेलुलर परिवर्तनों को मात्रात्मक आउटपुट में अनुवाद करते हैं, जैसे इलेक्ट्रिकल या ऑप्टिकल सिग्नल16। विशेष रूप से, सर्वोत्कृष्ट GPCR--बातचीत में गिरफ्तार कार्यात्मक परख17के प्रदर्शनों की सूची में एक आकर्षक उपकरण के रूप में भर्ती परख में गिरफ्तार फैशन । टैंगो प्रणाली, पहले बार्नेया एट अल द्वारा विकसित केवल एक दशक पहले, तीन एक्सोजेनस आनुवंशिक तत्वों की शुरूआत शामिल है: एक प्रोटीन फ्यूजन जिसमें तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रोटीज़ (TEVp), एक टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेट (टीटीए) के साथ 2 को शामिल किया गया है जो तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रो के माध्यम से जीपीसीआर के लिए सीमित है tease दरार साइट (TEVcs) और सी से पहले है V2 vasopressin रिसेप्टर (V2 पूंछ) के टर्मिनस से एक अनुक्रम के लिए भर्ती में गिरफ्तारी को बढ़ावा देने के लिए, और एक रिपोर्टर लूसिफेरेज़ जीन जिसका प्रतिलेखन द्वारा शुरू हो रहा है टीटीए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर न्यूक्लियस में ट्रांसलोकेशन, जो 2 भर्ती में 2 -arrestining(चित्रा 1)18के बाद झिल्ली प्रस्तोता से मुक्त है । जीपीसीआर एक्टिवेशन और 2 भर्ती में गिरफ्तार करने की मात्रात्मक रीडिंग बाद में ल्यूमिनेसेंस के लिए पढ़कर निर्धारित की जा सकती है। एक उल्लेखनीय अंतर यह है कि जबकि रिसेप्टर तस्करी और लेबल मुक्त पूरे सेल विधियां अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैं, टैंगो के कई फायदे हैं, जिनमें चयनात्मक रीड-आउट शामिल हैं जो सिग्नल एकीकरण के कारण लक्ष्य रिसेप्टर और संवेदनशीलता के लिए विशिष्ट है, जो इसे बड़े पैमाने पर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त उम्मीदवार बनाते हैं18।
इन रणनीतिक विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, क्रोज़े एट अल ने प्रेस्टो-टैंगो (ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट-टैंगो के माध्यम से समानांतर रिसेप्टर-ओम एक्सप्रेशन और स्क्रीनिंग) विकसित किया, जो एक उच्च-थ्रूपुट ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म है जो समानांतर और एक साथतरीकेसे ड्रगेबल जीपीसीआर-ओम को प्रोफाइल करने के लिए टैंगो दृष्टिकोण का उपयोग करता है। लगभग सभी GPCRs के लिए 2 की "संकीर्ण" भर्ती का शोषण, PRESTO-टैंगो सेल आधारित कार्यात्मक परख के मामले में अपनी तरह का पहला है, लगभग सभी गैर घ्राण GPCRs पर छोटे अणु यौगिकों की तेजी से "पहले दौर" स्क्रीनिंग सक्षम करने, अनाथ सहित, जी प्रोटीन उपपरिवार युग्मन से स्वतंत्र ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के सरगम के सबसे बड़े और सबसे बहुमुखी जीन सुपरफैमिली और मध्यस्थों के रूप में, जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) दवा उद्योग के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। एर्गो, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परखों का डिजाइन, कार्यान्वयन और अनुकूलन महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे दवा की खोज के लिए रिमोट-कंट्रोल टूल का प्रतिनिधित्व करते हैं और जीपीसीआर फार्माकोलॉजी और परिणामों में हेरफेर के लिए। अतीत में, जी-प्रोटीन पर निर्भर परख अनुसंधान के इस क्षेत्र को टाइप करता है, लिगामेंट-प्रेरित घटनाओं का पता लगाता है और माध्यमिक दूतों की पीढ़ी की मात्रा निर्धारित करता है। हालांकि, कार्यात्मक चयनात्मकता के आगमन के बाद से, साथ ही कई अन्य जी प्रोटीन-स्वतंत्र रास्तों और जी-प्रोटीन पर निर्भर परखों से जुड़ी सीमाओं के बारे में बढ़ी हुई जागरूकता, वैकल्पिक के निर्माण की दिशा में अधिक धक्का है जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परख ती है। इस प्रयास की दिशा में, हम ऐसे ही एक संसाधन के आवेदन का वर्णन करते हैं, प्रेस्टो-टैंगो प्लेटफॉर्म, एक ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर-आधारित प्रणाली जो मानव जीपीसीआर-ओम के समानांतर और एक साथ पूछताछ को सक्षम बनाती है, एक उपलब्धि जो पहले माना जाता था तकनीकी और आर्थिक रूप से अव्यवहार्य । जी-प्रोटीन स्वतंत्र के आधार पर 2 भर्ती परख, जीपीसीआरएस में 2-मध्यस्थता तस्करी और सिग्नलिंग में 2-गिरफ्तारी की सार्वभौमिकता प्रेस्टो-टैंगो को लगभग 300 गैर-घ्राण मानव GPCRs का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण बनाती है, जिसमें लगभग 100 शामिल हैं अनाथ रिसेप्टर्स। PRESTO-टैंगो की संवेदनशीलता और मजबूती यह यौगिक पुस्तकालयों का उपयोग कर प्राथमिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं, ज्ञात दवाओं के लिए नए GPCR लक्ष्यों को उजागर करने के लिए या अनाथ रिसेप्टर्स के लिए नए ligands की खोज करने के लिए कार्यरत हैं ।

यहां प्रस्तुत प्रेस्टो-टैंगो प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 168 गैर-घ्राण जीपीसीआर लक्ष्यों के खिलाफ एक क्रोमेफिन ग्रेन्यूल (सीजी) अर्क की जांच की गई थी, जिसमें अधिकांश अनाथ रिसेप्टर्स थे। नेकहा कि निकाले...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

यह देखते हुए कि जीपीसीआरएस आकर्षक नशीले लक्ष्य हैं, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग इस प्रकार सीसा यौगिकों की पहचान और अअनाथअध्ययन के लिए अपरिहार्य है । इन प्रयासों की दिशा में, हम PRESTO-टैंगो का वर्णन करते हैं, जो एक ओपन-सोर्स संसाधन मंच है जो TEV आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग करके लगभग 300 जीपीसीआर में क्षणिक-arrestin2 भर्ती की एक साथ प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किया जाता है।

PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

प्रेग्नेंसी-टैंगो प्लेटफॉर्म को मानव जीनोम में सभी गैर-घ्राण जीपीसीआर के समानांतर और एक साथ पूछताछ करने के लिए तैयार किया गया था, जिसमें 2 भर्ती में लिगांड-प्रेरित बीटा-गिरफ्तारी को प्रोफाइल करने के लिए उस अनाथ लक्ष्य को शामिल किया गया था । प्रेग्नेंसी-टैंगो प्लेटफॉर्म एक समानांतर दृष्टिकोण में पूरे जीपीसीआर जीनोम की प्रोफाइलिंग के लिए एकमात्र ओपन सोर्स रिसोर्स है, जो भर्ती परख में जी प्रोटीन इंडिपेंडेंट बीटा-गिरफ़ेसिन का उपयोग कर रहा है । प्रोसेसर का प्रदर्शन Genevieve Laroche मेरी प्रयोगशाला में एक अनुसंधान सहयोगी होगा, और Manel Zighal, मेरी प्रयोगशाला में एक पीएचडी उंमीदवार ।प्रक्रिया शुरू करने से पहले 384 ऑप्टिकल बॉटम प्लेटों की उपयुक्त प्रायोगिक संख्या के प्रत्येक कुएं में 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पॉली-एल-लिसिन समाधान के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेटों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट से दो घंटे तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अतिरिक्त पॉली-एल-लिसिन को हटाने के लिए सिंक पर प्लेटों को झटका दें और प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल सीडिंग के लिए आवश्यक प्लेटों को इनक्यूबेट करें और बाकी प्लेटों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर रखें ।प्राथमिक स्क्रीनिंग के लिए एचटीएल कोशिकाओं को बीज करने के लिए, प्रति डिश 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के छह मिलीलीटर के साथ संस्कृतियों के इलाज से पहले पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ धीरे-धीरे 150 मिलीमीटर सेल संस्कृतियों को कुल्ला। जब कोशिकाओं ने 50 मिलीलीटर शंकु नली में सेल निलंबन को अलग कर दिया है जिसमें डीएमईएम की बराबर मात्रा होती है। और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।डीएमईएम एकाग्रता के मिलीलीटर प्रति पांचवीं कोशिकाओं के लिए 2.2 गुना 10 पर गोली को फिर से निलंबित करें और एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान को हटाने के लिए सिंक पर प्लेटों को झटका दें। प्लेटों को सुखाने के लिए टैप करें और प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं के 45 माइक्रोलीटर बीज करें। इसके बाद प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 45% कार्बन डाई ऑक्साइड को रात भर रखें।ट्रांसफेक्शन के लिए 384 अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट तैयार करने के लिए प्रत्येक प्लाज्मिड मानार्थ डीएनए के प्रति मिलीलीटर 50 नैनोग्राम वितरित करने के लिए जीपीआरसी टैंगो में ब्याज का निर्माण 0.1X Tris-EDTA प्रति अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में। एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग मैन्युअल रूप से डीएनए समाधान के 10 माइक्रोलीटर का उपयोग 96 वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से प्रत्येक स्थिति के लिए चौगुनी में एक 384 अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें जैसा कि सचित्र है। इसके बाद, डीएनए स्रोत प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.313 मोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 40 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें और प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री को धीरे-धीरे मिलाएं।कोमल मिश्रण के साथ 384 अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2x HEPES बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक मिनट के बाद 384 अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट से डीएनए ट्रांसफैक्शन मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर को वरीयता प्राप्त एचटीएलए कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रातोंरात इनक्यूबेट करें। अगले दिन संक्रमित कोशिका माध्यम को कम करें और धीरे-धीरे कोशिकाओं को सीधे छूने के लिए ध्यान न देने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से भूखे मध्यम के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट लौटाने से पहले, बारी-बारी पंक्तियों में तीन गुना एकाग्रता पर ब्याज के यौगिक के 20 माइक्रोलीटर में यौगिक के बिना बारी पंक्तियों के लिए वाहन बफर के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। उत्तेजना के बाद 16 से 24 घंटे संक्रमित कोशिका माध्यम को कम करते हैं और प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर पांच से 20 मिनट के तापमान पर पांच से 20 मिनट इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक कुएं में 20 माइक्रोलीटर ताजा तैयार चमक रिएजेंट जोड़ते हैं। फिर एक माइक्रो प्लेट ल्यूमिनेसेंस काउंटर पर प्लेटों को एक सेकंड प्रति अच्छी तरह से एकीकरण समय के साथ पढ़ें।एक माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए, उपसंस्कृति १०० मिलीमीटर व्यंजनों में १०० मिलीमीटर व्यंजनों में 10 गुना छह कोशिकाओं को कुल कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए प्रति डिश के 11 मिलीमीटर में कुल सेल घनत्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर । अगले दिन, 10 माइक्रोग्राम जीपीसीआर मानार्थ डीएनए के साथ Tris-EDTA कैल्शियम क्लोराइड समाधान के ५०० माइक्रोलीटर के साथ भंवर के साथ HEPES बफर के ५०० माइक्रोलीटर के अलावा के बाद । जोरदार झटकों के बाद, कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें और तुरंत कोशिकाओं पर समाधान ड्रॉप वार का एक मिलीलीटर जोड़ें।धीरे-धीरे चट्टान को समान रूप से तेज़ वितरित करने के लिए और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रखें। अगले दिन, फ्लोरोसेंट सेल इमेजर के तहत ट्रांसफेक्शन दक्षता की जांच करें। 50% से अधिक लेनदेन आदर्श हैं।धीरे से 0.05% ट्राइप्सिन EDTA के तीन मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को अलग करने से पहले छंद समाधान के साथ संक्रमित कोशिकाओं कुल्ला। अपकेंद्रित्र द्वारा अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें और गोली को चार गुना 10 पर फिर से निलंबित करें ताकि भूखे मध्यम एकाग्रता के प्रति मिलीलीटर पांचवीं कोशिकाओं को किया जा सके। फिर एक पॉली-एल-lysine कोडित ३८४ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के ४५ माइक्रोलीटर बीज और कम से कम चार घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली जगह है ।एक आधा लॉग खुराक तैयार करने के लिए-वक्र प्रतिक्रिया प्लेट HBSS के २७० माइक्रोलीटर सभी के लिए HEPES और एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक जोड़ें, लेकिन एक ९६ अच्छी तरह से थाली की अंतिम पंक्ति और पंक्ति H.के कुओं के लिए प्रत्येक उच्च और कम दवा समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ने के मिश्रण के साथ पंक्ति जी के इसी कुएं में पंक्ति एच के इसी कुएं में समाधान हस्तांतरण और क्रमिक रूप से दवा यौगिकों को दूर करने के लिए जारी रखने के लिए पहुंच गया है। एक संदर्भ के रूप में योजनाबद्ध का उपयोग करना, ९६ अच्छी तरह से थाली के जी के माध्यम से पंक्तियों एक से कम कॉलम कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोलीटर मिश्रण और उच्च स्तंभ के 20 माइक्रोलीटर ९६ अच्छी तरह से थाली के एच के माध्यम से कुओं बी को कमजोर करने के लिए पहले बैठे ३८४ अच्छी तरह से थाली । फिर थाली को न्यूनतम 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।16 से 24 घंटे उत्तेजना के बाद संक्रमित कोशिका माध्यम decant और एक माइक्रो प्लेट चिकनाई काउंटर पर प्लेटों को पढ़ने से पहले एक माइक्रो प्लेट ल्यूमिनेसेंस काउंटर पर प्लेटों को पढ़ने से पहले एक पांच से 20 मिनट इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से चमक अभिवाक के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, प्राथमिक स्क्रीनिंग में पूछताछ की गई १६८ जीपीसीआर में से केवल डोपामाइन रिसेप्टर डी 3 और ऑप्सिन 5 संभावित सक्रिय लक्ष्यों के रूप में दावेदार थे । डोपामाइन रिसेप्टर डी 3 ने 4.7 के एक महत्वपूर्ण लॉग2 गुना परिवर्तन का उत्पादन किया जबकि ऑप्सिन 5 ने 2.39 की थोड़ी कम प्रतिक्रिया का उत्पादन किया।तुलना करके, डोपामाइन रिसेप्टर डी 2, प्राथमिक स्क्रीन के लिए सकारात्मक नियंत्रण ने 4.58 के लॉग2 गुना परिवर्तन का उत्पादन किया। माध्यमिक स्क्रीनिंग से उन प्रतिक्रिया घटता का प्रदर्शन किया है कि क्रोमेटिन कणिका निकालने आधे अधिकतम प्रभावी एकाग्रता मूल्यों में इसी तरह के संकेत खिड़कियों का उत्पादन करने के लिए क्विंपीरो डोपामाइन रिसेप्टर D3 पर एक सक्रिय हिट के रूप में अपनी वैधता की पुष्टि । नकारात्मक नियंत्रण के समान एक फ्लैट खुराक-वक्र ऑप्सिन 5 के लिए उत्पादित किया गया था, हालांकि क्रोमेटिन कणिका निकालने के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में इस रिसेप्टर को बाहर सत्तारूढ़ किया गया था। प्रेग्नेंसी-टैंगो को विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है क्योंकि सेल वितरण, ट्रांसफेक्शन दक्षता और धारावाहिक दवा कमजोर पड़ने में वेरिबिलिटी के परिणामस्वरूप जटिल त्रुटि हो सकती है, जो डेटा की सटीकता को प्रभावित कर सकती है।रेडियोलिगांग-बाध्यकारी दृष्टिकोण, बायोल्यूमिनेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण और चक्रीय एएमपी कैल्शियम और आंतरिककरण कार्यात्मक परख जैसे ऑर्थोगोनल तरीकों का उपयोग लिगांड रिसेप्टर इंटरैक्शन की पुष्टि और विशेषता के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

कार्बोहाइड्रेट अपमानजनक एंजाइमों की उच्च throughput स्क्रीनिंग उपन्यास अघुलनशील chromogenic सब्सट्रेट परख किट का उपयोग

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन ई कोलाई में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

एक सेल आधारित एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का उपयोग कर फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए स्क्रीनिंग

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...